專利名稱：一種人TSH受體全長cDNA的細胞株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞抹，尤其涉及一種人TSH受體全長cDNA的細胞 林及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
促曱狀腺激素(thyrotropin or thyrotrophin)又稱曱狀腺刺激激素 (thyroid—stimulating hormone, TSH)， 它是由垂體前葉分)必的一種重要 的糖蛋白激素，通過其特異的受體(即TSH受體)發(fā)揮促曱狀腺的作用。 TSH受體是一種重要的自身抗原，其相應的自身抗體在自身免疫性甲狀腺 疾病的發(fā)生過程中起著重要作用。
研究發(fā)現(xiàn)，TRAb具有異質(zhì)性有些TRAb和TSHR結(jié)合后發(fā)揮類似TSH 的作用(刺激cAMP產(chǎn)生、攝碘及曱狀腺球蛋白合成)，稱為曱狀腺刺激性 抗體(thyroid stimulating antibodies, TSAb);有些TRAb同TSH受體 結(jié)合后抑制TSH介導的受體活化，稱為甲狀腺刺激阻斷性抗體(thyroid stimulation-blocking antibody, TBAb);還有一些TRAb同TSH受體結(jié) 合后既無刺激作用也無抑制作用，稱為中性TSH受體抗體(neutral TSH receptor antibodies)。 一般i人為，^口果TSH受體^元體以TSAb為主，臨床上表現(xiàn)為Graves?。蝗绻訲SBAb為主，臨床上則表現(xiàn)為原發(fā)性曱狀 腺功能減退癥。
目前臨床常用的方法為Rees Smith等建立的體外竟爭受體法，這種 方法是以待測血清與1251標記的TSH竟爭結(jié)合TSH受體制劑，根據(jù)竟爭的 強弱判斷待測血清TSH受體抗體水平。用這種方法測定的TSH受體抗體也 稱為TSH結(jié)合抑制免疫J求蛋白(TSH binding inhibiting immunoglobulins: TBII)。 TBII的主要缺點是只能反映抗體與TSH竟爭TSH受體的能力，不 能區(qū)分抗體的功能是刺激性還是阻斷性。
隨著人TSH受體的克隆，Vassart等將人TSH受體cDNA克隆到pSVL 真核表達載體中，并將此載體轉(zhuǎn)染到CHO細胞并篩選合適的穩(wěn)定表達細 胞，得到適于TSAb和TSBAb測定的細胞抹，稱為JP26細胞。該JP26細 胞價格貴，不易獲得，表達純度不高，缺乏高效穩(wěn)定表達。但在國內(nèi)，有 文獻提及原核表達載體的構(gòu)建，而涉及TSHR體外真核表達系統(tǒng)的研究較 少，僅有一篇報道乂AA曱狀腺組織中提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得人TSHR 膜外區(qū)cDNA,構(gòu)建了 TSHR膜外區(qū)真核表達載體并在中國倉鼠卵巢細胞表 達hTSHR膜外區(qū)蛋白分子(非全長cDNA)。由于國內(nèi)缺乏高效穩(wěn)定表ii^ TSH受體cDNA的細胞^朱，致使TSAb和TSBAb的測定難以開展，極大地阻 礙了AITD的診斷、治療和研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于
(1)提供一種人TSH受體全長cDNA的細胞4朱；
2 )提供一種人TSH受體全長cDNA細胞林的構(gòu)建方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、 一種人TSH受體全長cDNA的細胞4朱，它由下列方法制得 (1)用RT-PCR技術(shù)擴增hTSHR基因編碼區(qū)的全部序列； (2 )將步驟(1 )得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T載體，提取質(zhì)粒DNA，以I / I雙酶切鑒定；(3 )將步驟(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pc應3. 1質(zhì)粒； (4 )將重組的pcDNA3. 1-hTSHR轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5a,質(zhì)粒抽提純化，質(zhì)粒鑒定；(5 ) pcDNA3. 1-hTSHR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染CH0細胞。 其中還包括步驟(6 ):用G418篩選步驟(5 )得到的表達林。 步驟(1) PCR中所用的引物如下上游引物為:5'-cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'方框內(nèi)為I酶切位點，大寫部分為hTSHR cDNA特異性序列，下游引物為5'-cc|t eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3' 方框內(nèi)為I酶切位點，大寫部分為與hTSHR cDNA互補的序列。 2、 一種人TSH受體全長cDNA的細胞4朱構(gòu)建方法，包括以下步驟 (1 )用RT-PCR技術(shù)擴增hTSHR基因編碼區(qū)的全部序列； (2 )將步驟(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T載體，提取質(zhì)粒DNA，以J/w II雙酶切鑒定；(3 )將步驟(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3. 1質(zhì)粒； (4 )將重組的pcDNA3. 1-hTSHR轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5ot，質(zhì)粒抽提純化，質(zhì)粒鑒定；(5 ) pc廳3. 1-hTSHR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染CH0細胞。 其中還包括步驟(6 ):用G418篩選步驟(5 )得到的表達株, 步驟(1) PCR中所用的引物如下上游引物為5'—cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA—3方框內(nèi)為I酶切位點，大寫部分為hTSHR cDNA特異性序列，下游引物為5'-cclt eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3'方框內(nèi)為J&I酶切位點，大寫部分為與hTSHR cDNA互補的序列。依照上述技術(shù)方案本發(fā)明的具體實施方法是以人曱狀腺組織cDNA為才莫板，以hTSHR基因特異的引物進行PCR擴 增，得到目的基因片段特異性條帶，目的片斷與pGEM-T載體連接后采用 藍白斑法篩選陽性克隆，陽性克隆擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，以^/wI和I作雙酶切，經(jīng)電泳、測序鑒定得到目的基因。將經(jīng)測序證實的Z/w I 和I雙酶切片段連接入質(zhì)粒pcDNA3. 1的A>71 /i7 a I酶切位點之間， 構(gòu)建成pcDNA3. 1-hTSHR重組質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)化細菌篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)， 抽4^t沖立DNA,再以《p/ I和1&2 I作雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳可見2300bp左 右的條帶，說明目的基因已克隆入pcDNA3. 1。再對質(zhì)粒DNA進行測序， 測定結(jié)果與基因庫登錄序列進行比對分析。測序結(jié)果顯示，克隆入 pcDNA3. 1的目的片段與hTSHR基因的編碼區(qū)序列完全一致，進一步證明 pcDNA3. 1-hTSHR真核表達載體已構(gòu)建成功。將pcDNA3. 1-hTSHR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO細胞，進行表達，用G418篩選陽性表達抹，破碎細胞，用Western 法對細胞表達蛋白進行鑒定，證明細胞可以表達hTSHR。本發(fā)明所公開一種人TSH受體全長cDNA的細胞林及其構(gòu)建方法， 其優(yōu)點表現(xiàn)在將擴增好的hTSHRcDNA克隆入pGEM-T載體，酶切鑒定確 定是目的基因片段后再將其克隆到真核細胞表達載體pcDNA3. 1中，并再 次進行雙酶切鑒定以保證基因片段的正確性。從而完成真核表達載體的構(gòu) 建。通過脂質(zhì)體介導，用重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 - hTSHR轉(zhuǎn)染CH0細胞，以 G418篩選穩(wěn)定表達抹，經(jīng)Western印記法鑒定出被轉(zhuǎn)染細胞成功表達 hTSHR。 /人而得到高效穩(wěn)定表達hTSHR的細胞4朱。為TSAb和TSBAb的測定 奠定了勤出，也為進一步研究人TSH受體的結(jié)構(gòu)和功能打下了勤出。


圖1: RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(M示分子量標準；泳道1和2為RT-PCR 產(chǎn)物)。圖2: pcDNA3. 1-hTSHR重組質(zhì)粒DM的J/m II雙酶切結(jié)果。 泳道l: DNA分子量標準，泳道2:抽提的質(zhì)粒DNA,泳道3:抽提的質(zhì)粒 DNA經(jīng)《p/7 I/J ^ I雙酶切產(chǎn)物，泳道4: RT-PCR產(chǎn)物。圖3: G418篩選后的陽性細月包^K。圖4:穩(wěn)定表達hTSHR基因的細胞抹的Western blot結(jié)果。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。 實施例1一、材料與方法 (-)材料 1.質(zhì)粒(1) pc陽3. 1質(zhì)粒(Invitrogen公司產(chǎn)品)(2) pGEM-T載體(Promega 7>司產(chǎn)品)2. 菌林(l)大腸桿菌DH5 a (華舜生物工程有限7>司產(chǎn)品) (2)CH0細胞(中國科學院細胞所)3. 試劑盒(1) RNA抽提試劑(Promega />司產(chǎn)品)(2) 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 7>司產(chǎn)品) D)質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(Qiagen 7>司產(chǎn)品)(4) PCR純化和膠回收試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)(5) 質(zhì)粒小抽試劑盒(Qiagen 乂>司產(chǎn)品)(6) ECL+plusTM Western blotting systemi式劑盒(Amersham7^司)4. cDNA文庫及引物:沒計軟件(1) GenBank登陸號:固—001729。(2) Primer 5. 0軟件5. 酶(1) Pf u DNA聚合酶(Promega 7>司產(chǎn)品)(2) T4 DNA連接酶(Promega公司產(chǎn)品)(3) 限制性內(nèi)切酶入i^/ I和I (New England Biolabs公司產(chǎn)品)(4) 胰蛋白酶(Gibco公司產(chǎn)品)(5) RNase H6. 引物(1) 01 igo- (dT)5(2) PCR上游引物(上海生物工程公司合成)(3) PCR下游引物(上海生物工程公司合成)7. 器材(1) 剪刀(2) 鑷子(3) 勻漿管(4) 錫紙(5) 研缽(6) Eppendorf管(7) 離心管 (S)吸管(9)細胞培養(yǎng)瓶(11) 6孔板(12) 1 Ocm盤(13) 96孔盤(14) 牛皮紙(15) 克隆環(huán)(16) 刮刀8. 試劑(l)二乙基焦碳酸酯(diethyl pyrocarnonate, DEPC)水吸出DEPClml 放在1000ml雙蒸水中配成1%。DEPC水，放在lOOOml容量瓶中靜置4小時備用。(2) 75%乙醇(DEPC水配制)(3) 10 x PCR 緩沖液(500腿ol/L KC1 ;15mmol/L MgCl2 ; 100mmol/L Tris HC1; pH 8. 3)(4) 瓊脂糖Sigma公司產(chǎn)品(5) 10x連接緩沖液(6) LB液體培養(yǎng)基(在100ml蒸餾水中加入胰蛋白胨lg， NaCl lg,酵母 提取物O. 5g,用NaOH調(diào)節(jié)pH值7. 2-7. 6，高壓滅菌備用。)(7) LB固體培養(yǎng)基瓊脂(在100ml LB液體培養(yǎng)基加入l. 5-2 g瓊脂糖醋， 加熱溶化，高壓滅菌備用。)(8) 氨芐青霉素(上海生物工程公司產(chǎn)品)(9) 10xT4緩沖液(10) CaCl2(11) 10%FBS(12) F12培養(yǎng)基(l加-Hanks液稱取KC1 0. 4g; KH2P04 0. 06g; NaCl 8. Og; NaHC03 0. 35g;Na2HP04 . 12H20 0. 132g; D—葡萄糖1. Og;酚紅(0. 1% ) 1ml,加ddH20至1000ml,高壓滅菌IO分鐘。 (載EM(15) Lipofectamine 2000 : Invitrogen公司產(chǎn)品(16) 6 x Lysis緩沖液(17) TBST ( TBS+0. 05%Tween20 )(18) SDS-PAGE① 12。/。SDS-PAGE電泳分離月交30%丙烯酰胺4ml; Tris-HCl 5ml; 10°MPS lOOul; 10%SDS lOOul; TEMED 4|al;去離子水3. 3ml混 合。② 5。/。 SDS-PAGE電泳積層月交30%丙烯酰胺0. 85ml; Tris-HCl 0. 625ml; 10%APS 50ul; 10%SDS 50ul; TEMED 5|il;去離子水 混合。③ 5xSDS-PAGE上樣纟爰沖液0. 125mol/l Tris-HC1; 20%甘油, 4%SDS; 0. 2 mol/L DTT; 0. 02%溴酚藍。④ 凝膠電泳緩沖液Tris 3. 03g;甘油14. 4g; SDS1. 0;力。ddH20 至1000ml ) SDS-PAGE染色液90ml曱醇水(1: 1， V/V); 10ml冰乙酸； 25g考馬斯亮藍R250。 ,⑥SDS-PAGE脫色液90ml曱醇水(1: 1, V/V); 10ml水乙酸。(19) 內(nèi)參Actin —抗瀏辣根過氧化酶束聯(lián)的驢抗兔IgG ( Santa公司產(chǎn)品)9. Marker(1) DNA DL2000 marker (大連Takara/>司產(chǎn)品)(2) 蛋白質(zhì)Marker (上海生物工程公司產(chǎn)品)10. 主務f義器(1) 倒置顯微鏡(Olympus公司產(chǎn)品)(2) 紫外分光光度儀(3) C02細胞培養(yǎng)箱(Hereus公司產(chǎn)品)(4) 臺式離心才幾(Beckman 7>司產(chǎn)品)(5) Perkin-Elmer-Cetus 9700熱循環(huán)4義(6) j氐溫離心才幾(S i gma 7>司產(chǎn)品)(6) SDS-聚丙烯胺凝膠垂直電泳裝置(Bio-Rad公司產(chǎn)品)(7) 電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司產(chǎn)品)(9) SmartspecTM3000分光光度計(Bio-Rad公司產(chǎn)品)(10) 超凈工作臺(上海醫(yī)療器械廠產(chǎn)品)(11) FR-200紫外分析掃描裝置(上海復日科技有限公司產(chǎn)品) (1》微量加樣器(E卯endorf公司產(chǎn)品)妙電泳儀(上海復日科技有限公司產(chǎn)品)(14) TN2-C恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗i殳備廠)(15) 超聲細胞破^f義(16) 恒溢水浴箱ll.人曱狀腺組織(取自外科切除的手術(shù)標本) 仁)方法1.曱狀腺組織總RNA抽提(l)實驗器具的處理與準備 ①塑料制品(包括槍頭、Eppendorf管、勻漿管等)先將DEPC水 從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭 需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前 將槍頭等》t^吸頭臺，再高壓一次(EP管)②玻璃制品泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1。/。。DEPC水過夜，再烤干) ③勻漿器(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，再高壓(不需要泡DEPC)(2) 人曱狀腺組織取自外科切除的手術(shù)標本，術(shù)中取少量曱狀腺組織(約O. 5g)，立即置液氮中。(3) 將組織直接;^^研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟， 再加少量液氮，再研磨，如此三次，力口入5ml Trizol液，轉(zhuǎn)入離心 管。樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10°/。。(4) 研磨液室溫放置5分鐘，使其充分裂解，12，000rpm,離心5分鐘， 棄沉淀。然后加入l. Oml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心 管15秒(禁用漩渦振蕩器)，混勻后室溫放置15分鐘。4°C, 12，000rpm，離心15分鐘。(5) 吸取上層水相于一新的離心管，加入2. 5ml異丙醇混勻，室溫放置 IO分鐘。4°C， 12，000rpm，離心10分鐘。(6) 棄去上清液，加入5ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。 4°C, 8000g，離心5分鐘。(7) 盡量棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過 分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于DEPC子水中，必要時 可55。C-6(TC水溶解IO分鐘。(8) 紫外分光光度儀測定RNA的A26。和A28。值。 2. cDNA第一鏈的合成。(l)在0. 5mlEppendorf管中，加入甲狀腺組織總RNA 2pg，補充適量的DEPC水使總體積達11 m 1 。在管中加10 ju M01 igo- (dT) 15引物 l|Lll，輕輕混勻、離心。 U)70。C加熱10min，立即將Eppendorf管插入水浴中至少lmin。然后 加入下列試劑的混合物10 x PCR緩沖液2 ju 1; 25mMMgCl2 2 ja 1 ; lOmM dNTP 1 ju 1 ; 0. 1M DTT 2 ]u 1 。輕輕混勻，離心。42。C孵育 2-5min。(3) 力。入Superscript II1 iu 1 ,在42。C水浴中孵育50min。(4) 于7(TC加熱15min以終止反應。(5) 將管插入水中，加入RNase H lyl ， 37。C孵育20min，降解殘留 的RNA。3. PCR. ( PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1)(l)才艮據(jù)GenBank中hTSHR基因的cDNA序列(GenBank登陸號 NM—001729 ),選用Primer 5. 0庫欠件i殳計上下游引物，并分別在上 下游引物中嵌入限制性內(nèi)切酶和I的酶切位點。GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'上游引物為5'-cta aga ggt aCC(方框內(nèi)為I酶切位點，大寫部分為hTSHR cDNA特異性序列)下游引物為5'-cc|t eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3' (方框內(nèi)為J&I酶切位點，大寫部分為與hTSHR cDNA互補的序 列)。U)以人曱狀腺組織cDNA第一鏈為模板進行聚合SI^反應(PCR)，擴 增片斷長度為2337 bp。于Perkin-Elmer-Cetus 9700熱循環(huán)4義上 進行PCR^Jl，反應體系為:總體積50pl，含linl人曱狀腺組織cDNA， 10 x PCR緩沖液5|nl， 10|imol/l上下游引物各1^1， 2. 5隨o1/1 dNTP 4nl， Pfu DNA聚合酶0. 5jil。 PCR反應采用Touch-down法， PCR條件為95。C預變性5分鐘，94。C變性30秒，退火溫度在起始 的IO個循環(huán)中為60°C ~ 55°C,每次遞減0. 5°C,退火時間為45秒， 72。C延伸4分鐘；在以后的30個循環(huán)中，退火溫度固定為55°C， 退火時間為45秒，72。C延伸4分鐘；最后于72。C延伸10分鐘，于 4。C中保存。(3)擴增結(jié)束后，取反應液5 10iul進行瓊脂糖凝月交電泳，以DL 2000 Marker為對照，確認反應產(chǎn)物。 4.人TSH受體基因PCR產(chǎn)物的回收與純化(1) 目的DNAPCR產(chǎn)物于l. 5%瓊脂糖凝膠電泳，100mV, 20分鐘，分離 2337 bp的人TSH受體全長cDNA片,殳。(2) 在紫外燈下用潔凈鋒利的刀片割膠回》|認TSH受體全長cDNA片段。(3) 按凝膠塊大小溶膠液=1: 3 (w/v)的比例加入適量的溶膠液Sl,置 50。C恒循環(huán)水浴加熱，每2分鐘顛倒即管一次混勻，至凝膠充分溶 解。(4) 按凝膠塊大小異丙醇=1: 3 (w/v)的比例加入適量異丙醇，顛倒混 勻。(5) 將混合物移入吸附柱，12000 rpm,離心30秒，倒掉收集管中的液 體，將吸附柱放進同一個收集管中。(6) 在吸附柱中再加500 pl的Wl (洗滌液)，離心15秒，倒掉收集管中 的液體，將吸附柱放進同一個收集管中。(7) 在吸附柱中再加500 pl的Wl (洗滌液)，靜置l分鐘后，離心15秒， 倒掉收集管中的液體，將吸附柱放進同一個收集管中，再離心l分 鐘。(8) 將吸附柱放入一個1. 5 ml的清潔無菌的Eppendorf管中，在吸附膜 中央加入30jalTE (PH8. 0)，離心1分鐘，收集洗脫液。(9) 使用分光光度計測定0D26。值，瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小。 通過以上步驟得到hTSHR cDNA。5. 將hTSHR cDNA克隆入pGEM-T載體(1) 連接在0. 5ml反應管中加入pGEM-T 50ng;純化的人TSH受體基 因PCR產(chǎn)物10-50ng; T4 DNA連接酶3weiss units; 10x連々妾緩 沖液l|il。補(1犯20至總體積為lOju 1, 4。C過夜。(2) 轉(zhuǎn)化① 將50 ja 1感受態(tài)大腸桿菌DH5a于冰浴上解凍。② 將10 ia 1連接產(chǎn)物與感受態(tài)大腸桿菌DH5a混勻，冰浴30分鐘。③ 42。C熱休克90秒鐘，立即冰浴3-5分鐘。④ 加入400 y 1預冷的LB液體培養(yǎng)基，37。C輕搖培養(yǎng)45-60分鐘。⑤ 將轉(zhuǎn)化后的DH5a涂布于含lOOmg/1氨節(jié)青霉素及X-Gal、 IPTG 的LB平板上，用藍白斑法篩選陽性克隆。(3) 37。C培養(yǎng)16h后，挑取白色菌落，擴大培養(yǎng)。6. 提取質(zhì)粒DNA。(按照Qiagen公司說明書)(l)挑取單菌落，接種于3 ml的LB培養(yǎng)液中(含100mg/l氨千青霉素及 X-Gal、 IPTG) 37°C， 200 rpm,振搖過夜。(2)將培養(yǎng)好的菌液分于1. 5 ml的無菌Eppendorf管中，4000 rpm離心5分鐘，徹底棄去上清，收獲細菌。 ("在細菌沉淀中加入懸浮液P1 (含RNaseA) 250 |al，旋渦震蕩至徹底 懸浮。(4) 再加入250 jul堿裂解液P2，立即溫和顛倒離心管5-10次，混勻， 室溫靜置4分鐘。(5) 加入35Giu 1中和液P3，立即溫和顛倒，混勻5-IO次。(6) 4°C， 13000 rpm離心10分鐘，為盡量避免蛋白質(zhì)污染，將上清小心 移入一新Eppendorf管，同樣條件再次離心5分鐘。(力將上清移入吸附柱，離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放 進同一個收集管中(瞬時離心速度10000rpm，以下各步均同)。(S)在吸附柱中力口500ji 1的B1 (結(jié)合緩沖液)，離心15秒，倒掉收集管 中的液體，將吸附柱放進同一個收集管中。(9) 在吸附柱中加500ji 1的W1 (洗滌液)，離心15秒，倒掉收集管中的 液體，將吸附柱放進同一個收集管中。(10) 在吸附柱中再加500ju 1的W1 (洗滌液)，離心15秒，倒掉收集管中 的液體，將吸附柱放進同一個收集管中，再離心1分鐘。(11) 將吸附柱;^^一個1. 5 ml的清潔無菌的E卯endorf管中，在吸附膜 中央加入50 y 1 TE(PH8. 0) ，37。C水浴2分鐘，離心l分鐘，管底 即得提取的質(zhì)粒DNA溶液。7.以iT/7/ I /Z^ I雙酶切鑒定。將酶切鑒定的質(zhì)粒作DNA序列測定(上海 博亞生物技術(shù)有限/>司)，并將測序結(jié)果與GenBank中的hTSHR cDNA序列及氨基酸序列進行比對。通過以上步驟得到hTSHR cDNA。8. 將hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3. 1質(zhì)粒(pcDNA3. l-hTSHR重組質(zhì)斗立 DNA的1/7/7 I /Z^ I雙酶切結(jié)果見圖2 )(l)將測序正確的pGEM-T-hTSHR重組質(zhì)粒用I和I雙酶切，月交回收hTSHR cDNA片#史。 UM吏用限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切pcDNA3. 1質(zhì)粒，月交回收載體片段。(3)冰浴中按順序加入ddH20 7ial， 10 x T4緩沖液2 ju 1 ，載體片段O. 1 ILig , 250bp BTC cDNA片#爻0. 4 nig, T4 DNA連4妾酶1 ja 1 ( 2U ), 總體積20]111。彈勻E卯endorf管，短暫離心以集中樣品，于4°C 中連接過夜。通過以上步驟得到重組的pcDNA3. 1-hTSHR。9. 將重組的pcDNA3. 1-hTSHR轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5a(l)用氯化鈣(CaCU制備新鮮感受態(tài)細菌DH5 oc:① 從于37。C培養(yǎng)16 20小時的新鮮平板上^沐1個DH5ot單菌落(直徑2-3mm)，轉(zhuǎn)到1個含5ml LB培養(yǎng)基的20ml試管中，于 37。C以300轉(zhuǎn)/分振搖培養(yǎng)過夜。② 在無菌條件下轉(zhuǎn)移菌液至4個無菌的、用冰預冷的1.5ml E卯endorf管中，每管1 ml菌液，在冰上》文置10分鐘，使培養(yǎng) 物冷卻至0°C。③ 于4。C中以4， 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細月包。 棄上清，將管倒置1分鐘以使最后殘留的少量培養(yǎng)液流盡。⑤用預先滅菌水浴的0. 1M CaCh lml懸浮每份細胞沉淀，在水上放 置30分鐘后，于4。C中以3，500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。 棄上清，用0. 1M CaCl2 0.6 ml重懸沉淀，按200iul/管分裝， 于4'c放置數(shù)小時備用。(2) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化① 取200 ju 1新鮮制備感受態(tài)細菌DH5 a ,加入全量連接產(chǎn)物10 ja 1, 置于1. 5ml Eppendorf管中，混勻，冰浴30分鐘。②于42。c熱^木克90秒后，立即冰浴2分鐘。③ 加入無抗生素的lb液態(tài)培養(yǎng)基800 m 1，于37。c搖床上溫育45 分鐘，使細菌復蘇。④ 室溫下以4，000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄部分上清，保留約200jal， 吹打、懸浮沉淀細菌。⑤ 取含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基瓊脂平皿涂板(全部200 n l菌 液)，置37。c恒溫培養(yǎng)箱，待菌液吸收后，倒置平皿，于37。c中 培養(yǎng)12 ~ 16小時。轉(zhuǎn)化進了質(zhì)粒的細菌則能在此氨節(jié)選擇培養(yǎng)基 上長出單菌落。(3) 質(zhì)粒擴增①選擇數(shù)個單菌落克隆。② 挑取少量菌落，溶于ddH20中，以菌液為模板，PCR擴增hTSHR cDNA 片段。③ 選擇擴增出BTC cDNA片段的菌落克隆，溶于含氨千青霉素的100ml LB液體培養(yǎng)基中，于37。C中振搖培養(yǎng)過夜。10. 質(zhì)粒抽提純化(1) LB培養(yǎng)基于4。C中以5， 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。(2) 棄上清，加入QIAGEN-tip100質(zhì)粒DNA純化試劑盒中Pl液4 ml， 吹打溶解沉淀；加P2液4 ml,輕柔充分混勻，室溫》丈置5分鐘； 加入預冷P3液4 ml,輕柔充分混勻，于冰上》文置15分鐘。(3) 于4。C中以15, 000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，留上清，重復離心一次。(4) 放Qiagen-tip 100柱，加QBT液10 ml過柱后，將上清過柱，而 后加QC液40 ml過4主。(5) 加5ml洗脫液QF洗柱，存于滅菌離心管中，加異丙醇3. 5ml，充 分混勻，于4'C中以15, 000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清；力o 70% 乙醇2 ml，充分混勻，于4。C中以15， 000轉(zhuǎn)/分離心IO分鐘。(6) 棄上清，室溫下風干沉淀質(zhì)粒，用TE液50 ju 1溶解質(zhì)粒。(7) 取質(zhì)粒溶液2 ni 1 ，加TE液98 jli 1 ，分光光度計測定0026。值，計算 質(zhì)粒濃度。11. 質(zhì)粒鑒定(1) 用限制性內(nèi)切酶""I和I雙酶切重組質(zhì)粒3小時。(2) 瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，觀察電泳結(jié)果。(3) 質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司進行DNA序列測定。 通過以上步驟得到pcDNA3. l-hTSHR質(zhì)粒。12. CH0細l包的培養(yǎng)(l)CHO細胞的傳代CHO細胞用含10%FBS的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。當CHO細胞密度達80%左右時及時傳代。傳代時，先用D-Hanks洗二遍， 力口O. 25%胰蛋白酶，輕輕晃動使胰蛋白酶與細胞充分浸潤。倒掉多 于的胰蛋白酶，繼續(xù)消化2分鐘，加適量含10%FBS的F12培養(yǎng)基 吹勻，用含10%FBS的F12培養(yǎng)基稀釋到合適的密度，重鋪于培養(yǎng) 瓶內(nèi)，37°C, 5ml/1 C02放置培養(yǎng)。 U)CHO細胞的凍存當CHO細胞傳代培養(yǎng)增殖到一定量時，需要部分 凍存一般選擇生長狀態(tài)良好，密度80%左右的細胞凍存。凍存時， 先用D-Hanks洗二遍。加0. 25%胰蛋白酶，輕輕晃動l吏胰蛋白酶與 細胞充分浸潤。倒掉多于的胰蛋白酶，繼續(xù)消化2分鐘。加少量含 10%FBS的F12培養(yǎng)基把貼于壁上的細胞輕輕吹下來，盡量吹勻，保 持細胞密度盡量大一些，然后按細胞混合液FBS: DMS0=7: 2: 1 的比例放入凍存管。順序在4。C放10分鐘，-2(TC放16小時，最后 放-8(TC長期保存。 11pcDNA3. 1-hTSHR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染(1) 準備轉(zhuǎn)染前將對數(shù)生長的CHO細胞重鋪于6孔板中，待細胞長至 70%覆蓋率時準備轉(zhuǎn)染。(2) 轉(zhuǎn)染取4ugDNA加入含250 |ii 1 OMEM的Eppendorf管中，輕輕混 合。取lOjul Lipofectamine 2000力口入另一含250 jul OMEM的 E卯endorf 管中，室溫孵育5分鐘，然后把含DNA和 Lipofectamine 2000的OMEM混合在一起，室溫孵育20分鐘。CHO 細胞用D-Hanks洗一次，用F12培養(yǎng)基洗一次，力。2ml含10%FBS 的F12培養(yǎng)基，滴加轉(zhuǎn)染液，37°C， 5ml/l (]02放置培養(yǎng)5小時后棄轉(zhuǎn)染液,換含10°/。FBS的F12培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后用0. 25% 胰蛋白酶消化細胞，把轉(zhuǎn)染后的細胞按一定比例接種至10cm盤。 通過以上步驟得到TSH受體全長cDNA的表達才朱。 W.G418篩選穩(wěn)定表達抹(G418篩選后的陽性細胞抹見圖3)
(1) G418濃度的確定空白細胞接種一個12孔板或者是6孔板，按照 0， 200ng/jal, 400 ng/jal, 600 ng/jal， 800 ng/|Lil, 1000 ng/ ju 1的G418濃度梯度進行篩選，原則上選擇剛好能殺死空白細胞 的最低G418濃度。經(jīng)'險上來i兌，800 - 1000ng/jul的G418濃度比 較適合CH0細胞穩(wěn)定抹的篩選。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)CH0細胞轉(zhuǎn) 染hTSHR以后實際需要使用50 - 100ng/ ja 1維持篩選濃度，否則細 胞將全部死亡。推測是與hTSHR目的基因的質(zhì)粒本身有關(guān)。
(2) 分盤細胞轉(zhuǎn)染24小時后需要分盤。第一次分盤時可以做一個接 種比例的摸索。按照l: 200， 1: 500， 1: 2000的比例，用確定好 的G418濃度篩選，2-4天后觀察，此時單克隆已基本成形，選擇
單克隆之間位置較遠的接種比例。 15.挑取單克隆
在單克隆的生長過程中，每兩天或者三天4奐液?？寺∩L時間一般 在6天到10天為宜。CH0細胞生長速度4艮快，第六天的時候各個單克 隆的界限還分得比較開，但是當培養(yǎng)時間延長后， 一些克隆中的細胞會 在分裂的過程中遷移到其他地方，又長出一個小克隆，所以經(jīng)常會發(fā)生 在一個很純的陽性克隆里面夾雜一定比例的陰性細胞。解決的方法是在 早期的時候就挑出單克隆。選擇6-7天挑選一次。(1) 克隆環(huán)的準備克隆環(huán)用氯仿在搖床上搖2小時，換用曱醇搖10-20 分鐘，然后順次用自來水，ddH20清洗幾遍，放烘箱烘干。在玻璃 培P底面途上薄薄一層硅脂，克隆環(huán)小心地排列在硅脂上，蓋上 蓋子，包上牛皮紙后高壓滅菌，在烘干，然后放超凈臺照紫外過夜 備用。
(2) 確定單克隆的位置在顯微鏡下先肉眼確定單克隆的位置，用 Marker筆上下標記出單克隆的位置，把細胞放回超凈工作臺準備挑 取單克隆。
(3) 單克隆的挑取細胞先用D-Hanks洗兩遍，在標記單克隆的位置上 ;改上克隆環(huán)，確保克隆環(huán);改準;^文穩(wěn)。環(huán)內(nèi)加100 m 1 0. 25°/。胰蛋白酶， 消化2分鐘。力口 200jul含10。/。FBS的F12培養(yǎng)基，吹吸數(shù)次，把消 化好的單克隆細胞放入96孔培養(yǎng)盤繼續(xù)放大培養(yǎng)。
16.單克隆的培養(yǎng)
如果能保證單克隆較純，那么挑取的單克隆可以放96孔培養(yǎng)盤直 接擴大培養(yǎng)。如果可能混合進臨近的單克隆，即插入位點不一的幾個克 隆可能混合在一起，則應稀釋到96孔培養(yǎng)盤培養(yǎng)，并且確保每個孔只 有一個細胞。為了避免假陽性克隆，整個》文大培養(yǎng)的過程都要加G418 維持篩選壓力。我們采用這樣的方法目前得到陽性單克隆8個，已經(jīng)傳 代到p5。
1L用Western法對細胞進行鑒定。(穩(wěn)定表達hTSHR基因的細胞4朱的 Western blot結(jié)果見圖4) (l)標本處理① 加入適量預冷的6 x Lysis Buffer。
② 用預冷的刮刀將細胞刮下，冰上裂解細胞10-15分鐘。
③ 超聲破碎儀破碎細胞200W共4次，每次5秒，間隔2秒。
4°C， 12000g，離心15分鐘。
取上清，IO(TC煮5-IO分鐘。 (2)電泳和電凈爭移 ①SDS-PAGE電泳
a) 將50 ia 1目標蛋白與12. 5 jLi 1 5 x SDS-PAGE上樣緩沖液混合， 煮沸8分鐘，4'C暫存。
b) 在試管中配好12%分離膠，迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠， 直至剩余的板寬比梳子長度多l(xiāng)cm。小心在膠上覆蓋一薄層異 丙醇壓膠。分離膠聚合完全后，倒去異丙醇，用蒸餾水沖洗膠 面數(shù)次，用濾紙吸干膠面上的殘余水。在分離膠聚合的過程中， 配制5%的積層膠，迅速灌注積層力交，立即插入干凈的梳子，避 免產(chǎn)生氣泡。積層膠聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸 取電極緩沖液清洗加樣孔數(shù)次，以除去未聚合的丙烯酰胺。在 上下電泳槽中加入1 x Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
c) 在蛋白溶液中加入等體積的2x樣品溶解液，混合液在沸水浴 中加熱3分鐘，冷卻后將樣品加入梳孔中。
d) 電泳裝好冷凝水系統(tǒng)，打開電源，初始電壓為100-120V,當 染進入分離膠(這段時間約為20min)后，將電壓提高到 200-220V,繼續(xù)電泳直至染料到達離凝月交底部lcm處。e)固定從電泳裝置上卸下玻璃板，用鑷子小心撬開玻璃板，除 去積層膠部分，將分離膠移入固定液中固定。 f)染色除去固定液，加入染色液，室溫染色8小時。 g)脫色回收染色液，將凝膠浸泡于脫色液中，直至背景脫至無 色，其間更換脫色液3-4次。 ②將聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)用曱醇浸濕，ddH20沖洗，將電泳 膠、PVDF月莫、濾紙》文于Transferring Buffer中平衡后，置于電 轉(zhuǎn)移槽中，在4°C， 400mA恒流條件下電轉(zhuǎn)移120分鐘，將蛋白 樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。
(3) 免疫學測定
① 封閉用TBST (TBS+0. 05%Tween20)加5°/。牛奶配制成封閉液。 室溫封閉PVDF膜1小時或4"C過4艾。
② 一抗孵育用含5%牛奶的TBST分別稀釋目標蛋白或者內(nèi)參 Actin—抗。室溫下與封閉好的PVDF膜孵育2小時或4。C過夜。
③洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。
④二抗孵育用含5%牛奶的TBST稀釋與一抗相應的辣根過氧化物
酶驢抗兔/小鼠二抗。于室溫下孵育2小時。 ⑤洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。TBS洗膜一次，IO分鐘。
(4) ECL:將Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system試 劑盒A液與B液40: 1按比例混合，覆蓋膜表面，室溫下2分鐘， 吸干膜上多余試劑，保鮮膜封閉后，在暗室中經(jīng)不同時間多次曝光， 顯影、定影并洗片。
權(quán)利要求
1、一種人TSH受體全長cDNA的細胞株，它由下列方法制得(1)用RT-PCR技術(shù)擴增hTSHR基因編碼區(qū)的全部序列；(2)將步驟(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T載體，提取質(zhì)粒DNA，以Kpn I/Xba I雙酶切鑒定；(3)將步驟(2)得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1質(zhì)粒；(4)將重組的pcDNA3.1-hTSHR轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒抽提純化，質(zhì)粒鑒定；(5)pcDNA3.1-hTSHR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染CHO細胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞林，其特征在于其制備方法還包括步 驟(6 ):用G418篩選步驟(5 )得到的表達抹。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞抹，其特征在于步驟(1) PCR中所用 !(口下上游引物為:5'-cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'方框內(nèi)為i>/71酶切位點，大寫部分為hTSHR cDNA特異性序列，下游引物為5'-cc|t eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3' 方框內(nèi)為I酶切位點，大寫部分為與hTSHR cDNA互補的序列。
4、 一種人TSH受體全長cDNA的細胞4朱構(gòu)建方法，包括以下步驟 (1)用RT-PCR技術(shù)擴增hTSHR基因編碼區(qū)的全部序列； (2 )將步驟(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T載體，提取質(zhì)粒DNA， 以i> I /扁I雙酶切鑒定；(3 )將步驟(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3. 1質(zhì)粒；(4 )將重組的pcDNA3. 1-hTSHR轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5a，質(zhì)粒 抽提純化，質(zhì)粒鑒定；(5 ) pcDNA3. 1-hTSHR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染CH0細胞。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞林構(gòu)建方法，其特征在于還包括步驟 (6 ):用G418篩選步驟(5 )得到的表達株。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞抹構(gòu)建方法，其特征在于步驟(1)PCR 中所用的引物如下上游引物為5'-cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'方框內(nèi)為J/wI酶切位點，大寫部分為hTSHR cDNA特異性序列，下游引物為5'-cct cta gac gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3'方框內(nèi)為J6a I酶切位點，大寫部分為與hTSHR cDNA互補的序列
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細胞株及其構(gòu)建方法。其技術(shù)方案如下一種人TSH受體全長cDNA的細胞株，它由下列方法制得(1)擴增hTSHR基因編碼區(qū)的全部序列；(2)將hTSHR cDNA克隆入pGEM-T載體；(3)將hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1質(zhì)粒；(4)將重組的pcDNA3.1-hTSHR轉(zhuǎn)化菌DH5α；(5)pcDNA3.1-hTSHR質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染CHO細胞。本發(fā)明優(yōu)點表現(xiàn)在將擴增好的hTSHRcDNA克隆入pGEM-T載體，酶切鑒定確定是目的基因片段后再將其克隆到真核細胞表達載體pcDNA3.1中，并再次進行雙酶切鑒定以保證基因片段的正確性。
文檔編號C12N15/12GK101575591SQ200810037200
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者馮綺文, 張洪梅, 李曉永, 青 蘇, 艷 董 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院