專利名稱：：測定血清、血漿中鉀離子含量的液體雙試劑診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酶法測定血清、血漿中鉀離子含量的液體雙試劑診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
：人體內(nèi)的鉀是維持細(xì)胞生理活動的主要陽離子，是保持機(jī)體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質(zhì)代謝，保證神經(jīng)肌肉的正常功能所必需。鉀離子大部分存在于細(xì)胞內(nèi)，少量存在于細(xì)胞外液，且濃度較恒定。人體內(nèi)的鉀鹽主要來源于食物。血清鉀鹽測定實(shí)為細(xì)胞外液鉀離子測定，但體內(nèi)的鉀離子經(jīng)常不斷地在細(xì)胞內(nèi)與體液之間相互交換，以保持動態(tài)平衡。因此血清鉀濃度的高低，在一定程度上也可間接的反映細(xì)胞內(nèi)鉀離子的水平。正常情況下人體內(nèi)血鉀合理的參考值范圍3.5mmol/L-5.lmmol/L。血清鉀升高血清鉀高于5.lmmol/L稱為高鉀血癥。(1)急性腎功能衰竭由于腎功能嚴(yán)重受損、尿少或尿閉，體內(nèi)的鉀不能經(jīng)腎排出體外，同時(shí)因腎組織細(xì)胞受破壞，致使細(xì)胞內(nèi)的鉀離子大量進(jìn)入細(xì)胞外液，使血鉀升高。(2)嚴(yán)重溶血或組織損傷此時(shí)紅細(xì)胞或肌肉組織內(nèi)的鉀大量釋放至細(xì)胞外液，使血清鉀升高。(3)急性酸中毒或組織缺氧此時(shí)細(xì)胞內(nèi)大量鉀離子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外液，使血清鉀升高，如休克和循環(huán)衰竭等癥。(4)腎上腺皮質(zhì)功能減退腎排泄鉀的功能主要由腎皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)，當(dāng)腎上腺皮質(zhì)功能減退時(shí)，腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少，使腎排鉀能力降低，排鈉增多，故血鉀升高而血鈉降低，即阿狄森氏病。(5)食入或注射大量鉀鹽食入或經(jīng)靜脈注入大量鉀鹽，超過腎排鉀能力，尤其是腎排鉀功能降低時(shí)更易發(fā)生高鉀血癥。(6)其他醛固酮缺乏或長期應(yīng)用抗醛固酮利尿劑及家族性高血鉀性周期性麻痹等，均可使血鉀升高。血清鉀增高可引起嚴(yán)重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性應(yīng)激紊亂，以及特異的心電圖改變。血清鉀高于7mmol/L時(shí)，就有這些現(xiàn)象出現(xiàn)，超過10mmol/L時(shí)，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而導(dǎo)致死亡。血清鉀降低(1)鉀的攝入量不足長期低鉀飲食、禁食或厭食等。(2)鉀的丟失增加嚴(yán)重嘔吐或腹瀉、胃腸減壓，大量應(yīng)用排鉀利尿劑及腎上腺皮質(zhì)激素，腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)或醛固酮增多癥；某些慢性消耗性疾病(如惡性腫瘤)，由于細(xì)胞分解過多，大量鉀從尿液排出，代謝性堿中毒時(shí)，腎排鉀增多；大量出汗也可經(jīng)皮膚丟鉀，使血清鉀降低；小兒中毒性消化不良、成人的吸收不良綜合癥、長期胃腸引流術(shù)等等都可產(chǎn)生低鉀血癥。(3)腎臟疾病在急性腎功能衰竭由少尿期轉(zhuǎn)入多尿期時(shí)，由尿中丟失大量電解質(zhì)而得低鉀癥。5(4)鉀在體內(nèi)分布異常有時(shí)體內(nèi)并非真正缺鉀，只是分布異常而使血清鉀降低。常見于①心力衰竭、腎性水腫或大量輸入無鉀鹽液體，細(xì)胞外液被稀釋，血清鉀降低；②大量應(yīng)用胰島素促使葡萄糖被利用或形成糖原時(shí)，細(xì)胞外鉀大量移入細(xì)胞內(nèi)以保持細(xì)胞內(nèi)、外的相對平衡，結(jié)果使血清鉀降低；③急性堿中毒時(shí)細(xì)胞外液的鉀急劇轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，引起低鉀血癥；④家族性周期性麻痹患者，發(fā)作時(shí)細(xì)胞外鉀可轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)生低鉀血癥。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測手段不斷提高。離子選擇性電板在臨床上的廣泛應(yīng)用，使鉀離子的測定向著快速、簡便、準(zhǔn)確、特異性的方向發(fā)展。臨床上檢測鉀離子基本上分為比濁、火焰光度分析、離子選擇性電板及酶法。1.四苯硼鈉比濁法血清中鉀離子與四苯硼鈉作用，生成不溶性的四苯硼鉀，產(chǎn)生的濁度在一定范圍內(nèi)與鉀離子的濃度成正比。根據(jù)濁度可測得血清鉀的含量。此法簡單.不需特殊儀器，適合于基層使用。但影響因素較多，準(zhǔn)確性不夠好，現(xiàn)臨床上已基本淘汰此法。2.火焰光度分析法火焰光度分析法是一種發(fā)射光譜分析，樣品中的鉀原子被火焰的熱能激發(fā)處于激發(fā)態(tài).激發(fā)態(tài)的原子不穩(wěn)定，迅速回到基態(tài)，放出能量。發(fā)射出元素特有的波長輻射譜線。利用此原理進(jìn)行光譜分析。血清等標(biāo)本用去離子水適當(dāng)稀釋后由壓縮空氣噴成氣霧，再與可燃?xì)怏w混合，點(diǎn)燃成火焰，鉀的火焰呈深紅色，波長為767nm，用相應(yīng)波長的濾光片將譜線分離，然后通過光電管或光電池轉(zhuǎn)換成電訊號，經(jīng)激光放大器放大后進(jìn)行測量。樣品溶液中鉀離子的濃度越大，所發(fā)射的光譜也愈強(qiáng)用已知量的標(biāo)準(zhǔn)液與待測標(biāo)本液對比計(jì)算出標(biāo)本中鉀離子的濃度。用此法測定結(jié)果較正確可靠。但有缺點(diǎn)需要?dú)庠?、火源，安全性差；開機(jī)時(shí)需反復(fù)校準(zhǔn)穩(wěn)定，對急診標(biāo)本的個(gè)別檢測不太方便；測定中需要特定的去離子水或鋰溶液，試驗(yàn)麻煩且試劑保存困難；不穩(wěn)定的壓縮空氣可直接影響火焰光度計(jì)工作的穩(wěn)定性；標(biāo)本中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)能改變樣品溶液的粘度，影響樣品的噴霧速度，使火焰的發(fā)射光強(qiáng)度發(fā)生變化，導(dǎo)致測定結(jié)果的誤差。現(xiàn)臨床上較少應(yīng)用。3.離子選擇性電極法離子選擇性電極分析法是以測定電池的電動勢為基礎(chǔ)的定量分析方法。離子選擇性電極是一種化學(xué)傳感器，它能將溶液中某種特定離子的活度轉(zhuǎn)變成電位信號，然后通過儀器來測量樣品中被測離子接觸電極時(shí)，在電極膜基質(zhì)的含水層內(nèi)發(fā)生離子遷移，遷移離子的電荷改變存在著電勢，因而使膜面間的電位發(fā)生變化，在測量電極與參比電極間產(chǎn)生一個(gè)電位差。電極電位隨溶液中離子活度變化的關(guān)系可用Nernst方程式表示E=E0+2.303RTlogaxfk。~nF從Nernst公式中可以看出，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，離子選擇性電極的電極電位(E)與溶液中被測離子活度(或濃度)的對數(shù)成線性關(guān)系。由此可求得標(biāo)本中離子的活度或濃度。理想的情況是，每個(gè)電極都具有單離子選擇性，使電極只對一種離子有反應(yīng)。實(shí)際情況卻不是這樣的，所有的離子選擇電極都存在有干擾離子。況且，盡管能對離子特異性電極進(jìn)行校正，但通常特異性仍不是絕對的，所以用電極法測得的結(jié)果也不是十分準(zhǔn)確的。同時(shí)，測定成本也比較高，尤其是輔助材料和儀器比較昂貴。4.酶法近幾年出現(xiàn)的血清鉀離子的酶法測定方法。該測定方法的理論基礎(chǔ)是血離子都有激活酶的作用。利用K+依賴性丙酮酸激酶(PK)可催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化為丙酮酸的反應(yīng)原理，再借助NADH以乳酸脫氫酶(LDH)為指示酶，在340nm處監(jiān)測NADH的減少，每分鐘吸光度(AA/min)的變化與K+含量成正比，從而建立酶偶聯(lián)連續(xù)測定鉀離子的方法。酶法測定不僅準(zhǔn)確而且更為方便，可以與其他的常規(guī)項(xiàng)目一起使用全自動分析儀進(jìn)行檢測，擺脫了原來的電極法的儀器，同時(shí)也降低了檢測成本。由于現(xiàn)有酶法試劑都為干粉試劑使用不便，復(fù)融后穩(wěn)定性差。給臨床使用造成一定的影響，同時(shí)復(fù)融后的穩(wěn)定期多為一周或更短，在樣本檢測的準(zhǔn)確性上帶來一定的為誤差，因此業(yè)界需要一種使用方便、簡潔，可以在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上快速檢測，不需要特殊或者額外的儀器，且成本低廉的酶法檢測鉀離子試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容目前市場上存在的檢測鉀離子的試劑盒均為干粉的試劑盒。本發(fā)明則提供了一種為液體試劑的試劑盒。在設(shè)計(jì)本發(fā)明時(shí)需要考慮的幾個(gè)問題是1)根據(jù)選擇的底物選定鉀離子測定的最適反應(yīng)條件，如緩沖液的濃度，離子強(qiáng)度和pH等等;2)還原型輔酶的最適穩(wěn)定pH及輔酶再生循環(huán)系統(tǒng)的慢反應(yīng)pH;3)丙酮酸激酶的最適穩(wěn)定及最適反應(yīng)的條件，如緩沖液的濃度，離子強(qiáng)度和pH等。4)乳酸脫氫酶的最適穩(wěn)定及最適反應(yīng)的條件，如緩沖液的濃度，離子強(qiáng)度和pH等。5)樣本中氨干擾的去除；6)整個(gè)體系的穩(wěn)定性問題；7)兼顧上述所有條件下的反應(yīng)速率問題。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種用于檢測血清、血漿中鉀離子的液體雙試劑的試劑盒。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述試劑盒主要采取以下的方法及步驟首先，將需要測定的樣品與含有烯醇式丙酮酸(PEP)、腺苷二磷酸(ADP)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、還原型輔酶及再生酶循環(huán)系統(tǒng)的各種物質(zhì)混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，K+PEP+ADP-------^丙酮酸鹽+ATPPKLDH丙酮酸鹽+還原型輔酶+H"------>乳酸+氧化型輔酶+水<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>由于血清中的氨對檢測鉀離子的濃度會產(chǎn)生干擾，體系中加入除氨系統(tǒng)消除氨的干擾，反應(yīng)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>然后，將反應(yīng)后的混合物在全自動生化分析儀上，檢測340nm處吸光度的下降速度，從而測算出鉀離子濃度的大小。測定過程中，被測樣品與試劑的比例按體積控制在i:io-i:ioo，反應(yīng)溫度控制在20°C-50°〇，反應(yīng)時(shí)間控制在1-10分鐘，檢測時(shí)設(shè)定副波長在405nm以上。本發(fā)明提供了一種可以簡便快捷并可以快速檢驗(yàn)血清、血漿中K離子含量的酶法液體雙試劑診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外、可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀測定出血清、血漿中K離子含量，測定過程中不受血清中其他離子的干擾。穩(wěn)定性強(qiáng)，測定速度快。準(zhǔn)確度高，為臨床及化學(xué)分析中推廣酶法檢測K離子含量提供了有力支撐。本發(fā)明的試劑盒包括50-250mM，pH6.0-11的緩沖液、5-30mM的烯醇式丙酮酸(PEP)、5-20mM的腺苷二磷酸(ADP)、0.1-lmM的還原型輔酶、0.2-5KU的丙酮酸激酶(PK)、1.0-100KU/L的乳酸脫氫酶(LDH)，其還包括由再生系統(tǒng)酶、底物和輔酶組成的再生酶循環(huán)系統(tǒng)和酶的保護(hù)體系。該再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括濃度為5-100mM的底物、10-1000U的系統(tǒng)酶。特別地，本發(fā)明提供的試劑盒中所述的烯醇式丙酮酸選自單環(huán)烯醇式丙酮酸、三環(huán)烯醇式丙酮酸或者以上兩種物質(zhì)的鹽類。所述的腺苷二磷酸為腺苷二磷酸或者腺苷二磷酸鹽。所述的丙酮酸激酶可以選自不同生物來源，可以是來自兔肌組織或者由微生物提取。本發(fā)明的試劑盒還包括一種在單試劑制備中的再生酶循環(huán)系統(tǒng)，通過在檢測試劑中加入指示性輔酶的生成補(bǔ)充體系，利用反應(yīng)的可逆性，由產(chǎn)物逆向生成原反應(yīng)物，從而補(bǔ)充原反應(yīng)物的量。該試劑盒通過在反應(yīng)體系中偶聯(lián)了一步再生酶循環(huán)系統(tǒng)，從而從技術(shù)上確保了單試劑中各組分在制備、儲存和應(yīng)用過程的穩(wěn)定本發(fā)明所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)的反應(yīng)速率小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)。本發(fā)明優(yōu)選的再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶_葡萄糖或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶_葡萄糖6磷酸或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶_甘油或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶_丙酮酸或其類似物系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選的還原型輔酶是還原型煙酰輔酶或其類似物。更優(yōu)選的還原型煙酰輔酶或其類似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。優(yōu)選地，所述的還原型輔酶NADH的吸光度在0.6-2.0之間，波長340nm，光徑10mm。配制本發(fā)明的試劑盒所選擇的緩沖液的pH范圍在6.0-11.0之間。所述的緩沖液可以是下列緩沖體系的任意一種Tris-HCL緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸緩沖液、磷酸緩沖液等等。本發(fā)明提供的試劑盒優(yōu)選地還包括O.l-5g/L的螯合劑、0.l-3g/L的防腐劑、1-30%的穩(wěn)定劑、0.l-5g/L的表面活性劑、0.l-5mM的反應(yīng)加速劑。上述提及的螯合劑可以是選自下述成分的一種18-冠醚-6，15-冠醚-5，Kryptofix221，Kryptofix222。其使用目的主要在于螯合樣本中的一價(jià)金屬離子，減少一價(jià)金屬離子對測量的干擾。其優(yōu)選的濃度范圍是0.1-5.Og/L。上述提及的穩(wěn)定劑可以是選自下述成分的一種或多種乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸等。上述提及的表面活性劑可以是選自下述成分的一種或多種陽離子表面活性劑指十六烷基三甲基溴化銨，十六烷基氯化吡啶等。陰離子表面活性劑是指十二烷基磺酸鈉，十二烷基苯磺酸鈉，膽酸鈉等。兩性表面活性劑是指TritonX系列，烷基、甜菜堿系列等。其優(yōu)選的濃度范圍是0.l-5g/L。上述提及的反應(yīng)加速劑可以是選自下述成分的一種或多種二價(jià)陽離子，如鎂離子、錳離子、f丐離子等。其優(yōu)選濃度范圍在0.l-5mM。上述提及反應(yīng)的防腐劑可以是選自下述成分中的一種或多種迭氮系列，如迭氮鈉，迭氮鋰、MIT、以及生物防腐劑PC系列，如PC-300。烷基糖苷，分子量在500-5000范圍內(nèi)。其優(yōu)選濃度范圍在0.l-5g/L。根據(jù)本發(fā)明公開的方法，配制成的試劑盒主要成分如下，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解該試劑盒的成分并不限于下述成分，其可以包括與所述成分功能相同的其他等價(jià)試劑，也包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的配制試劑盒所常用的其他成分或物質(zhì)緩沖液50-250mM(pH6.0-11.0)烯醇式丙酮酸5-30mM腺苷二磷酸5-20mM還原型輔酶0.l-lmM丙酮酸激酶0.2-5KU乳酸脫氫酶l-100KU谷氨酸脫氫酶0.l-20KUa-酮戊二酸l-50mMD-葡萄糖5-100mM葡萄糖脫氫酶10-1000U穩(wěn)定劑1-30%防腐劑0.l-3g/L螯合劑0.l-5g/L表面活性劑0.l-5g/L反應(yīng)加速劑0.l-5mM本發(fā)明的有益效果主要表現(xiàn)在1)該方法所便，操作簡單；2)該試劑可在全自動生化分析儀上快速檢測，也可在半自動或者手動儀器上使用，所以便于推廣應(yīng)用；3)參與偶聯(lián)反應(yīng)的成分都是外加的，不會引入額外的內(nèi)外源9物質(zhì)的污染；4)本發(fā)明偶聯(lián)的再生酶循環(huán)系統(tǒng)速率要小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)；5)本發(fā)明配制的液體雙試劑盒，穩(wěn)定性好，可以長時(shí)間使用，37t:穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明一年半后空白吸光度AO>1.5，試劑開蓋放置1個(gè)月測值穩(wěn)定，試劑凍存后穩(wěn)定性良好。本發(fā)明技術(shù)方案的突出的特點(diǎn)和顯著進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全采用再生循環(huán)酶法，提高了試劑穩(wěn)定性。(2)本發(fā)明采用銨離子去除系統(tǒng)和表面活性劑，試劑檢測不受銨離子和脂類影響。試劑的特異性高。檢測準(zhǔn)確。(3)該方法操作簡單，可快速得到檢測結(jié)果。(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用。(5)本法提供了液體鉀離子診斷試劑盒，試劑穩(wěn)定性好。試劑中各酶的活性保存完好，很好的保證了應(yīng)用該試劑的檢測效果。同時(shí)配制為液體雙試劑可以有效降低干擾的同時(shí)，降低試劑各組分之間的交叉影響，使檢測結(jié)果更加可信，試劑更加穩(wěn)定。以下將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，其中實(shí)施例僅僅是說明而非限定的作用，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以在以下披露的具體實(shí)施例的技術(shù)上作出改進(jìn)，但是不超過本發(fā)明權(quán)利要求的范圍或者本發(fā)明精神之內(nèi)所作出的改進(jìn)都會落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1顯示了實(shí)施例1的試劑盒的開蓋穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。圖2顯示了國內(nèi)某廠家干粉酶法試劑盒的開蓋穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。圖3顯示了實(shí)施例2的試劑盒于4-8t:保存試劑線性曲線。圖4顯示了實(shí)施例2試劑盒于37t:加速穩(wěn)定性試驗(yàn)5天后的線性曲線。圖5顯示了使用實(shí)施例2的試劑盒檢測樣品的血清中鉀離子的含量與離子選擇電極檢測的相關(guān)性。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不應(yīng)理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。實(shí)施例1按以下成分和用試劑1Tris緩沖液烯醇式丙酮酸腺苷二磷酸氯化鎂Kryptofix221膽H葡萄糖葡萄糖脫氫酶量配制鉀離子診斷試劑盒100mM5mM5mM5mM3.0g/L0.5mM5mM10U/LMIT0.5g/L試劑2Tris緩沖夜10mM乳酸脫氫酶50KU/L丙酮酸激酶2KU/LMIT0.5g/LPEG60001.Og/L在全自動生化分析儀(奧林巴斯-400)上設(shè)定反應(yīng)溫度37t:、反應(yīng)時(shí)間1.5分鐘、測試主波長340nm、測試副波長410nm。被測鉀離子樣品與試劑比為樣品試劑1:試齊U2二5iU:180iii:60iii，反應(yīng)為降反應(yīng)。先加入樣品和試劑l，兩者在全自動生化分析儀內(nèi)部自動混勻，檢測，記錄在主副波長下的吸光度值。在3分鐘后加入試劑2，兩者在全自動生化分析儀內(nèi)部自動混勻，1分鐘后開始記錄主副波長的吸光度下降情況。根據(jù)速率法或終點(diǎn)法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中鉀離子的含量。該實(shí)施例配制試劑盒穩(wěn)定性好，配制液體試劑進(jìn)行37t:加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，37t:加速穩(wěn)定性試驗(yàn)5天可模擬現(xiàn)實(shí)4-『C保存1年。結(jié)果如表1所示[o川]表l時(shí)間空白吸光度定標(biāo)1吸光度變化(2.9mmo1/1)定標(biāo)2吸光度變化(5.8mmo1/1)第一天1.93250.07710.150237°C3天1.74550.0710.136837°C4天1.68560.0720.13937°C5天1.63870.07030.1352第五天下降百分比-15.20%-8.82%-9.99%國外進(jìn)口某知名廠家干粉酶法鉀離子檢測試劑，其復(fù)融試劑4-8t:保存的穩(wěn)定性結(jié)果如表2所示表211時(shí)間新溶復(fù)融后1個(gè)月下降百分比空白吸光度1.96001.3579-30.7%定標(biāo)1吸光度2.9mmol/l0.04800.0290-39.5%定標(biāo)2吸光度5.8mmol/l0.09000.0542、-39.8%國內(nèi)某廠家干粉酶法鉀離子檢測試劑，其復(fù)融試劑4-8t:保存的穩(wěn)定性結(jié)果如表3所示表3時(shí)間新溶復(fù)融后7天偏差空白吸光度1.51.3579-9.4%定標(biāo)吸光度12mmo1/10.09130.0835-8.5%定標(biāo)吸光度26mmo1/10.18750.1705-9.1%以上數(shù)據(jù)明顯表明本發(fā)明試劑穩(wěn)定性比原有的市場上的試劑明顯改善。本實(shí)施例開蓋穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果試劑定標(biāo)后開蓋放置試劑倉中，定期檢測固定質(zhì)控品。檢測試劑在使用過程中的穩(wěn)定性性能。本實(shí)施例開蓋穩(wěn)定性結(jié)果具體如表4和圖1所示表4期檢領(lǐng)時(shí)間質(zhì)控品16.04質(zhì)控品I13.98(天)(5.56-6.52)(3.66-4.30)16.073.9335.953.9045.893.865.883.8665.903.9376.033.99105.973.96125.883.97145.983.90176.044.13195.833.89216.014.11246.08,4.10266.024.11286.194.12316.003.96國內(nèi)某廠家干粉酶法鉀離子檢測試劑，其復(fù)融試劑定標(biāo)后開蓋放置試劑倉中，定l固定質(zhì)控品。開蓋穩(wěn)定性結(jié)果具體如表5和圖2所示表5時(shí)間(天)質(zhì)控品16.04(5.56-6.52)質(zhì)控品113.98(3.66-4.30)16.463.7926.143.5845.573.3465.373.20通過以上數(shù)據(jù)明顯顯示，本發(fā)明的試劑盒在4t:開蓋穩(wěn)定性能指標(biāo)表現(xiàn)卓越。試劑在臨床使用過程中穩(wěn)定性良好，對檢測的數(shù)據(jù)的可信性提供有力支持。本實(shí)施例在運(yùn)輸條件下的穩(wěn)定性，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6表613<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>0133]由此可見本發(fā)明試劑在運(yùn)輸顛簸和溫度不恒定的條件下，穩(wěn)定性能依然良好。0134]實(shí)施例20135]在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上加入除氨系統(tǒng)和表面活性劑。試劑特異性增強(qiáng)。0136]具體配方如下0137]試劑l0138]Tris緩沖液200mM0139]烯醇式丙酮酸5mM0140]腺苷二磷酸5mM0141]氯化鎂5mM0142]谷氨酸脫氫酶10KU/L0143]a-酮戊二酸10Mm0144]TritonX4050.5g/L0145]Kryptofix2213.Og/L0146]膽H0.5mM0147]葡萄糖5mM0148]葡萄糖脫氫酶10U/L0149]MIT0.5g/L0150]試劑20151]Tris緩沖液10mM0152]乳酸脫氫酶50KU/L0153]丙酮酸激酶2KU/L0154]MIT0.5g/L0155]PEG60001.Og/L0156]甘油lOOg/L0157]試劑盒的抗干擾實(shí)驗(yàn)0158](1)分別按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)配制含有抗壞血酸、膽紅素、血紅蛋白，甘油三酉14不同濃度的待測樣品，測定實(shí)施例2的試劑盒對各種干擾物的抗干擾能力(每個(gè)樣品一式三份，取其平均值)。檢測結(jié)果(平均值)如表7所示表7樣本(千擾物所示濃度為樣木實(shí)施例試劑盒<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)分別按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)配制含有血液中的不同金屬離子，按照其線性最高濃度配制待測樣品，測定實(shí)施例2的試劑盒對各種干擾物的抗干擾能力(每個(gè)樣品一式三份，取其平均值)。檢測結(jié)果(平均值)檢測結(jié)果(平均值)如表8所示表8<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(3)分別按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)血漿處理辦法配制樣本，測定實(shí)施例2的試劑盒對各種干擾物的抗干擾能力(每個(gè)樣品一式三份，取其平均值)。檢測結(jié)果(平均值)如表9所示表9<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明試劑盒抗干擾能力優(yōu)越，試劑檢測樣本的準(zhǔn)確性高。實(shí)施例3本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確性和精密度分別采用本領(lǐng)域常規(guī)的檢測方法，對實(shí)施例2制備的試劑盒的準(zhǔn)確性和精密度進(jìn)行檢測。1.準(zhǔn)確性對靶值為3.98(3.66-4.30)的質(zhì)控液I和靶值為6.04(5.56-6.52)的質(zhì)控液II在相同條件下，采用試劑盒對同一質(zhì)控液的鉀離子濃度連續(xù)檢測20次，將檢測結(jié)果的平均值與靶值范圍進(jìn)行比較，以檢測所述的試劑盒的準(zhǔn)確性。對試劑盒準(zhǔn)確性的檢測結(jié)果如表10所示2.精密度在相同條件下，采用試劑盒對兩份質(zhì)控液的鉀離子含量連續(xù)檢測20次，比較每個(gè)試劑盒的變異系數(shù)，以檢測所述的試劑盒的精密度。對試劑盒的精密度的檢測結(jié)果如表10所示。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表10的結(jié)果表明試劑盒20次檢測結(jié)果的平均值在靶值范圍內(nèi)，不準(zhǔn)確度相對偏差(CV(%))不超過±5%。說明本發(fā)明的試劑盒的準(zhǔn)確度符合診斷試劑盒的技術(shù)指標(biāo)。表10的結(jié)果表明試劑盒檢測的同一樣品的鉀離子濃度的變異系數(shù)不超過±10%，說明本發(fā)明的試劑盒的精密度符合診斷試劑盒的技術(shù)指標(biāo)。實(shí)施例4:試劑盒的靈敏度檢測采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，對實(shí)施例2制備的試劑盒的靈敏度進(jìn)行檢測。將空白液和同一份用生理鹽水進(jìn)行等比稀釋5個(gè)梯度的樣品，在檢測儀器上采用試劑盒連續(xù)對吸光度測定20次，讀取每次測定原始吸光度值，然后計(jì)算出扣除空白吸光度后的各樣品的吸光度的值，計(jì)算其均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差。這里采用99.7%的可能性來計(jì)算檢測低限。將每個(gè)樣本的均值減去3倍的各自的標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后與空白液的3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差比較，如果前者高于后者，我們就認(rèn)定有99.7%的可能性出現(xiàn)的最小吸光度一定大于空白的吸光度，能定量的報(bào)告結(jié)果。1)試劑盒的測值的原始數(shù)據(jù)(如表11)表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2)試劑盒測值的原始吸光度的數(shù)據(jù)(如表12)表12<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3)扣除空白后的吸光度數(shù)據(jù)(表13)表13<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>根據(jù)以上數(shù)據(jù)檢測低限0.36*0.00179/0.01067=0.06,1/1生物檢測限0.36mmol/l功能靈敏度=0.36mmol/l實(shí)施例5試劑盒的線性范圍采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，對實(shí)施例2制備的試劑盒的線性范圍檢測。將高值標(biāo)本進(jìn)行等比稀釋10個(gè)濃度的樣品，在檢測儀器上采用試劑盒連續(xù)測定3次，計(jì)算其均值。將檢測出的樣品的測量值與稀釋比例進(jìn)行相關(guān)對比。求出節(jié)距為零的回歸方程。通過回歸方程求出每個(gè)樣本的理論值。根據(jù)計(jì)算出的理論值和檢測均值之間求出該濃度時(shí)檢測的線性偏差。要求回歸方程的回歸系數(shù)R2>0.99，各濃度的線性偏差均小于10%。實(shí)施例2試劑盒，4-8t:保存試劑線性范圍數(shù)據(jù)(如表14和圖3)表14<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例2試劑盒的于37t:加速穩(wěn)定性試驗(yàn)5天后的數(shù)據(jù)(如表15和圖4)。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>根據(jù)以上數(shù)據(jù)，本發(fā)明試劑盒在1-lOmmol/l的范圍內(nèi)檢測呈線性分布。實(shí)施例6:與現(xiàn)在常規(guī)醫(yī)院檢驗(yàn)鉀離子含量的電極法進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。從醫(yī)院收取已經(jīng)經(jīng)過電極法檢測的病人樣本，在Olympus400上，用實(shí)施例2的試劑盒按照常規(guī)方法檢測樣品的血清中鉀離子的含量，其結(jié)果如表16和圖5所示表16<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>4.02表16的結(jié)果說明用本發(fā)明公開的試劑盒對已臨床樣品的血清、血漿鉀離子濃度檢測結(jié)果與臨床常用方法相符，說明本發(fā)明的試劑盒可以適用于臨床對血清、血漿鉀離子濃度的檢測。總之，本本發(fā)明的試劑盒的有點(diǎn)在于，液體雙劑盒，操作簡單，使用方便，可以應(yīng)用于全自動和半自動等各種生化分析儀器上；通過加入除氨系統(tǒng)加速反應(yīng)消除內(nèi)外源氨的干擾，偶聯(lián)輔酶的循環(huán)再生系統(tǒng)，增強(qiáng)試劑的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、抗干擾性，長時(shí)間存放之后仍可以準(zhǔn)確測定樣本中的鉀離子濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明公開的方法及由此生產(chǎn)的液體雙試劑盒可以廣泛應(yīng)用于Hitachi、01ympus和Synchron各種全自動生化分析儀。各儀器的測定條件如下溫度37t:、反應(yīng)時(shí)間1.5分鐘、測試主波長340nm、副波長405nm、測定樣本與試劑盒的比例是5:180:60，反映方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間為1分鐘，檢測時(shí)間1.5分鐘。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和臨床工作人員的經(jīng)驗(yàn)，在不需要進(jìn)行創(chuàng)造性勞動的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對各種檢測儀器的最佳檢測參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。對各種檢測儀器的參數(shù)的優(yōu)化落在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。2權(quán)利要求一種測定鉀離子濃度的液體雙試劑試劑盒，其包括50-250mM，pH6.0-10的緩沖液、5-30mM的烯醇式丙酮酸、5-20mM的腺苷二磷酸、0.1-1mM的還原型輔酶、0.2-5KU的丙酮酸激酶、1.0-100KU/L的乳酸脫氫酶，其還包括由再生系統(tǒng)酶、底物組成的再生酶循環(huán)系統(tǒng)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其中所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括濃度為5-100mM的底物、10-1000U的系統(tǒng)酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述烯醇式丙酮酸選自單環(huán)烯醇式丙酮酸，三環(huán)烯醇式丙酮酸或者以上兩種物質(zhì)的鹽類。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述腺苷二磷酸選自腺苷二磷酸或者腺苷二磷酸鹽。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述丙酮酸激酶來自兔肌組織或者從微生物中提取。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、三乙醇氨緩沖液、咪唑_鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、碳酸鈉_碳酸氫鈉緩沖液、硼酸-硼酸鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、擰檬酸-擰檬酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液或者磷酸鹽緩沖液。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)的反應(yīng)速率小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其中所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶_葡萄糖或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶-葡萄糖6磷酸或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶_甘油或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶_丙酮酸或其類似物系統(tǒng)。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述的還原型輔酶是還原型煙酰輔酶或其類似物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其特征在于所述的還原型煙酰輔酶或其類似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。11.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑盒，其特征在于所述的還原型輔酶NADH的吸光度在0.6-2.0之間，波長340nm，光徑10mm。12.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于還包括由谷氨酸脫氫酶和a酮戊二酸組成的除氨系統(tǒng)。13.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于還包括0.l-5g/L的螯合劑、0.l-3g/L的防腐劑、1_30%的穩(wěn)定劑、0.l-5g/L的表面活性劑、0.l-5mM的反應(yīng)加速劑。14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于所述螯合劑為18-冠醚-6，15-冠醚-5，Kryptofix221，Kryptofix222中的一種或幾種。15.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸中的一種或幾種。16.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于所述表面活性劑可以是選自下述成分的一種或多種十六烷基三甲基溴化銨，十六烷基氯化吡啶，十二烷基磺酸鈉，十二烷基苯磺酸鈉，膽酸鈉，TritonX系列，烷基、甜菜堿系列。17.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)加速劑選自下述成分的一種或多種鎂離子，錳離子，鈣離子。18.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于所述防腐劑分子量在500—5000范圍內(nèi)，選自迭氮鈉、迭氮鋰、MIT、PC一300、烷基糖苷。19.一種測定鉀離子的液體雙試劑試劑盒，其包括試劑lTriS緩沖液100mM烯醇式丙酮酸5mM腺苷二磷酸5mM氯化鎂5mMKryptofix22l3.og／LNADH0.5mM葡萄糖5mM葡萄糖脫氫酶10U／LMI／0.5g／L試劑2／riS緩沖液10mM乳酸脫氫酶50KU／L丙酮酸激酶2KU／LMI／0.5g／LPEG60001.og／L和使用說明書。20.一種測定鉀離子的液體雙試劑試劑盒，其包括試劑lTriS緩沖液200mM烯醇式丙酮酸5mM腺苷二磷酸5mM氯化鎂5mM谷氨酸脫氫酶10KU／Lo一酮戊二酸10MmTritonX4050.5g／LKryptofix22l3.og／LNADH0.5mM葡萄糖5mM葡萄糖脫氫酶10U／LMI／0.5g／L試劑2／riS緩沖液10mM乳酸脫氫酶50KU／L丙酮酸激酶2KU／LMIT0.5g/LPEG60001.Og/L甘油lOOg/L和使用說明書。全文摘要本發(fā)明涉及一種測定血清、血漿中鉀離子含量的液體雙試劑診斷試劑盒。該試劑盒用K+依賴性丙酮酸激酶(PK)可催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化為丙酮酸的反應(yīng)原理，再借助NADH以乳酸脫氫酶(LDH)為指示酶，在340nm處檢測NADH的減少，每分鐘吸光度(ΔA/min)的變化與K+含量成正比，從而建立酶偶聯(lián)連續(xù)測定鉀離子的方法。另外本發(fā)明在體系中加入能緩慢生成還原型煙酰輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，在試劑中形成酶-底物-輔酶的慢反應(yīng)系統(tǒng)，使得輔酶能緩慢循環(huán)補(bǔ)充，當(dāng)濃度達(dá)到一定平衡的時(shí)候，就可以使試劑達(dá)到穩(wěn)定。這種液體雙試劑的試劑盒使用方便、簡潔，可以在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上快速檢測，不需要特殊或者額外的儀器，其成本也低廉。文檔編號C12Q1/48GK101717814SQ200910243348公開日2010年6月2日申請日期2009年12月18日優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日發(fā)明者劉希,劉瑤申請人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司