專利名稱：11α羥基坎利酮的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種11 a羥基坎利酮的合成方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于依普利酮的化合物專利已過期，近年來全世界制藥行業(yè)紛紛對該產(chǎn)品進(jìn)行仿 制，目前已有阿根廷等幾個(gè)非規(guī)范市場獲得批準(zhǔn)，我國也有四家企業(yè)申請注冊。對依普利酮 的所有合成路線分析發(fā)現(xiàn)，雖然依普利酮有多條合成路線，但幾乎所有路線都離不開一個(gè) 關(guān)鍵中間體即11a羥基坎利酮。目前由于11 a羥基坎利酮成本高，導(dǎo)致依普利酮價(jià)格昂 貴。鑒于上述情況，對依普利酮的關(guān)鍵中間體11 a羥基坎利酮生物合成進(jìn)行研究，并使其 成本有較大幅度下降，滿足依普利酮產(chǎn)業(yè)化的需要是極其有前景的。由于11 a羥基坎利酮 成本決定了依普利酮的產(chǎn)品成本，研究對依普利酮的推廣也有著決定性意義。通過相關(guān)資料的檢索，目前國內(nèi)外對11a羥基坎利酮的合成主要有以下幾種方 法第一種方法以表氫化可的松作為起始原料合成，路線如下 第二種方法以雙酮為起始原料進(jìn)行11 a羥化后再合成，路線如下 第三種方法以坎利酮為起始原料進(jìn)行11 a羥化即得，路線如下 坎利酮Ila羥基坎利酮上述三種方法，第一種方法主要存在合成路線長，污染大，收率低，成本高，降低成 本的空間較少等缺點(diǎn)；第二種方法既需要生物技術(shù)又有較長的合成路線，存在生物轉(zhuǎn)化酶 專一性差，投料濃度低，同時(shí)還存在污染大，降低成本的空間有限等缺點(diǎn)；相比上述二種方 法，第三種方法的優(yōu)勢非常明顯，主要表現(xiàn)在用生物技術(shù)一步即得產(chǎn)品，具有線路短，污染 少等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在常用轉(zhuǎn)化酶(像黒根酶、梨頭酶、綠僵酶等)對坎利酮專一性差 (50%)左右、投料濃度低(0.3%左右)、收率低(30%左右)等缺點(diǎn)，相比前二種方法，第三 種方法降低成本的潛力是巨大的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種11 α羥基坎利酮的合成方法，更具體地，是 解決上述第三種合成方法的轉(zhuǎn)化酶對坎利酮專一性差、投料濃度低和收率低的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案一種11 α羥基坎利酮的合成方法，將原料坎利酮加入至培養(yǎng) 基，投入赭曲霉菌種發(fā)酵，再從菌絲體提取，精制得到Ila羥基坎利酮；所述的赭曲霉菌種 采用下述步驟得到1)、赭曲霉原菌種經(jīng)紫外線波長為200 280nm，照射10 30分鐘后培養(yǎng)出突變 優(yōu)異菌種；2)、將步驟(1)得到的赭曲霉菌種加入傳代固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配比0. 05 0. 15%蛋白胨、1 3%麥芽糖、1 3%葡萄糖、1. 5 2. 5%瓊脂，調(diào)節(jié)pH在4. 8 6，并在 條件為25 30°C，培養(yǎng)7 10天，經(jīng)三代傳代得到三代赭曲霉菌種，5°C以下低溫冷凍儲 存；3)、配置液體培養(yǎng)基，其配比為葡萄糖0. 5 1. 5%，蛋白胨0. 5 1. 5%，酵母浸 膏0.5 1.5%，玉米漿0.5 1.5%，調(diào)節(jié)pH在5. 5 6. 1，并滅菌，按5 10%的接種量 接種上述三代赭曲霉菌種，培養(yǎng)溫度控制在25 32°C下，轉(zhuǎn)速為100 200r/min，pH控制 在5 6之間，培養(yǎng)時(shí)間20 30小時(shí)。優(yōu)選地，本發(fā)明的合成方法包括下述步驟1)、將配比為坎利酮0.8%、丙二醇2%、吐溫80 1 %，加熱溶解作為底物，投了 已培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基中發(fā)酵；所述的發(fā)酵溫度控制在29. 5 30. 5°C，轉(zhuǎn)速為150r/min， PH控制在6 7之間，培養(yǎng)48 72小時(shí)，測轉(zhuǎn)化率超過85%后加熱滅菌；2)、將上述發(fā)酵后的培養(yǎng)液，經(jīng)過離心機(jī)菌液分離，獲得的菌絲體加入2. 5%的二 氯甲烷萃取3-4次，棄菌絲體殘?jiān)徽麴s回收溶劑二氯甲烷后，加入0.5%甲苯，冷卻結(jié)晶精 制，得到11 α-羥基坎利酮。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述的赭曲霉菌種采用下述步驟得到1)、赭曲霉原菌種經(jīng)紫外線波長為254nm照射15分鐘后，培養(yǎng)出突變優(yōu)異菌種；2)、將步驟(1)得到的赭曲霉菌種加入傳代固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配比蛋白胨、 2%麥芽糖 、2%葡萄糖、2%瓊脂，調(diào)節(jié)pH至5. 3，并在條件為25 30°C，培養(yǎng)7 10天， 經(jīng)三代傳代得到三代赭曲霉菌種，5°C以下低溫冷凍儲存；3)、配置液體培養(yǎng)基，其配比為葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，玉米漿 1 %，調(diào)節(jié)PH至5. 8，并滅菌，按7 %的接種量接種三代赭曲霉菌種，培養(yǎng)溫度控制在28 29°C下，轉(zhuǎn)速為150r/min，pH控制在5 6之間，培養(yǎng)時(shí)間20 26小時(shí)。本發(fā)明有益效果本發(fā)明就是基于上述技術(shù)方案，克服三種合成方法缺陷，采用生 物合成技術(shù)，遴選出新型轉(zhuǎn)化酶，使其達(dá)到對底物專一性好，投料濃度高，產(chǎn)物收率高的目 的，從而大大降低Ila羥基坎利酮的成本。上述技術(shù)方案的實(shí)施得到的新型轉(zhuǎn)化酶對坎 利酮的專一性從以前的75%提高到現(xiàn)在的85%以上；坎利酮的投料濃度從0. 6%提高到 0.8%以上；11 α羥基坎利酮收率從50%提高到現(xiàn)在的60%以上；11 α羥基坎利酮主要質(zhì) 量指標(biāo)達(dá)到含量(HPLC)彡98%，總雜質(zhì)彡2.0%，單一雜質(zhì)峰彡1.5%。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步地詳細(xì)地描述，但本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不限于此。實(shí)施例1一種11 α羥基坎利酮的合成方法，將原料坎利酮、丙二醇和吐溫80加熱溶解配制 成底物加入到培養(yǎng)基中，并投入赭曲霉菌種發(fā)酵，發(fā)酵完成后，再從菌絲體提取，精制得到 Ila羥基坎利酮。具體包括1)、菌種的遴選赭曲霉(原菌種)經(jīng)人工誘導(dǎo)(波長為254nm的紫外線照射15 分鐘紫外線)和自然突變成對底物坎利酮選擇性高的優(yōu)良赭曲霉菌種后冷凍干燥管低溫 保存。 2)、菌種的培養(yǎng)傳代固體培養(yǎng)基配比0. 07 %蛋白胨、1 %麥芽糖、1. 5 %葡萄糖、 2. 5%瓊脂，調(diào)節(jié)pH至5. 2，培養(yǎng)條件25°C，培養(yǎng)7天，取經(jīng)三代傳代得到生產(chǎn)所用菌種，并 在5°C以下低溫冷凍儲存?zhèn)溆谩?)、發(fā)酵菌種的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配比葡萄糖1. 1 %，蛋白胨0. 8 %，酵母浸膏 1 %，玉米漿1 %，調(diào)節(jié)PH至5. 6培養(yǎng)基滅菌后，按6 %的接種量接種三代赭曲霉菌種，培養(yǎng) 溫度控制在28-29°C下150r/min (轉(zhuǎn)速)，pH控制在5_6之間，培養(yǎng)時(shí)間22小時(shí)，菌檢。4)、發(fā)酵將配比為坎利酮0. 8 %，丙二醇2 %和吐溫801 %底物加熱溶解后，投了 已培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基中。發(fā)酵條件溫度控制在29. 5°C 150r/min (轉(zhuǎn)速)，pH控制在6 7之間，培養(yǎng)52小時(shí)。后測轉(zhuǎn)化率超過85%后加熱滅菌。5)、提取，精制經(jīng)過離心機(jī)菌液分離，菌絲體加入2. 5%的二氯甲烷萃取3次，棄 菌絲體殘?jiān)?。蒸餾回收溶劑二氯甲烷后，加入0.5%甲苯，冷卻結(jié)晶精制，得到Ila羥基坎 利酮，含量98. 1%0實(shí)施例2一種11 α羥基坎利酮的合成方法，將原料坎利酮、丙二醇和吐溫80加熱溶解配制成底物加入到培養(yǎng)基中，并投入赭曲霉菌種發(fā)酵，發(fā)酵完成后，再從菌絲體提取，精制得到 Ila羥基坎利酮。具體包括1、菌種的遴選赭曲霉(原菌種)經(jīng)人工誘導(dǎo)(波長為254nm的紫外線照射15分 鐘紫外線)和自然突變成對底物坎利酮選擇性高的優(yōu)良赭曲霉菌種后冷凍干燥管低溫保
存。 2、菌種的培養(yǎng)傳代固體培養(yǎng)基配比0. 蛋白胨、2%麥芽糖、2%葡萄糖、2% 瓊脂，調(diào)節(jié)PH至5. 3，培養(yǎng)條件25-30°C，培養(yǎng)9天，取經(jīng)三代傳代得到生產(chǎn)所用菌種，并在 5 0C以下低溫冷凍儲存?zhèn)溆谩?、發(fā)酵菌種的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配比葡萄糖1 %，蛋白胨1 %，酵母浸膏1 %，玉米 漿1 %，調(diào)節(jié)PH至5. 8，再塞上棉塞蓋8層紗布，再在紗布上加一層牛皮紙，高溫121°C滅菌 30min，按7%的接種量接種三代赭曲霉菌種，放入搖床培養(yǎng)溫度控制在29°C，150r/min (轉(zhuǎn) 速)，PH控制在5-6之間，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)，菌檢。4、發(fā)酵將配比為坎利酮0.8%，丙二醇2%和吐溫80 底物加熱溶解后，投了 已培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基中。發(fā)酵條件溫度控制在30°C，150r/min (轉(zhuǎn)速)，pH控制在6 7 之間，培養(yǎng)72小時(shí)。后測轉(zhuǎn)化率超過85%后加熱滅菌。5、提取，精制經(jīng)過離心機(jī)菌液分離，菌絲體加入2. 5%的二氯甲烷萃取4次，棄菌 絲體殘?jiān)?。蒸餾回收溶劑二氯甲烷后，加入0. 5%甲苯，冷卻結(jié)晶抽濾精制，得到11 a -羥基 坎利酮，含量為98.6%。實(shí)施例3一種11 α羥基坎利酮的合成方法，將原料坎利酮、丙二醇和吐溫80加熱溶解配制 成底物加入到培養(yǎng)基中，并投入赭曲霉菌種發(fā)酵，發(fā)酵完成后，再從菌絲體提取，精制得到 11 α-羥基坎利酮。具體包括1、菌種的遴選赭曲霉(原菌種)經(jīng)人工誘導(dǎo)(波長為254nm的紫外線照射18分 鐘紫外線)和自然突變成對底物坎利酮選擇性高的優(yōu)良赭曲霉菌種后冷凍干燥管低溫保存。2、菌種的培養(yǎng)傳代固體培養(yǎng)基配比0. 12%蛋白胨、1.5%麥芽糖、2. 5%葡萄 糖、1. 8%瓊脂，調(diào)節(jié)pH至5. 0，培養(yǎng)條件25-30°C，培養(yǎng)7天，取經(jīng)三代傳代得到生產(chǎn)所用 菌種，并在5°C以下低溫冷凍儲存?zhèn)溆谩?、發(fā)酵菌種的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配比葡萄糖1.3%，蛋白胨1. 1%，酵母浸膏 0.9%,玉米漿0. 9%，調(diào)節(jié)pH至5. 8，再塞上棉塞蓋8層紗布，再在紗布上加一層牛皮紙，高 溫125°C滅菌30min，按7%的接種量接種三代赭曲霉菌種，放入搖床培養(yǎng)溫度控制在29°C， 150r/min (轉(zhuǎn)速)，pH控制在5-6之間，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)，菌檢。4、發(fā)酵將配比為坎利酮0.8%，丙二醇2%和吐溫80 底物加熱溶解后，投了 已培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基中。發(fā)酵條件溫度控制在30°C，150r/min (轉(zhuǎn)速)，pH控制在6. 5之 間，培養(yǎng)72小時(shí)。后測轉(zhuǎn)化率超過85%后加熱滅菌。5、提取，精制經(jīng)過離心機(jī)菌液分離，菌絲體加入2. 5%的二氯甲烷萃取3次，棄菌 絲體殘?jiān)Ｕ麴s回收溶劑二氯甲烷后，加入0. 5%甲苯，冷卻結(jié)晶抽濾精制，得到11 a -羥基 坎利酮，含量為98.0%。
權(quán)利要求
一種11α羥基坎利酮的合成方法，其特征在于，該合成方法將原料坎利酮、丙二醇和吐溫80加熱溶解配制成底物加入到培養(yǎng)基中，并投入赭曲霉菌種發(fā)酵，發(fā)酵完成后，再從菌絲體提取精制得到11α羥基坎利酮；所述的赭曲霉菌種采用下述步驟得到1)、將赭曲霉原菌種經(jīng)波長為200nm～280nm紫外線照射10～30小時(shí)；2)、將步驟(1)得到的赭曲霉菌種加入傳代固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配比0.05～0.15％蛋白胨、1～3％麥芽糖、1～3％葡萄糖、1.5～2.5％瓊脂，調(diào)節(jié)pH在4.8～6，并在條件為25～30℃，培養(yǎng)7～10天，經(jīng)三代傳代得到三代赭曲霉菌種，5℃以下低溫冷凍儲存；3)、配置液體培養(yǎng)基，其配比為葡萄糖0.5～1.5％，蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸膏0.5～1.5％，玉米漿0.5～1.5％，調(diào)節(jié)pH在5.5～6.1，并滅菌，按5～10％的接種量接種三代赭曲霉菌種，培養(yǎng)溫度控制在25～32℃下，轉(zhuǎn)速為100～200r/min，pH控制在5～6之間，培養(yǎng)時(shí)間20～30小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的11a羥基坎利酮的合成方法，其特征在于包括下述步驟1)、發(fā)酵將配比為坎利酮0.8%、丙二醇2%、吐溫801%，加熱溶解作為底物，投入 已培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基中發(fā)酵；所述的發(fā)酵溫度控制在29. 5 30. 5°C，轉(zhuǎn)速為150r/min， pH控制在6 7之間，培養(yǎng)48 72小時(shí)，轉(zhuǎn)化率超過85%后加熱滅菌；2)、菌絲體提取精制將上述發(fā)酵后的培養(yǎng)液，經(jīng)過離心機(jī)菌液分離，獲得的菌絲體加 入2. 5fft %的二氯甲烷萃取3-4次，棄菌絲體殘?jiān)?；蒸餾回收溶劑二氯甲烷后，加入0. 5fft % 甲苯，冷卻結(jié)晶精制，得到11a羥基坎利酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的11a羥基坎利酮的合成方法，其特征在于，所述的赭曲霉菌 種采用下述步驟得到1)、將赭曲霉原菌種經(jīng)波長254nm的紫外線照射15min；2)、將步驟(1)得到的赭曲霉菌種加入傳代固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配比蛋白胨、2% 麥芽糖、2%葡萄糖、2%瓊脂，調(diào)節(jié)pH至5. 3，并在條件為25 30°C，培養(yǎng)7 10天，經(jīng)三 代傳代得到三代赭曲霉菌種，5°C以下低溫冷凍儲存；3)、配置液體培養(yǎng)基，其配比為葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，玉米漿1%，調(diào) 節(jié)pH至5. 8，并滅菌，按7%的接種量接種三代赭曲霉菌種，培養(yǎng)溫度控制在28 29°C下， 轉(zhuǎn)速為150r/min，pH控制在5 6之間，培養(yǎng)時(shí)間20 26小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種11α羥基坎利酮的合成方法，該方法是將坎利酮、丙二醇和吐溫80加熱溶解配制成底物加入到培養(yǎng)基中，并投入赭曲霉菌種發(fā)酵，發(fā)酵完成后，再從菌絲體提取精制得到11α羥基坎利酮；本發(fā)明采用生物合成技術(shù)，遴選出新型轉(zhuǎn)化酶，從而大大降低11α羥基坎利酮的成本。該新型轉(zhuǎn)化酶對坎利酮的專一性從以前的75％提高到現(xiàn)在的85％以上；坎利酮的投料濃度從0.6％提高到0.8％以上；11α羥基坎利酮收率從50％提高到現(xiàn)在的60％以上；11α羥基坎利酮主要質(zhì)量指標(biāo)達(dá)到含量(HPLC)≥98％，總雜質(zhì)≤2.0％，單一雜質(zhì)峰≤1.5％。
文檔編號C12R1/66GK101845474SQ20101017849
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者王喜情 申請人:臺州南峰藥業(yè)有限公司