專利名稱：一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備球菌素的發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素(NISIN)可以抑制、殺死格蘭仕陽性細菌及其芽孢，作為有機多肽可 以被人體降解，其作為生物防腐劑已經(jīng)開始進入食品加工行業(yè)。我國衛(wèi)生部食品監(jiān)督廳于 1990年1月19日簽發(fā)了應用Nisin作為食品保藏劑的使用合格證書，1990年3月29日 Nisin被列入國際GB2760-86的1990增補品種，規(guī)定了質(zhì)量標準。目前，乳酸鏈球菌素的生產(chǎn)廠家主要是使用酵母膏、甘蔗糖、蛋白胨等為發(fā)酵原 料，配置培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)，但是由于所使用的原材料價格高，致使乳酸鏈球菌素的生產(chǎn) 成本居高不下，很難廣泛應用到食品領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有乳酸鏈球菌素發(fā)酵生產(chǎn)存在成本高的問題，而提供 了 一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝。制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝按以下步驟實現(xiàn)一、將Ikg玉米加入到1. 5L水中， 在50°C下浸泡60h，然后取5mL玉米浸泡水，使用無菌水進行梯度稀釋，每次稀釋10倍，一 共稀釋3次，再將這3種不同濃度的稀釋液涂到完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，然后挑取不同的單 菌落分別進行擴大培養(yǎng)，28h后測效價，選取發(fā)酵效價達到2000IU/ml的菌株，再進行擴大 培養(yǎng)，獲得含乳酸菌的菌液；二、制備發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接入含乳酸菌的菌液，并用質(zhì)量濃度 為15%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6. 5 7. 5，發(fā)酵20h后得含有800(Tl5000IU/ml乳酸鏈球菌 素的發(fā)酵液，即完成乳酸鏈球菌素的發(fā)酵；其中步驟一中完全培養(yǎng)基由IOg的蛋白胨、3g的 酵母膏、5g的氯化鈉和17g的瓊脂粉溶于IOOOmL的蒸餾水中組成；步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基由 2飛g的玉米淀粉葡萄糖漿、0. 5^2g的玉米蛋白、0. Γ0. 3g的甘蔗糖蜜、廣5g的玉米浸泡水、 0. rig的酵母抽提物、0. οΓο. 05g的硫酸鎂、0. rig的磷酸二氫鉀、0. οΓο. 05g的氯化鈉 和Img的生物素溶于IOOOmL的去離子水中組成，120°C滅菌30min，pH值為7. 0 ；步驟二中 菌液的接種量為3%。本發(fā)明以玉米深加工產(chǎn)品作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料，輔助添加一些營養(yǎng)物質(zhì)，進行發(fā) 酵，效價能達到800(Tl5000IU/ml ；本發(fā)明中原料來源廣泛、價格低，
所用玉米深加工產(chǎn)品都要比其它原材料價格低，如玉米淀粉葡萄糖比甘蔗糖價格低 50%飛0%，玉米蛋白比蛋白胨價格低609Γ70%，玉米浸泡水減少50%的酵母膏用量，可使生產(chǎn) 乳酸鏈球菌素的總原材料成本下降409Γ50%，適合大規(guī)模生產(chǎn)，使乳酸鏈球菌素作為生物防 腐劑能夠更廣泛的應用到食品加工領(lǐng)域，提升人們的生活質(zhì)量。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的
3任意組合。
具體實施方式
一本實施方式制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝按以下步驟實現(xiàn) 一、將Ikg玉米加入到1. 5L水中，在50°C下浸泡60h，然后取5mL玉米浸泡水，使用無菌水進 行梯度稀釋，每次稀釋10倍，一共稀釋3次，再將這3種不同濃度的稀釋液涂到完全培養(yǎng)基 平板上培養(yǎng)，然后挑取不同的單菌落分別進行擴大培養(yǎng)，28h后測效價，選取發(fā)酵效價達到 2000IU/ml的菌株，再進行擴大培養(yǎng)，獲得含乳酸菌的菌液；二、制備發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接入 含乳酸菌的菌液，并用質(zhì)量濃度為15%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6. 5^7. 5，發(fā)酵20h后得含有 800(Tl5000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液，即完成乳酸鏈球菌素的發(fā)酵；其中步驟一中完 全培養(yǎng)基由IOg的蛋白胨、3g的酵母膏、5g的氯化鈉和17g的瓊脂粉溶于IOOOmL的蒸餾水 中組成；步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基由2飛g的玉米淀粉葡萄糖漿、0. 5^2g的玉米蛋白、0. Γ0. 3g 的甘蔗糖蜜、廣5g的玉米浸泡水、0.廣Ig的酵母抽提物、0.0廣0. 05g的硫酸鎂、0.廣Ig的磷 酸二氫鉀、0. ΟΓΟ. 05g的氯化鈉和Img的生物素溶于IOOOmL的去離子水中組成，120°C滅菌 30min, pH值為7. 0 ；步驟二中菌液的接種量為3%。本實施方式步驟二發(fā)酵過程中，要監(jiān)測含糖量，以便及時補加葡萄糖。本實施方式步驟二中玉米淀粉葡萄糖漿為食用糖漿；玉米蛋白的蛋白含量為60% 以上；甘蔗糖蜜的含糖量為45% ；玉米浸泡水為21波美；酵母抽提物來源于安琪酵母；硫酸 鎂采用國家標準；磷酸二氫鉀采用國標標準；氯化鈉采用食用鹽；生物素購買自日本味之 素公司。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中玉米淀粉葡萄 糖漿以及玉米蛋白的制備a、按體積比70 30將清水與玉米浸泡水混合，然后浸入5kg 玉米，在50°C下浸泡50h，然后過濾出浸出液，真空濃縮到21波美；b、浸泡后的玉米經(jīng)脫脂 磨研磨、過濾分離出胚芽，再經(jīng)針磨研磨、過濾分離出纖維，得到蛋白和淀粉的粗漿，分離后 的懸浮物經(jīng)過干燥即得玉米蛋白；C、分離后的沉淀物為淀粉乳漿，調(diào)整濃度到16波美、pH 值5. 0 5· 8、溫度3(T40°C，加入液化酶，升溫至105 108°C，Smin后閃蒸降溫至99 100°C， 90min后使用調(diào)節(jié)pH值至4. (Γ4. 5，加入糖化酶糖化36飛0h，然后使用板框過濾糖化液，即 得玉米淀粉葡萄糖漿；其中步驟a中玉米采用自然晾曬無霉變顆粒的膠質(zhì)玉米；步驟b中 玉米蛋白的含水率為8% 10%。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二中發(fā)酵培養(yǎng) 基由2g的玉米淀粉葡萄糖漿、0. 5g的玉米蛋白、0. Ig的甘蔗糖蜜、Ig的玉米浸泡水、0. Ig 的酵母抽提物、0. Olg的硫酸鎂、0. Ig的磷酸二氫鉀、0. Olg的氯化鈉和Img的生物素溶于 IOOOmL的去離子水中組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二中發(fā)酵培養(yǎng) 基由6g的玉米淀粉葡萄糖漿、2g的玉米蛋白、0. 3g的甘蔗糖蜜、5g的玉米浸泡水、Ig的酵 母抽提物、0. 05g的硫酸鎂、Ig的磷酸二氫鉀、0. 05g的氯化鈉和Img的生物素溶于IOOOmL 的去離子水中組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二中發(fā)酵培 養(yǎng)基由3 5g的玉米淀粉葡萄糖漿、0. 8^1. 5g的玉米蛋白、0. 15^0. 25g的甘蔗糖蜜、2、g 的玉米浸泡水、0. 3 0. Sg的酵母抽提物、0. 02 0. 04g的硫酸鎂、0. 3 0. Sg的磷酸二氫鉀、 0. 02、. 04g的氯化鈉和Img的生物素溶于IOOOmL的去離子水中組成。其它步驟及參數(shù)與
具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二中發(fā)酵培 養(yǎng)基由4g的玉米淀粉葡萄糖漿、Ig的玉米蛋白、0. 2g的甘蔗糖蜜、3g的玉米浸泡水、0. 5g 的酵母抽提物、0. 03g的硫酸鎂、0. 5g的磷酸二氫鉀、0. 03g的氯化鈉和Img的生物素溶于 IOOOmL的去離子水中組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟二中發(fā)酵 20h后得含有8000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至六 之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟二中發(fā)酵 20h后得含有15000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至六 之一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟二中發(fā)酵 20h后得含有900(Tl2000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟二中發(fā)酵 20h后得含有11000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至六 之一相同。
具體實施方式
十一本實施方式制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝按以下步驟實現(xiàn) 一、將Ikg玉米加入到1.5L水中，在50°C下浸泡60h，然后取5mL玉米浸泡水，使用無菌水 進行梯度稀釋，每次稀釋10倍，一共稀釋3次，再將這3種不同濃度的稀釋液涂到完全培 養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，然后挑取不同的單菌落分別進行擴大培養(yǎng)，28h后測效價，選取發(fā)酵效價 達到2000IU/ml的菌株，再進行擴大培養(yǎng)，獲得含乳酸菌的菌液；二、制備發(fā)酵培養(yǎng)基，然后 接入含乳酸菌的菌液，并用質(zhì)量濃度為15%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7，發(fā)酵20h后得含有 15000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液，即完成乳酸鏈球菌素的發(fā)酵；其中步驟一中完全培養(yǎng) 基由IOg的蛋白胨、3g的酵母膏、5g的氯化鈉和17g的瓊脂粉溶于IOOOmL的蒸餾水中組成； 步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基4g的玉米淀粉葡萄糖漿、Ig的玉米蛋白、0. 2g的甘蔗糖蜜、3g的玉米 浸泡水、0. 5g的酵母抽提物、0. 03g的硫酸鎂、0. 5g的磷酸二氫鉀、0. 03g的氯化鈉和Img的 生物素溶于IOOOmL的去離子水中組成，120°C滅菌30min，pH值為7. 0 ；步驟二中菌液的接 種量為3%。本實施方式采用50L發(fā)酵罐，發(fā)酵記錄見表1，可知，在發(fā)酵20h后發(fā)酵效價達 15000IU/m。表 權(quán)利要求
一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝，其特征在于制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝按以下步驟實現(xiàn)一、將1kg玉米加入到1.5L水中，在50℃下浸泡60h，然后取5mL玉米浸泡水，使用無菌水進行梯度稀釋，每次稀釋10倍，一共稀釋3次，再將這3種不同濃度的稀釋液涂到完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，然后挑取不同的單菌落分別進行擴大培養(yǎng)，28h后測效價，選取發(fā)酵效價達到2000IU/ml的菌株，再進行擴大培養(yǎng)，獲得含乳酸菌的菌液；二、制備發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接入含乳酸菌的菌液，并用質(zhì)量濃度為15%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.5~7.5，發(fā)酵20h后得含有8000~15000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液，即完成乳酸鏈球菌素的發(fā)酵；其中步驟一中完全培養(yǎng)基由10g的蛋白胨、3g的酵母膏、5g的氯化鈉和17g的瓊脂粉溶于1000mL的蒸餾水中組成；步驟二中發(fā)酵培養(yǎng)基由2~6g的玉米淀粉葡萄糖漿、0.5~2g的玉米蛋白、0.1~0.3g的甘蔗糖蜜、1~5g的玉米浸泡水、0.1~1g的酵母抽提物、0.01~0.05g的硫酸鎂、0.1~1g的磷酸二氫鉀、0.01~0.05g的氯化鈉和1mg的生物素溶于1000mL的去離子水中組成，120℃滅菌30min，pH值為7.0；步驟二中菌液的接種量為3%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝，其特征在于步驟二中玉 米淀粉葡萄糖漿以及玉米蛋白的制備a、按體積比70 30將清水與玉米浸泡水混合，然 后浸入5kg玉米，在50°C下浸泡50h，然后過濾出浸出液，真空濃縮到21波美；b、浸泡后的 玉米經(jīng)脫脂磨研磨、過濾分離出胚芽，再經(jīng)針磨研磨、過濾分離出纖維，得到蛋白和淀粉的 粗漿，經(jīng)離心機分離，分離后的懸浮物經(jīng)過干燥即得玉米蛋白；C、分離后的沉淀物為淀粉乳 漿，調(diào)整濃度到16波美、pH值5. (Γ5. 8、溫度3(T40°C，加入液化酶，升溫至105 108°C，8min 后閃蒸降溫至99 100°C，90min后使用調(diào)節(jié)pH值至4. (Γ4. 5，加入糖化酶糖化36飛0h，然后 使用板框過濾糖化液，即得玉米淀粉葡萄糖漿；其中步驟a中玉米采用自然晾曬無霉變顆 粒的膠質(zhì)玉米；步驟b中玉米蛋白的含水率為8% 109L
3.3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝，其特征在于步驟 二中發(fā)酵培養(yǎng)基由3 5g的玉米淀粉葡萄糖漿、0. 8^1. 5g的玉米蛋白、0. 15^0. 25g的甘蔗糖 蜜、2 4g的玉米浸泡水、0. 3^0. Sg的酵母抽提物、0. 02、. 04g的硫酸鎂、0. 3^0. Sg的磷酸二 氫鉀、0. 02、. 04g的氯化鈉和Img的生物素溶于IOOOmL的去離子水中組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝，其特征在于步驟二 中發(fā)酵培養(yǎng)基由4g的玉米淀粉葡萄糖漿、Ig的玉米蛋白、0. 2g的甘蔗糖蜜、3g的玉米浸泡 水、0. 5g的酵母抽提物、0. 03g的硫酸鎂、0. 5g的磷酸二氫鉀、0. 03g的氯化鈉和Img的生物 素溶于IOOOmL的去離子水中組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝，其特征在于步驟二中發(fā) 酵20h后得含有900(Tl2000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝，其特征在于步驟二中發(fā) 酵20h后得含有11000IU/ml乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液。
全文摘要
一種制備乳酸鏈球菌素的發(fā)酵工藝，它涉及一種制備球菌素的發(fā)酵工藝。本發(fā)明解決了現(xiàn)有乳酸鏈球菌素發(fā)酵生產(chǎn)存在成本高的問題。方法一、將玉米加到水中浸泡，取玉米浸泡水用無菌水進行梯度稀釋，涂到完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，然后挑取不同的單菌落分別進行擴大培養(yǎng)，測效價，選取發(fā)酵效價達到2000UI/ml的菌株，再擴大培養(yǎng)，得菌液；二、制備發(fā)酵培養(yǎng)基，接入菌液，調(diào)節(jié)pH值，發(fā)酵后得含乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液，即完成。本發(fā)明所用玉米深加工產(chǎn)品都要比其它原材料價格低，如玉米淀粉葡萄糖比甘蔗糖價格低50~60%，玉米蛋白比蛋白胨價格低60~70%，玉米浸泡水減少50%的酵母膏用量，可使生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的總原材料成本下降40~50%。
文檔編號C12R1/46GK101906453SQ201010254089
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者張國峰, 林永敏, 王迅行 申請人:環(huán)宇格林糧食開發(fā)有限公司