專利名稱：核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在將核酸給予來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞或生物時(shí)能夠保護(hù)核酸不被分解并將其高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的、低毒性且安全性高的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物、及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
背景技術(shù)：
近年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理活性功能的核酸。 例如，已知siRNA(small interfering RNA:小干擾RNA)可引起存在于細(xì)胞內(nèi)的靶基因的 mRNA分解，阻礙靶基因表達(dá)(RNA interference =RNA干涉)。由此RNA干涉產(chǎn)生的阻礙靶基因表達(dá)的功能導(dǎo)致特定基因或基因組的異常表達(dá)，在減輕所患疾病癥狀乃至治療方面是有用的，故人們期待將siRNA開(kāi)發(fā)用作治療藥。但是，為了將以siRNA為首的核酸用作治療藥等，重要的是使siRNA在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，因此，確立使核酸有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)必不可少。作為將外來(lái)性核酸分子或基因轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及皰疹病毒等在內(nèi)的多種病毒被用于人難治性疾病的治療。但是，由于存在感染性、免疫反應(yīng)性、生產(chǎn)率等問(wèn)題，在治療中有難度。因此，人們正在開(kāi)發(fā)一種能克服來(lái)自病毒的問(wèn)題、且可用于將核酸分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的非病毒性載體。目前為止，作為促進(jìn)siRNA等核酸向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的非病毒性核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，例如，專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了特定結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子性脂質(zhì)。但是，專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，具有在給予培養(yǎng)細(xì)胞或生物體時(shí)呈現(xiàn)毒性的缺點(diǎn)。另外，專利文獻(xiàn)2中，作為毒性較低、 可將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的載體組合物，公開(kāi)了含有兩親性化合物及聚陽(yáng)離子的組合物。 但是，即使是專利文獻(xiàn)2中公開(kāi)的組合物，在將充分量的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，其對(duì)細(xì)胞的毒性方面依然存在問(wèn)題。以上述現(xiàn)有技術(shù)為背景，人們期待開(kāi)發(fā)出低毒性、能夠使以siRNA為代表的核酸高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。專利文獻(xiàn)1 特表2002-5^439號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 特表2005-508394號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。具體而言，本發(fā)明的目的在于提供一種在將siRNA等核酸給予來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞或生物時(shí)能夠保護(hù)核酸不被分解并將其高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的、低毒性且高安全性的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物、及含有該載體組合物和核酸的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了潛心研究，發(fā)現(xiàn)組合含有(A)具有留核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、及(B)季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)的組合物，毒性低且能夠保護(hù)核酸不被分解并使其高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，作為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體是有用的。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)，通過(guò)進(jìn)一步反復(fù)研究而完成的。即，本發(fā)明提供下述方案的發(fā)明項(xiàng)1. 一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其特征在于，含有(A)具有留核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、及(B)季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)。項(xiàng)2.如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中還含有(C)油性基材。項(xiàng)3.如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，(A)成分為3 3-例_^’力’-二甲基氨基乙烷)_氨基甲?；鵠膽固醇、及/或3β-[Ν’，Ν’，Ν’ -三甲基氨基乙烷]碘化膽固醇。項(xiàng)4.如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，(B)成分為選自二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽、二油?；谆@丙烷、及N-(l-(2，3-雙(油酰氧基)丙基)-Ν，Ν，Ν-三甲基銨鹽酸鹽中的至少1種。項(xiàng)5.如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，相對(duì)于100重量份(A)成分，以 10 200重量份的比例含有⑶成分。項(xiàng)6.如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，所述組合物為SiRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。項(xiàng)7. —種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中含有核酸及項(xiàng)1至5中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。項(xiàng)8.如項(xiàng)7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸為siRNA。項(xiàng)9. 一種核酸導(dǎo)入方法，其特征在于，通過(guò)使項(xiàng)7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸，使核酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。項(xiàng)10. (A)具有甾核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)及⑶季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)的組合在制造核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，可以得到下述優(yōu)異的效果。(1)能夠有效率地將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，使核酸在細(xì)胞內(nèi)有效地發(fā)揮功能。(2)能夠抑制核酸在生物體內(nèi)或培養(yǎng)液中分解。(3)毒性低、安全性高。所以，上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以用于通過(guò)導(dǎo)入核酸進(jìn)行的各種疾病的治療，特別是對(duì)用低分子化合物等難于治療的難治性疾病的治療有效。另外，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以進(jìn)行凍干處理，因此，也具有可在凍干狀態(tài)下保存的優(yōu)點(diǎn)。


[圖1]是表示在試驗(yàn)例1中使用各種受試試樣處理細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察來(lái)自細(xì)胞中的核酸的熒光像的結(jié)果的圖。[圖2]是表示在試驗(yàn)例2中使用各種受試試樣處理細(xì)胞后，測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性的結(jié)果的圖。[圖3]是表示在試驗(yàn)例3中測(cè)定大鼠的肺中腦啡肽酶(NEP)活性的結(jié)果的圖。[圖4]是表示在試驗(yàn)例4中使用各種受試試樣處理后的活細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果的圖。[圖5]是表示在試驗(yàn)例5中將大鼠的肺組織切片用蘇木精-伊紅染色的結(jié)果的圖。圖中，蘇木精將核·核糖體等染成藍(lán)綠色，伊紅將細(xì)胞質(zhì)·纖維·紅細(xì)胞染成紅色。
具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的特征在于，含有(A)具有留核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、及(B)季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物可以作為用于將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)(導(dǎo)入)至細(xì)胞內(nèi)的核酸載體使用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物適用的核酸，只要是必需轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的核酸即可，對(duì)其種類或結(jié)構(gòu)沒(méi)有特殊的限定。作為該核酸的具體例，可以舉出siRNA、mRNA、tRNA、 rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反義寡核苷酸、誘餌寡核苷酸、質(zhì)粒DNA、肽核酸、三鏈形成性寡核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide，TFO)、基因等。其中，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物在將siRNA向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)方面特別有用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體適用的核酸，可以是來(lái)自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通過(guò)化學(xué)合成制造的核酸。進(jìn)而，上述核酸可以是單鏈、雙鏈、三鏈中的任一種，并且對(duì)其分子量也沒(méi)有特殊的限定。另外，本發(fā)明中，核酸可以為被化學(xué)、酶或肽修飾的核酸。本發(fā)明中，核酸可以單獨(dú)使用 1種，也可以2種以上適當(dāng)?shù)亟M合使用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中使用的具有留核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)(以下，有時(shí)也表示為“(A)成分”)，是指具有甾核(環(huán)戊烷多氫菲環(huán)；C17H28)、顯示陽(yáng)離子性的脂質(zhì)。 作為本發(fā)明中使用的具有留核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，只要是藥理學(xué)上允許的脂質(zhì)即可，沒(méi)有特殊的限制，作為具體例，可以舉出3β-[Ν-(Ν’，N’ - 二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)、3 β-[N，，Ν，，N，-三甲基氨基乙烷]碘化膽固醇(TC-Chol)、(N，，N-雙胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-膽固醇(bis (guanidinium) -tren-cholesterol) (BGTC)、 N-膽留烯基氧基羰基-3，7-二氮雜壬烷-1，9-二胺、β-丙氨酸-二乙醇胺-膽固醇、 N4-精胺膽固醇氨基甲酸酯(GL-67 ;N4-spermine cholesteryl carbamate)、N[N4_3_ 氨基丙基亞精胺]膽固醇氨基甲酸酯(GL-78 ；N[N4-3-aminopropylspermidine] cholesteryl carbamate)、N4-精胺膽固醇甲酰胺(GL-90 ；N4-Spermine cholesteryl carboxamide)、 Ni，N8-雙(精氨酸甲酰胺)-N4-亞精胺膽固醇氨基甲酸酯(GL-95 ；N1, N8-Bis (argininc carboxamide)-N4-Spermidine cholesteryl carbamate)、N-[N1, N4, N8-三(3_ 氨基丙基)亞精胺]膽固醇氨基甲酸酯(GL-96 ；N-[N1, N4, N8-Tris (3-aminopropyl) spermidine] cholesteryl carbamate)等膽固醇衍生物(具有膽固醇骨架的陽(yáng)離子性脂質(zhì))；角鯊胺 (Squalamine)、3a，7a，12a-三(3_ 氨基丙氧基)_5 β -膽烷-24-(N，N-雙(3_ 氨基丙基)胺 (3a,7a,12a_Tris(3-aminopropoxy)-5 β -cholan-24- (N, N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a, 7a, 12a-三(3_氨基丙氧基)_5 β -膽烷_(kāi)24_ (N- (N- (3-氨基丙基))_3_氨基丙基)-胺 (3a,7a,12a_Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan_24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminop ropyl)-amine)、3a，7a，12a-三(3_ 疊氮基丙氧基)_5 β -膽烷 _24_ (N，N-雙(2-氰基乙基)胺)(3a，7a，12a_Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan_24-(N，N_bis(2-cyanoethyl) amine))、3a，7a, 12a-三(3-疊氮基丙氧基)_5 β -膽烷-24- (N-(芐基氧基羰基)_N_ (羥基丙基)_ 月安)(3a, 7a, 12a-Tris (3-azidopropoxy) -5b-cholan-24- (N- (benzyloxycarbon yl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine))等甾族化合物結(jié)合的陽(yáng)離子性脂質(zhì)；傘狀精胺復(fù)合體 (Umbrella-spermine conjugates)等膽酸結(jié)合的陽(yáng)離子性脂質(zhì)；甾醇糖苷結(jié)合的陽(yáng)離子性脂質(zhì)；留類皂苷結(jié)合的陽(yáng)離子性脂質(zhì)等。上述具有留核的陽(yáng)離子性單純脂質(zhì)可以單獨(dú)使用 1種，或任意組合2種以上使用。作為具有留核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，優(yōu)選舉出膽固醇衍生物(具有膽固醇骨架的陽(yáng)離子性脂質(zhì))，更優(yōu)選舉出3 β -[N-(N'，N’ - 二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽固醇、及 3β-[Ν，，Ν，，Ν，-三甲基氨基乙烷]碘化膽固醇(TC-Chol)。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中使用的季銨鹽型陽(yáng)離子性脂質(zhì)(以下，有時(shí)也表示為“(B)成分”)，只要在藥理學(xué)上允許即可，沒(méi)有特殊限制。作為其具體例，可以舉出二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽(DDAB)、1，2-二肉豆蔻?；?3-三甲基銨丙烷、1，2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP) ,1,2- 二油酰基-3-三甲基銨丙烷甲基硫酸鹽、1，2- 二棕櫚?；?3-三甲基銨丙烷、1，2- 二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷、N-(l-(2, 3-雙(油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基銨鹽酸鹽(DOTMA)、二肉豆蔻?；趸谆u基乙基溴化銨鹽(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化銨、N- (a-三甲基銨基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺鹽酸鹽、N- (a-三甲基銨基乙?；?-0，0’ -雙-(1H，1H，2H，2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、0，0’ - 二(十二烷?；?-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化銨、N- {p- (w-三甲基銨基丁基氧基)-苯甲?；鶀 - 二(十二烷基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、 9-(w-三甲基銨基丁基)-3，6_雙(十二烷?；?咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)銨鹽酸鹽、N-W-三甲基銨基癸?；?二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N- {p- (w-三甲基銨基己基氧基)_苯甲?；鶀-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、P-(w-三甲基銨基癸基氧基)-P’ -辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-l-0810)、p-{w-(b-羥基乙基)二甲基-銨基-癸基氧基}-P，-辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-0810)、0，0，，0，，-三(十二烷?；?-N-(w-三甲基-銨基癸?；?_三(羥基甲基)氨基甲烷溴化物鹽(TC-1-12)、1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸膽堿、1，2- 二肉豆蔻?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1，2- 二棕櫚?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1，2_ 二硬脂?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1，2_ 二油?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1-棕櫚?；?2-油?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿等。上述季銨鹽型陽(yáng)離子性脂質(zhì)可以單獨(dú)使用1種，也可以任意組合2種以上使用。上述季銨鹽型陽(yáng)離子性脂質(zhì)中，優(yōu)選舉出二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽(DDAB)、 二油?；谆@丙烷(D0TAP)、N-(l-(2，3-雙(油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基銨鹽酸鹽(DOTMA)、0，0，_二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽(DC-6-12， η = 12 ；及DC-6-14，η = 14)、ρ-{w_(b_羥基乙基)二甲基-銨基-癸基氧基}-ρ，-辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-0810)、&0，0’，0”-5 (十二烷?；?_N_(W-三甲基-銨基癸酰基)-三(羥基甲基)氨基甲烷溴化物鹽(TC-1-12)，更優(yōu)選舉出二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽(DDAB)、二油?；谆@丙烷(DOTAP)、N-(1-(2，3-雙(油酰氧基)丙基)-N，N， N-三甲基銨鹽酸鹽(DOTMA)。另外，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中，對(duì)(A)成分和(B)成分的配合比率沒(méi)有特殊的限制，從將核酸有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的觀點(diǎn)考慮，相對(duì)于100重量份㈧成分，⑶成分為10 200重量份，優(yōu)選為30 150重量份，更優(yōu)選為75 125重量份。另外，相對(duì)于本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的總量，(A)成分和⑶成分的總量例如可以為10 100重量％， 優(yōu)選為20 80重量％，更優(yōu)選為40 70重量％。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，除上述(A)及(B)成分之外，還可以含有油性基劑(以下，有時(shí)也稱為(C)成分)。配合油性基劑，利用其特性，由此能夠控制核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的核酸導(dǎo)入效率。例如通過(guò)配合油性基劑調(diào)整核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的比重， 可以控制細(xì)胞和核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的接觸性，改善體外的導(dǎo)入效率。另外，例如通過(guò)配合具有溫度感受性功能的油劑作為油性基劑，能夠在規(guī)定的溫度條件下使核酸載體的芯破碎，誘發(fā)細(xì)胞表面的波動(dòng)，提高核酸的導(dǎo)入效率。進(jìn)而，例如通過(guò)配合具有外部刺激破碎性的油劑作為油性基劑，可以通過(guò)外部刺激使核酸載體組合物的芯破碎，誘發(fā)細(xì)胞表面的波動(dòng)，提高核酸的導(dǎo)入效率。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中配合的油性基材，例如可以舉出，全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氫化大豆油、 大豆油非皂化物、角鯊烯、蓖麻油、丁香油、三油酸脫水山梨糖醇酯、松節(jié)油、紅花油、紅花油脂肪酸、油酸、棕櫚油、菜子油、雜醇油、橄欖油、亞麻仁油、芝麻油、葉綠素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉樹(shù)油、玉米油、熏衣草油、馬郁蘭油、檸檬油、棉籽油、椰子油、蛋黃油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黃菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、羅馬春黃菊油、蛇油、留蘭香油(spearmintoil)、向日葵油、可可脂、小麥胚芽油、氧化鋅油、氫化油、氫化植物油、輕質(zhì)液體石蠟、液體石蠟、中鏈脂肪酸三甘油酯、貂油 (minkoil)、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、聚氧乙烯氫化蓖麻油100、聚氧乙烯氫化蓖麻油20、聚氧乙烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油5、聚氧乙烯氫化蓖麻油50、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧基35蓖麻油、操作油等。上述油性基劑中，全氟戊烷具有溫度感受性，具有在29. 5°C下通過(guò)沸騰氣化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷、及全氟三丁基胺具有下述特性，即具有外部刺激破碎性，在由超聲波照射產(chǎn)生的刺激等來(lái)自外部的刺激作用下，使載體組合物的芯產(chǎn)生空腔，使其破碎。含有該油性基劑時(shí)，作為該油性基劑的比例，只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒(méi)有特殊的限制，例如可以為下述比例，即相對(duì)于100重量份上述(A)成分及(B)成分的總量， 該油性基材為0. 1 50重量份，優(yōu)選為1 30重量份，更優(yōu)選為5 20重量份。進(jìn)而，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中根據(jù)需要也可以含有膜融合性脂質(zhì)(輔助脂質(zhì))。通過(guò)含有上述膜融合性脂質(zhì)，能夠進(jìn)一步提高核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。作為上述膜融合性脂質(zhì)，例如可以舉出，二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰膽堿、反式磷脂?；字；掖及?、1，2-雙(10，12- 二十三烷二?；?-磷酸乙醇胺、1，2- 二反油酰基磷酸乙醇胺、1，2_ 二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1，2_ 二己?；姿嵋掖及?、1，2_ 二月桂酰基磷酸乙醇胺、1，2-二亞油?；姿嵋掖及?、1，2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油?；姿嵋掖及?、1，2- 二棕櫚油酰基磷酸乙醇胺、1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及?、1，2- 二植烷酰磷酸乙醇胺、1，2_ 二硬脂?；姿嵋掖及?、1-棕櫚?；?2-油?；姿嵋掖及?、1-棕櫚酰基-2-(10，12- 二十三烷二?；?磷酸乙醇胺、1，2- 二油?；姿嵋掖及?N-己酰胺、1， 2- 二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N, N- 二甲基-1，2- 二油?；姿嵋掖及?、N, N- 二甲基-1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及?、N-十二烷酰基-1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及?、N-十二烷?；?1，2- 二油?；姿嵋掖及贰?，2- 二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1，2- 二油?；姿嵋掖及?N-戊二酰、1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及?N-戊二酰、1，2_ 二油?；姿嵋掖及?N-乳糖、1，2_ 二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4 (ρ-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽、二棕櫚酰磷酸乙醇胺-N-[4 (ρ-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽、1，2_ 二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[4(p-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酰胺、 1，2- 二油酰基磷酸乙醇胺-N- [4 (ρ-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸鹽]、N-甲基-1，2- 二油?；姿嵋掖及?、N-甲基-二棕櫚?；姿嵋掖及?、1，2_ 二油?；姿嵋掖及?N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽、1，2_ 二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽、N-(琥珀酰)-1， 2-二油?；姿嵋掖及?、N-(琥珀酰)-1，2_ 二棕櫚?；姿嵋掖及返取Ｆ渲?，在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中優(yōu)選使用二油?；字Ｒ掖及贰：性撃と诤闲灾|(zhì)時(shí)，作為該膜融合性脂質(zhì)的比例，只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒(méi)有特殊的限制，可以舉出下述比例，即相對(duì)于100重量份上述㈧成分及⑶成分的總量，該膜融合性脂質(zhì)為1 500重量份，優(yōu)選為10 250重量份，更優(yōu)選為25 100
重量份。根據(jù)使用形態(tài)，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物可以含有等滲劑、賦形劑、稀釋齊U、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等各種添加劑。上述添加劑的配合量，可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的使用形態(tài)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物通過(guò)混合上述(A)成分、(B)成分、及根據(jù)需要混合其他成分而制造。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物是含有上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物和核酸的組合物， 在該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中，核酸與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的配合成分通過(guò)離子鍵或疏水鍵形成復(fù)合體，提高核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)率。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物通過(guò)混合上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物和核酸，或以任意順序混合核酸及上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的配合成分而進(jìn)行制造。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中，作為核酸和核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的配合比率， 根據(jù)使用的核酸或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的種類或?yàn)楹怂徂D(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象的細(xì)胞的種類等而不同，例如，可以舉出以下比例，即相對(duì)于100重量份核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中所含的㈧及⑶成分的總量，核酸為0. 1 300重量份，優(yōu)選為1 100重量份，更優(yōu)選為2. 5 50重量份。另外，作為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中所含的㈧及⑶成分的總量，相對(duì)于該組合物的總量，例如可以舉出10 90重量％，優(yōu)選為30 80重量％，更優(yōu)選為50 70重量％。根據(jù)使用形態(tài)，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以含有等滲劑、賦形劑、稀釋劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等多種添加劑。上述添加劑的配合量可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的使用形態(tài)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。
本發(fā)明中，作為核酸被轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞，可以舉出培養(yǎng)細(xì)胞、從生物體中提取的細(xì)胞 (包含株化的細(xì)胞)、生物體內(nèi)存在的細(xì)胞等。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的使用狀態(tài)，只要能使該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與作為核酸導(dǎo)入對(duì)象的細(xì)胞接觸即可，沒(méi)有特殊限制。例如，向生物體內(nèi)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)核酸時(shí)， 例如可以舉出向組織中直接注入；向靜脈、皮下、肌肉、腹腔、眼內(nèi)、消化器官內(nèi)、牙內(nèi)等注射；從鼻腔、口腔、肺等吸入給予；口服給予；通過(guò)皮膚的透皮給予；及通過(guò)口腔粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜的經(jīng)粘膜給予等。另外，在向培養(yǎng)細(xì)胞或從生物體提取的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的情況下，可以舉出將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物預(yù)先添加到培養(yǎng)基中，在該狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞的方法。需要說(shuō)明的是，向培養(yǎng)細(xì)胞或從生物體提取的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)核酸時(shí)，即使在血清存在下也可以將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。實(shí)施例以下，根據(jù)實(shí)施例等詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。實(shí)施例1制備下述組成的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。
二曱基二(十八烷基)溴化銨鹽0.9(Ig
3β- [Ν-(Ν', N，-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽固醇 0.9|ag 二油酰基磷脂酰乙醇胺0.9pg
丙三醇40.5pg
精制水2μ1
OPTI - MEM培養(yǎng)基(Invitrongen社制)_適量
總量50μ1實(shí)施例2首先，制備下述組成的含核酸的液體。siRNA2pmolOPTI-MEM 培養(yǎng)基 GnvitronSen 社制)_適量總量50 μ 1然后，將50 μ 1上述所得的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物和50 μ 1含有核酸的液體混合， 在室溫下培養(yǎng)20分鐘，由此制備siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。實(shí)施例3制備下述組成的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。
權(quán)利要求
1.一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其特征在于，含有(A)具有膽固醇骨架的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、及⑶季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，相對(duì)于100重量份㈧成分，以10 200重量份的比例含有(B)成分，所述季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)為選自下述物質(zhì)中的至少一種二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽、二油?；谆@丙烷、N-(l-(2，3-雙(油酰氧基)丙基)_N， N，N-三甲基銨鹽酸鹽、0，0’ - 二(十二烷?；?-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、0，0，- 二(十四烷?；?-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、p-{w_(b-羥基乙基)二甲基-銨基-癸基氧基}_P’ -辛氧基偶氮苯溴化物鹽、及0，0’，0”_三(十二烷?；?-N_(w-三甲基-銨基癸?；?_三(羥基甲基)氨基甲烷溴化物鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中還含有(C)油性基材。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，(A)成分為3β-[Ν-(Ν’，Ν’- 二甲基氨基乙烷)_氨基甲?；鵠膽固醇、及/或3β-[Ν’，Ν’，Ν’ -三甲基氨基乙烷]碘化膽固醇。
4.如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，(B)成分為選自二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽、二油?；谆@丙烷、及N-(l-(2，3-雙(油酰氧基)丙基)-Ν，Ν，Ν-三甲基銨鹽酸鹽中的至少1種。
5.如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，還含有(D)膜融合性脂質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，相對(duì)于100重量份(A)成分，以 30 150重量份的比例含有(B)成分。
7.如權(quán)利要求2所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，相對(duì)于100重量份(A)成分及 (B)成分的總量，以0. 1 50重量份的比例含有(C)成分。
8.如權(quán)利要求5所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，相對(duì)于100重量份(A)成分及 ⑶成分的總量，以1 500重量份的比例含有⑶成分。
9.如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，所述組合物為siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。
10.一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，含有核酸及權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。
11.如權(quán)利要求10所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸為SiRNA。
12.一種核酸導(dǎo)入方法，其特征在于，通過(guò)使權(quán)利要求10所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸，使核酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，所述細(xì)胞為培養(yǎng)細(xì)胞或從生物體中提取的細(xì)胞。
13.含有(A)具有膽固醇骨架的陽(yáng)離子性脂質(zhì)及(B)季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)的組合物在制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的應(yīng)用，其中，相對(duì)于100重量份(A)成分，以10 200重量份的比例含有(B)成分，所述(B)季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)為選自下述物質(zhì)中的至少一種 二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽、二油?；谆@丙烷、N-(l-(2，3-雙(油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基銨鹽酸鹽、0，0’_二(十二烷?；?-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、0，0’_ 二(十四烷?；?-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、p-{w_(b-羥基乙基)二甲基-銨基-癸基氧基}_p’ -辛氧基偶氮苯溴化物鹽、及0，0’，0”_三(十二烷?；?-N-(w-三甲基-銨基癸?；?-三(羥基甲基)氨基甲烷溴化物鹽。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，所述組合物還含有(C)油性基材。
15.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中，㈧成分為3β-[Ν-(Ν’，N’- 二甲基氨基乙烷)_氨基甲酰基]膽固醇、及/或3β-[Ν’，Ν’，Ν’ -三甲基氨基乙烷]碘化膽固醇。
16.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中，(B)成分為選自二甲基二(十八烷基)溴化銨鹽、二油?；谆@丙烷、及N- (1- (2，3-雙(油酰氧基)丙基)-N, N, N-三甲基銨鹽酸鹽中的至少1種。
17.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中，組合物還含有(D)膜融合性脂質(zhì)。
18.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中，組合物中相對(duì)于100重量份(A)成分，以30 150重量份的比例含有⑶成分。
19.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，組合物中相對(duì)于100重量份㈧成分及⑶成分的總量，以0. 1 50重量份的比例含有(C)成分。
20.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，組合物中相對(duì)于100重量份㈧成分及⑶成分的總量，以1 500重量份的比例含有⑶成分。
21.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，所述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體為siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。本發(fā)明的目的在于提供一種在將siRNA等核酸給予來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞或生物時(shí)能夠保護(hù)核酸免于分解并使其高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的、低毒性的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，及含有該載體組合物和核酸的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。本發(fā)明通過(guò)組合(A)具有甾核的陽(yáng)離子性脂質(zhì)及(B)季銨鹽型的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，將其配合，制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。另外，混合該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物和核酸來(lái)制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
文檔編號(hào)C12N15/88GK102512689SQ20111046114
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2006年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者豐福秀一, 佐藤正子, 關(guān)口和生, 宮尾英男 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社