專利名稱：用一株金黃色芽孢桿菌作為合成聚羥基丁酸酯的菌種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。
聚羥基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate，簡稱PHB)是由細(xì)菌合成的一種生物聚酯，在細(xì)菌胞內(nèi)以內(nèi)含物形式呈顆粒狀存在。其具備的成塑性，力學(xué)性能與目前所大量應(yīng)用的石油塑料相似，而PHB具有生物可降解性。所以用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)的PHB被認(rèn)為是一種“生物可降解塑料”而倍受重視。已有的生產(chǎn)聚羥基丁酸酯的菌種，如羅氏真養(yǎng)菌Ralstonia eutropha、巨大產(chǎn)堿菌Alcaligenes latus、維氏固氮菌Azotobactervinelandii等，都能用于PHB的工業(yè)生產(chǎn)，但其生產(chǎn)速度還不盡人意。
本發(fā)明的目的在于為克服已有技術(shù)的不足之處，尋找到一株新的PHB菌株一金黃色芽孢桿菌Bacillus aureus，在相似的條件下，比上述菌種獲得更快的生長速度，并可進(jìn)一步通過選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，得到高產(chǎn)量的聚羥基丁酸酯PHB，從而得到低成本的生物可降解塑料。
本發(fā)明提出用一株金黃色芽孢桿菌作為合成可降解生物材料聚羥基丁酸酯的菌種。
本發(fā)明還提出用金黃色芽孢桿菌生產(chǎn)聚羥基丁酸酯的方法，其特征在于，所用的培養(yǎng)基包括先用糖蜜、蔗糖、葡萄糖或淀粉中的任一種作生長碳源，然后再用糖蜜、蔗糖、葡萄糖或淀粉作聚羥基丁酸酯的合成碳源培養(yǎng)基。
本發(fā)明通過選擇合適的培養(yǎng)條件可以得到高產(chǎn)量的聚羥基丁酸酯，合適的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基及其濃度、通氧量、培養(yǎng)時間、pH值及合成PHB的底物等。該株金黃色芽孢桿菌在不同的生長時期形態(tài)存在較大的差異，該方法的培養(yǎng)溫度可在28～42℃范圍內(nèi)。該培養(yǎng)基所用pH值可在6.0～8.0范圍內(nèi)。
以糖蜜為培養(yǎng)基時，合適的糖蜜濃度可達(dá)到220g/L；在菌株生長時期通氧量較，大，pH值一般在6.5～7.5之間。一般在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)前期可得到大量的菌株，之后可以進(jìn)入PHB的大量積累階段。一般先由金黃色芽孢桿菌利用便宜的廢糖蜜為底物大量生長，再利用蔗糖為底物大量合成聚羥基丁酸酯的工藝，可大大提高PHB的收率。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果本發(fā)明所述的金黃色芽孢桿菌可以在以糖蜜為單一營養(yǎng)物中快速生長并合成PHB，在8小時內(nèi)細(xì)胞干重可達(dá)26g/L,PHB含量占細(xì)胞干重的19％金黃色芽孢桿菌可以在以蔗糖為碳源的礦物培養(yǎng)基中高產(chǎn)PHB,PHB的含量占細(xì)胞干重的70-80％金黃色芽孢桿菌先利用便宜的廢糖蜜為底物大量生長，再利用蔗糖為底物大量合成聚羥基丁酸酯，在50小時細(xì)胞干重達(dá)到76g/L,PHB含量75％。
利用金黃色芽孢桿菌，采用合適的發(fā)酵方法，可以在廢糖蜜中快速形成生物量，并生產(chǎn)PHB。在蔗糖中，該菌可高效合成PHB到占細(xì)胞干重的70-80％。在不改變發(fā)酵設(shè)備的情況下可以降低聚羥基丁酸酯PHB的生產(chǎn)成本。另一方面，金黃色芽孢桿菌可先利用便宜的廢糖蜜為底物大量生長，再利用蔗糖為底物大量PHB，這樣可大大提高PHB的收率。降低生物可降解塑料PHB的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明提出四種用金黃色芽孢桿菌生產(chǎn)聚羥基丁酸酯的方法的實施例實施例1金黃色芽孢桿菌在糖蜜中的生長和PHB的積累菌種金黃色芽孢桿菌培養(yǎng)溫度30℃；培養(yǎng)基糖蜜(作為唯一的培養(yǎng)基)培養(yǎng)基濃度180g/L；通氣量4-7升/分，開始發(fā)酵時的通氣量為4升/分，以后隨細(xì)菌密度的增加而慢慢增加)發(fā)酵時間40小時；本實施例的生產(chǎn)工藝流程如下金黃色芽孢桿菌在5L的發(fā)酵罐，30℃下，180g/L的糖蜜中通空氣發(fā)酵培養(yǎng)40小時(通氣量為4-7升/分，開始發(fā)酵時的通氣量為4升/分，后慢慢增加)，在12、16、20小時后分別補400、300、300ml含糖蜜濃度為500g/L的培養(yǎng)基。在發(fā)酵結(jié)束后對所取樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和PHB含量的數(shù)據(jù)。
發(fā)酵40小時后得到的細(xì)胞干重最大值為50g/L，與之相對應(yīng)的PHB占細(xì)胞干重百分含量為17％。
實施例2通氣量對金黃色芽孢桿菌在糖蜜中的生長的影響菌種金黃色芽孢桿菌；培養(yǎng)溫度36℃；培養(yǎng)基糖蜜培養(yǎng)基濃度180g/L；通氣量保持7升/分發(fā)酵時間8小時；本實施例的生產(chǎn)工藝流程如下
金黃色芽孢桿菌在5L的發(fā)酵罐，36℃下，180g/L的糖蜜中通空氣發(fā)酵培養(yǎng)8小時(通氣量保持7升/分)。在發(fā)酵結(jié)束后對所取樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和PHB含量的數(shù)據(jù)。
在8小時后細(xì)胞干重達(dá)到26g/L，與之相對應(yīng)的PHB百分含量為19％。
實施例3金黃色芽孢桿菌在蔗糖中的生長和PHB的積累菌種金黃色芽孢桿菌；培養(yǎng)溫度32℃；培養(yǎng)基蔗糖90g/L(流加)；培養(yǎng)基蔗糖起始濃度2g/L；起始磷含量1.8g/L；起始氮含量1.3g/L；發(fā)酵時間50小時；本實施例的生產(chǎn)工藝流程如下金黃色芽孢桿菌在5L的發(fā)酵罐，32℃下，在流加的蔗糖濃度約為2g/L中發(fā)酵培養(yǎng)50小時(通氣量保持5升/分)。在發(fā)酵結(jié)束后對所取樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和PHB含量的數(shù)據(jù)。
在50小時后細(xì)胞干重達(dá)到31g/L，與之相對應(yīng)的PHB百分含量為78％。
實施例4金黃色芽孢桿菌在糖蜜中的生長和在蔗糖中PHB的積累菌種金黃色芽孢桿菌；培養(yǎng)溫度37℃；培養(yǎng)基糖蜜(220g/L)、蔗糖(90g/L，流加)；通氣量保持7升/分發(fā)酵時間50小時；本實施例的生產(chǎn)工藝流程如下金黃色芽孢桿菌在5L的發(fā)酵罐，37℃下，在220g/L的糖蜜中生長20小時后，連續(xù)流加入蔗糖20小時，發(fā)酵培養(yǎng)50小時。在發(fā)酵結(jié)束后對所取樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和PHB含量的數(shù)據(jù)。
在50小時后細(xì)胞干重達(dá)到76g/L，與之相對應(yīng)的PHB百分含量為75％。
權(quán)利要求
1.用一株金黃色芽孢桿菌作為合成聚羥基丁酸酯的菌種。
2.一種用金黃色芽孢桿菌生產(chǎn)聚羥基丁酸酯的方法，其特征在于，所用的培養(yǎng)基包括先用糖蜜、蔗糖、葡萄糖或淀粉中的任一種作生長碳源，然后再用糖蜜、蔗糖、葡萄糖或淀粉作聚羥基丁酸酯的合成碳源培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求2所述的用金黃色芽孢桿菌生產(chǎn)聚羥基丁酸酯的方法，其特征在于，培養(yǎng)溫度在28～42℃范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求2所述的用金黃色芽孢桿菌生產(chǎn)聚羥基丁酸酯的方法，其特征在于培養(yǎng)基所用pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。包括用一株金黃色芽孢桿菌作為合成可降解生物材料聚羥基丁酸酯PHB的菌種。所用的培養(yǎng)基包括先用糖蜜、蔗糖、葡萄糖或淀粉中的任一種作生長碳源，然后再用糖蜜、蔗糖、葡萄糖或淀粉作聚羥基丁酸酯的合成碳源培養(yǎng)基。本發(fā)明可在廢糖蜜中快速形成生物量，并生產(chǎn)PHB，在不改變發(fā)酵設(shè)備的情況下可以降低聚羥基丁酸酯PHB的生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P7/62GK1238382SQ99109820
公開日1999年12月15日 申請日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者吳瓊, 黃鴻華, 陳金春, 陳國強 申請人:清華大學(xué)