專利名稱：一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物表面活性劑的生產(chǎn)方法，尤其是涉及一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法。
背景技術：
脂肽又名脂酰肽，屬于含氨基酸類脂。脂肽類生物表面活性劑一般是革蘭氏陽性的芽孢桿菌的代謝物。脂肽分子由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學組成和兩親型分子結(jié)構(gòu)，脂肽類生物表面活性劑在醫(yī)藥、食品、化妝品及微生物采油等領域有重要的應用前景。脂肽類表面活性劑一般由革蘭氏陽性的芽孢桿菌代謝產(chǎn)生，能產(chǎn)生脂肽類表面活性劑的菌株有很多，如枯草芽孢桿菌(Bacillussu btilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslic heniformis)等。除了細菌可以產(chǎn)生脂肽類表面活性劑外，酵母、真菌也可以產(chǎn)生。脂肽類生物表面活性劑按其結(jié)構(gòu)分類可以分為環(huán)狀脂肽和線形脂肽兩大類。環(huán)狀脂肽。環(huán)狀脂肽是指分子中具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一類脂肽，肽鏈的C-端氨基酸的羧基與肽或脂肪酸中的氨基或羥基相連構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)形成環(huán)的成分的差異，又可將環(huán)狀脂肽分為脂肪酸成環(huán)的環(huán)狀脂肽、脂肪酸接環(huán)的環(huán)狀脂肽及脂肪酸離環(huán)的環(huán)狀脂肽。 含氨基酸類脂是以低縮氨基酸為親水基團的生物表面活性劑。典型產(chǎn)物有脂肽、脂蛋白、脂氨基酸。這是一類表面性能優(yōu)良的表面活性劑，其乳化性能好，去污能力強，與其他各種表面活性劑的相容性也很好，同時具有很好的抗菌性能。許多生物分子具有親水和親油基團，他們在性能上和化學合成的表面活性劑非常相似。通常把那些具有兩親性，表現(xiàn)出很高表面活性由微生物、動植物或植物產(chǎn)生的天然表面活性劑稱為生物表面活性劑(Biosurfactant，簡稱BS)。其中由微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑活性較高，具有很好的親水、親油性能和界面優(yōu)先分配能力，較為適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。但現(xiàn)有的表面活性劑，由于產(chǎn)量低、周期長、裝料系數(shù)低、工藝復雜等缺陷，能大規(guī)模生產(chǎn)的還不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供了一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，這種生產(chǎn)工藝具有產(chǎn)量高、效率高、裝料系數(shù)高、發(fā)酵周期短、工藝簡單，使產(chǎn)品綜合成本降低，完全適合工業(yè)化生產(chǎn)，對脂肽生物表面活性劑的推廣及大規(guī)模應用起到了重要的作用。本發(fā)明的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，是由枯草芽孢桿菌 ACCC01430經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制得，其具體步驟如下
A、將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種接入搖瓶培養(yǎng)，搖瓶中每500ml培養(yǎng)基接入1環(huán)菌種，溫度為35士2°C、120轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12 16小時，得到搖瓶菌種；
B、一級發(fā)酵培養(yǎng)將A步驟制得的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的一級發(fā)酵罐中，搖瓶菌種與培養(yǎng)基的體積比為1 19 20，在溫度為；35士2°C、pH6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5 及攪拌速度為100 150轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10 14小時，得到一級發(fā)酵菌種；
C、二級發(fā)酵培養(yǎng)將B步驟制得的一級發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的二級發(fā)酵罐中， 一級發(fā)酵菌種與培養(yǎng)基的體積比為1:10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5及攪拌速度為100 110轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10 14小時，得到二級發(fā)酵菌種；
D、發(fā)酵培養(yǎng)將C步驟制得的二級發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐中，二級發(fā)酵菌種與培養(yǎng)基的體積比為1 :10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0.3 0.5、 攪拌速度為80 100轉(zhuǎn)/分，在菌體處于衰落期進行補料，發(fā)酵培養(yǎng)M 沈小時，得到脂肽生物表面活性劑。作為本發(fā)明的進一步改進，搖瓶及各級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是米糠油2 5%、尿素 0. 2 1. 5%、糖蜜 10 15%,KCl 0. 05 1. 0%,KH2PO4 0. 05 1. 2%,K2HPO4 0. 05 1. 5%、 酵母膏0. 005 0. 1%、復合微量元素0. 005 0. 01%，余量為水，pH為6. 0 -7. 5 ；
所述的復合微量元素為硫酸鋅1. 1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅 1.0 g/L、氧化鈷1.0g/L及溶劑水復配而成。作為本發(fā)明的進一步改進，所述的補料是米糠油，每次補料量按發(fā)酵液總體積量的3% 5%補加。作為本發(fā)明的進一步改進，各級發(fā)酵罐的裝料系數(shù)是60 80%。一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，整個生產(chǎn)制備過程是逐級擴大發(fā)酵純培養(yǎng)的過程。得到的脂肽生物表面活性劑發(fā)酵液經(jīng)過殺菌和離心分離后，根據(jù)各種用途的需要純化成不同等級的產(chǎn)品，廣泛應用于三次采油、日化、農(nóng)藥、食品、土壤修復等行業(yè)。本發(fā)明的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，具有產(chǎn)量高、周期短、裝料系數(shù)高、工藝簡單等特點，實現(xiàn)了脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，其脂肽含量達到7 10%g/L，并取得了工業(yè)化生產(chǎn)實驗的成功，發(fā)酵周期縮短到48小時，大大降低了生產(chǎn)成本； 本發(fā)明首次將工業(yè)化生產(chǎn)的脂肽發(fā)酵液應用現(xiàn)場，將其注入地下油層，使原來難以注水的區(qū)塊水順利注入，并且使原油采收率提高了 5 12% ；效率高。


圖1為表面張力；
圖2生物脂肽表面活性劑在不同濃度時的界面張力值。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明 本發(fā)明采用的菌的名稱及菌種來源如下
枯草芽孢桿菌(ACCC01430)，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。本發(fā)明實施例1 4中菌體的衰落期的標準，見高等教育出版社2002年5月第二版《微生物學教程》周德慶編著。在下述實施例中，進入三級發(fā)酵后，每小時檢測一次。實施例1
搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為米糠油2%、尿素1%、糖蜜11%、KC1 0. 1%、KH2P04 0. 05%、K2HP04 0. 3%、酵母膏0. 005%、復合微量元素0. 008%，其余為水，pH為7. 0，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷 1.0g/L及溶劑水復配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)
將斜面枯草芽孢桿菌(ACCC01430)接入到7個3L搖瓶中，搖瓶裝入IL的培養(yǎng)基，每個搖瓶接入2環(huán)菌種，溫度為35士2°C、120 rpm培養(yǎng)14 h，血球計數(shù)板檢測菌數(shù)達到2億以上，即為得到搖瓶菌種；再轉(zhuǎn)接入200升的一級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為70%，接種量5%、溫度為 35士2°C、通風比為1 :0. 5、pH為7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速為110 rpm培養(yǎng)12 h，得到一級發(fā)酵菌種； 再轉(zhuǎn)接入2噸二級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為70%，接種量10%、溫度為35士2°C、通風比為1 :0. 5、 PH為7.0、攪拌轉(zhuǎn)速為100 rpm培養(yǎng)12 h，得到二級發(fā)酵菌種，再轉(zhuǎn)接入20噸三級發(fā)酵罐， 裝料量為14噸，三級發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度35士2°C、滅菌前用0. 1噸固體NaOi^fpH 調(diào)到7.0，通風比為1 :0. 5、攪拌轉(zhuǎn)速為80 rpm，期間累計補加米糠油0.5噸，發(fā)酵培養(yǎng)M小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為7. 5g/L。實施例2
搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為米糠油3%、尿素1. 5%、糖蜜17%、KCl 1. 0%、KH2PO4O. 2%、 K2HPO4L 5%、酵母膏0. 02%、復合微量元素0. 01%，其余為水，pH為7. 0，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷1. Og/L及溶劑水復配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)
將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種，轉(zhuǎn)接入4個3L搖瓶(各裝入IL培養(yǎng)基)， 每500ml培養(yǎng)基接入1環(huán)菌種，在溫度為35士2°C、120 rpm培養(yǎng)13. 5 h，血球計數(shù)板檢測菌數(shù)達到2億以上后，轉(zhuǎn)接入200升的一級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為67%，接種量3%、溫度為 35士2°C、通風比為1 :0.4、pH為7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速為120 rpm培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接入2噸二級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為67%，接種量10%、溫度為35 士 2°C、通風比為1 :0. 4、pH為7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速為 100 rpm培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接入20噸三級發(fā)酵罐，裝料量為14噸，三級發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度35士2°C、滅菌前用0. 10噸NaOH將pH控制在7.0，通風比為1 :0. 4、攪拌轉(zhuǎn)速為80 rpm, 期間累計補加米糠油0. 6噸，發(fā)酵培養(yǎng)25小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為 8.8g/L0實施例3
搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為米糠油5%、尿素0. 2%、糖蜜20%、KC1 0. 05%,KH2PO4 1. 2%、 K2HPO4 0. 05%、酵母膏0. 1%、復合微量元素0. 005%,其余為水，pH為7. 5，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷l.Og/ L及溶劑水復配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)
將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種，轉(zhuǎn)接入6個3L搖瓶(裝入IL培養(yǎng)基)， 35士2°C、120 rpm培養(yǎng)12h，血球計數(shù)板檢測菌數(shù)達到2億以上，轉(zhuǎn)接入200升的一級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為60%，接種量5%、溫度為35士2°C、通風比為1 :1、？11為7.5、攪拌轉(zhuǎn)速為 120rpm培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接入2噸二級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為60%，接種量10%、溫度為35士2°C、 通風比為1 :1、？11為7.5、攪拌轉(zhuǎn)速為IOOrpm培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接入20噸三級發(fā)酵罐，裝料量為16噸，三級發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度35士2°C、滅菌前pH調(diào)到7. 5左右，后期用0. 12噸 NaOH將pH控制在7.0，通風比為1 1、攪拌轉(zhuǎn)速為100 rpm，期間累計補加米糠油0. 7噸， 發(fā)酵培養(yǎng)M小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為10. 4g/L。實施例4
搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為米糠油3%、尿素1%、糖蜜20%、KCl 0. 5%、KH2PO4 0. 5%、 K2HPO4 0. 5%、酵母膏0. 05%及復合微量元素0. 005%，其余為水，pH為6. 5，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷l.Og/ L及溶劑水復配而成。搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)
將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種，轉(zhuǎn)接入7個3L搖瓶(裝入IL培養(yǎng)基)，接種量5%、35士2°C、120 rpm培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接入200升的一級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為65%，接種量 5%、35士2°C、通風比為1 :0. 3、pH為6. 5，攪拌轉(zhuǎn)速為120 rpm培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接入2噸二級發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為65%，接種量10%、溫度為35士2°C、通風比為1 :0. 3、pH為6. 5、攪拌轉(zhuǎn)速為120 rpm培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接入20噸三級發(fā)酵罐，裝料量為15噸，三級發(fā)酵罐的工藝參數(shù)為溫度35 士 2 °C、滅菌前pH調(diào)到6左右，后期用0. 23噸NaOH將pH控制在7. 0，通風比為 1 0. 3、攪拌轉(zhuǎn)速為120 rpm，期間累計補加米糠油0. 6噸，發(fā)酵培養(yǎng)25小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為9. 7g/L。由上述幾個實例可以看出采用此生產(chǎn)工藝發(fā)酵脂肽含量可達到7 - 10 g/L。將經(jīng)實施例1-4制得的脂肽表面活性劑，測定脂肽含量、發(fā)酵液表面張力及驅(qū)油效果，結(jié)果如下
(1)、發(fā)酵液中脂肽表面活性劑的臨界膠束濃度反推法檢測含量如圖1所示； O)、生物表面活性的界面張力檢測如圖2所示。A.實驗儀器JJ2000B型旋轉(zhuǎn)滴界面張力測量儀、全自動表面張力儀、萬分之一電子天平、電子秤、燒杯、吸管等。B.實驗材料生物表面活性劑枯草芽孢桿菌(ACCC01430)的發(fā)酵液濃度為1 5%、水大慶油田地層水、原油大慶原油，密度為0. 8806g/m3、氫氧化鈉固體片狀；
C.檢測方法參見中華人民共和國石油天然氣行業(yè)標準SY/T 5370-1999。D.檢測結(jié)果
生物表面活性劑濃度為1. 0%時與大慶原油之間的界面張力值，見圖2?？偨Y(jié)將枯草芽孢桿菌ACCC01430其經(jīng)發(fā)酵后脂肽含量可達到5 10%g/L，35°C、 0. 5 1 %濃度的脂肽發(fā)酵液在PH為8-9時，能使原油與地層水界面張力降低至0. 07 0. 2mN/m，在水相有效滲透率50 — 400md、殘余油飽和度30 50%、注入量為0. Ipv脂肽發(fā)酵液濃度為1_5%、50°C的條件下，原油采收率比水驅(qū)提高了 5-10%左右。
權利要求
1.一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，其特征在于該脂肽生物表面活性劑是由枯草芽孢桿菌ACCC01430經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制得，其具體步驟如下A、將斜面固體枯草芽孢桿菌ACCC01430菌種接入搖瓶培養(yǎng)，搖瓶中每500ml培養(yǎng)基接入1環(huán)菌種，溫度為35士2°C、120轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12 16小時，得到搖瓶菌種；B、一級發(fā)酵培養(yǎng)將A步驟制得的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的一級發(fā)酵罐中，搖瓶菌種與培養(yǎng)基的體積比為1 19 20，在溫度為；35士2°C、pH6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5 及攪拌速度為100 150轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10 14小時，得到一級發(fā)酵菌種；C、二級發(fā)酵培養(yǎng)將B步驟制得的一級發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的二級發(fā)酵罐中， 一級發(fā)酵菌種與培養(yǎng)基的體積比為1:10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5及攪拌速度為100 110轉(zhuǎn)/分的條件下發(fā)酵培養(yǎng)10 14小時，得到二級發(fā)酵菌種；D、發(fā)酵培養(yǎng)將C步驟制得的二級發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐中，二級發(fā)酵菌種與培養(yǎng)基的體積比為1 :10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0.3 0.5、 攪拌速度為80 100轉(zhuǎn)/分，在菌體處于衰落期進行補料，發(fā)酵培養(yǎng)M 沈小時，得到脂肽生物表面活性劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，其特征在于 搖瓶及各級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是米糠油2 5%、尿素0. 2 1. 5%、糖蜜10 15%、KCl 0. 05 1. 0%、KH2PO4 0. 05 1. 2%、K2HPO4 0. 05 1. 5%、酵母膏 0. 005 0. 1%、復合微量元素0. 005 0. 01%,余量為水，pH為6. 0 -7. 5 ；所述的復合微量元素為硫酸鋅1. 1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅 1.0 g/L、氧化鈷1.0g/L及溶劑水復配而成。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，其特征在于 步驟D中所述的補料是米糠油，每次補料量按發(fā)酵液總體積量的3% 5%補加。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，其特征在于各級發(fā)酵罐的裝料系數(shù)是60 80%。
全文摘要
本發(fā)明的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法涉及一種生物表面活性劑的生產(chǎn)方法，是由枯草芽孢桿菌ACCC01430經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制得，其具體步驟如下將斜面固體枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶培養(yǎng)，溫度為35±2℃、120轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12～16小時，得到搖瓶菌種；將制得的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的一級發(fā)酵罐中，制得一級發(fā)酵菌種；將一級發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的二級發(fā)酵罐中，制得二級發(fā)酵菌種；將二級發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接入裝有培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)24～26小時，即制得脂肽生物表面活性劑。本發(fā)明的一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法，其脂肽含量達到7～10%g/L，并取得了工業(yè)化生產(chǎn)實驗的成功，發(fā)酵周期縮短到48小時，大大降低了生產(chǎn)成本；本發(fā)明首次將工業(yè)化生產(chǎn)的脂肽發(fā)酵液應用現(xiàn)場，將其注入地下油層，使原來難以注水的區(qū)塊水順利注入，并且使原油采收率提高了5～12％；效率高。
文檔編號C12R1/125GK102373258SQ20111034341
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權日2011年11月3日
發(fā)明者孫彥達, 張麗茹, 李國軍, 段寶顏, 沈玉江, 王柱 申請人:大慶華理能源生物技術有限公司