專利名稱：牙鲆模式識(shí)別受體TLR1的cDNA全長(zhǎng)序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是牙鲆模式識(shí)別受體TLRl基因全長(zhǎng)表達(dá)序列和所編碼的一種蛋白，以及該基因的克隆和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著世界范圍水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)品貿(mào)易及水產(chǎn)苗種跨區(qū)域交流日益頻繁，大大增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原傳播的機(jī)會(huì)。同時(shí)，由于現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化、高密度生產(chǎn)方式及漁業(yè)水域環(huán)境的惡化，又常會(huì)引發(fā)養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抑制。正是這些因素相互影響，出現(xiàn)了全球性的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病率趨于頻繁、流行程度日益廣泛、經(jīng)濟(jì)損失極為巨大的局面。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的技術(shù)支撐， 掌握病害的免疫防御技術(shù)是水產(chǎn)科技急需解決的首要問題，因此，近年來(lái)國(guó)際上魚類免疫學(xué)的研究逐漸受到重視。在人類免疫學(xué)研究的歷史舞臺(tái)上，細(xì)胞免疫和體液免疫一直是兩個(gè)主角。相比之下，固有免疫的研究由于缺乏對(duì)其相應(yīng)受體的系統(tǒng)認(rèn)識(shí)，明顯滯后于獲得性免疫研究的進(jìn)程。20世紀(jì)90年代，Janeway等有關(guān)“病原體相關(guān)分子模式”以及“模式識(shí)別受體”概念的提出，標(biāo)志著固有免疫研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。魚類雖是低等脊椎動(dòng)物，但已具備免疫的基本特性，與哺乳動(dòng)物一樣，其體內(nèi)也存在2種免疫應(yīng)答類型固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答。而相對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，魚類的固有免疫研究才剛剛起步。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)家族是動(dòng)物識(shí)別入侵病原體的主要 “模式識(shí)別受體”，可識(shí)別幾乎所有病原生物的一些通用結(jié)構(gòu)，是啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。 一般認(rèn)為TLR 1、2、4、5和6主要參與細(xì)菌成分的識(shí)別，而TLR3、TLR7和TLR8主要特異地針對(duì)病毒成分，TLR9對(duì)這二者均能夠識(shí)別。TLR14、21 23在哺乳動(dòng)物中還未發(fā)現(xiàn)。牙鲆iParalichthys olivaceus)在我國(guó)俗稱牙片、偏口、比目魚，是我國(guó)北方海水工廠化養(yǎng)殖的主要名貴魚類品種，同時(shí)也是重要的海水增養(yǎng)殖魚類之一。牙鲆屬于鰈形目， 鲆科，牙鲆屬。牙鲆屬的魚類在南、北美洲東西岸較多，而亞洲沿岸只有牙鲆一種，主要分布于渤海、黃海、東海、南海以及朝鮮、日本、俄羅斯沿岸海區(qū)。近年來(lái)，腹水病、病毒性神經(jīng)壞死癥等各種病害的爆發(fā)和流行給生產(chǎn)企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。腹水病在牙鲆疾病中危害最為嚴(yán)重，該病從苗種到成魚均有發(fā)生，死亡率可達(dá) 50%-80%。由于目前對(duì)牙鲆免疫機(jī)理和機(jī)制的了解較少，尚無(wú)有效的免疫防治技術(shù)和治療方法。TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通過(guò)感知病原微生物體，識(shí)別病原相關(guān)分子模式，激活天然免疫系統(tǒng)。牙鲆模式識(shí)別受體TLRl基因結(jié)構(gòu)的闡明，有助于人們更加深入地了解TLRl的功能及其與魚類免疫應(yīng)答的關(guān)系，加深人們對(duì)魚類精細(xì)而復(fù)雜免疫應(yīng)答過(guò)程的全面認(rèn)識(shí)，從而為尋找診斷、預(yù)防和治療相關(guān)魚病的新策略以及抗病育種設(shè)計(jì)、抗病性轉(zhuǎn)基因魚設(shè)計(jì)、基因疫苗的設(shè)計(jì)和疫苗的安全使用等提供重要的理論基礎(chǔ)，并在魚類疾病防治，環(huán)境監(jiān)測(cè)以及生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)等方面發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牙鲆模式識(shí)別受體TLRl的cDNA全長(zhǎng)序列及克隆方法。本發(fā)明通過(guò)以近源物種TLRl基因的⑶S序列保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，通過(guò)RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)獲得牙鲆TLRl基因的全長(zhǎng)表達(dá)序列。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
牙鲆模式識(shí)別受體TLRl的基因序列，該序列全長(zhǎng)四90 bp，含 18 bp的開放閱讀框， 編碼805個(gè)氨基酸，該序列具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述的TLRl基因編碼的蛋白質(zhì)，分子量為91. 15 KDa，等電點(diǎn)為6. 49，具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步公開了牙鲆模式識(shí)別受體TLRl基因序列的克隆方法，其特征是包括如下主要步驟
(1)健康牙鲆經(jīng)免疫原免疫刺激后解剖分離頭腎組織
由于TLRl基因?yàn)槊庖呦嚓P(guān)基因，在病原感染后其表達(dá)量通常會(huì)有提高，因此在提取總 RNA之前對(duì)健康牙鲆首先進(jìn)行免疫刺激。選擇魚類的常見細(xì)菌感染源鰻弧菌為免疫原物，并經(jīng)甲醛處理滅活后，腹腔注射牙鲆體內(nèi)，免疫24 h后處死解剖分離頭腎組織。(2)總RNA的提取和純化
采用Trizol法從牙鲆頭腎中提取得到牙鲆頭腎總RNA。總RNA純化采用DNA酶消化法。(3)中間片段的克隆測(cè)序 (3. DcDNA第一鏈的合成
以純化的牙鲆頭腎總RNA作為模板，以O(shè)ligo (dT) 16為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行cDNA第一鏈合成，得到的cDNA第一鏈，作為下述PCR擴(kuò)增的cDNA模板。(3. 2) PCR 擴(kuò)增
以前述步驟(3. 1)所得的cDNA第一鏈作為模板，利用下述引物進(jìn)行TLRl基因中間片段的擴(kuò)增
正向引物TLRl-F 5' - CTGGACYTGTCMCACAAC -3， 反向引物TLRl-R 5' - CGACYYTGGGCAKGTCAT -3，
擴(kuò)增得到牙鲆TLRl基因cDNA的中間片段，通過(guò)克隆測(cè)序，得到中間片段序列。本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選如下
權(quán)利要求
1.一種牙鲆模式識(shí)別受體TLRl的基因序列，該序列全長(zhǎng)四90 bp，含M18 bp的開放閱讀框，編碼805個(gè)氨基酸，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因序列，其中所述的TLRl基因編碼的蛋白質(zhì)，分子量為91.15 仙￡1，等電點(diǎn)為6.49，具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述牙鲆模式識(shí)別受體TLRl基因序列在制備作為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)牙鲆疾病防治方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牙鲆模式識(shí)別受體TLR1的cDNA全長(zhǎng)序列及克隆方法。該序列全長(zhǎng)2990bp，含2418bp的開放閱讀框，編碼805個(gè)氨基酸，其中前26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是通過(guò)以近源物種TLR1的cds序列保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)最終得到牙鲆TLR1的全長(zhǎng)cDNA序列。TLRs家族是動(dòng)物識(shí)別入侵病原體的主要“模式識(shí)別受體”，作為宿主免疫的必需分子之一,通過(guò)感知識(shí)別病原體，激活天然免疫系統(tǒng)。本基因的獲得為研究魚類TLR1的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理及免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，還可為魚類種群遺傳學(xué)及進(jìn)化遺傳學(xué)研究提供分子水平材料。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559692SQ20121000392
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳戀, 孫金生, 潘寶平, 耿緒云, 高虹 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)