專利名稱：一種新的基因定量方法
一種新的基因定量方法[技術領域]
本發(fā)明涉及分子生物學領域，更具體地，涉及一種新的基因定量方法。 [背景技術]
包括聚合酶鏈式反應(PCR)、環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、核酸序列依賴性擴增 (NASBA)等技術的基因擴增技術可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA或者RNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?0萬個細胞中僅含1個靶DNA或RNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫(yī)學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發(fā)展。
由于基因擴增技術的高靈敏性導致會出現(xiàn)一些假陽性，基因定量技術應運而生， 常見的定量技術包括熒光定量PCR技術，LAMP的實時濁度定量技術等，這些技術的出現(xiàn)為基因擴增技術的應用帶來了更為廣闊的前景。目前我國臨床已經(jīng)拋棄了普通的基因擴增定性檢測，全部采用定量基因擴增技術。但是這些定量技術都需要大型的儀器設備，一臺定量 PCR儀的價格是普通PCR儀價格的十多倍，因此只能夠在大醫(yī)院和科研院所展開相關檢測和研究，基層醫(yī)院和偏遠地區(qū)無法享受這一高科技產(chǎn)品帶來的福音。
因此特別需要一種簡單而且不需要大型設備的基因定量技術。[發(fā)明內(nèi)容]
本發(fā)明的目的是在于解決現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種提供一種鑒定結果直觀、操作簡單、特異性好、適合基層的基因定量技術。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術措施實現(xiàn)(1)通過實驗鑒定出一組擴增試劑在相同條件下的靈敏度，即可以檢測到的最低基因數(shù)量；( 將待定量的模板稀釋不同倍數(shù)， 然后對不同濃度的模板用同一組擴增試劑進行基因擴增；C3)通過能夠?qū)崿F(xiàn)基因擴增的最大稀釋倍數(shù)計算待定量的基因數(shù)量。
一組檢測時間在相同的檢測條件下，能夠檢測到的最低基因數(shù)量，即該組檢測試劑的檢測靈敏度。一組試劑的檢測靈敏度是一個恒定的數(shù)值，具有很強的可重復性。我們可以通過實驗室條件進行基因定量，等比稀釋等方法鑒定一組基因擴增試劑的檢測靈敏度。
將待定量的模板進行逐級稀釋，用同一組擴增試劑對各稀釋比例的模板進行基因擴增，大于該組擴增試劑靈敏度濃度的稀釋管可以完成擴增反應，低于該組擴增試劑靈敏度的稀釋管不會完成擴增反應。用該組擴增試劑的靈敏度乘以可以完成擴增反應的最大稀釋倍數(shù)就是帶定量的模板數(shù)量。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的一種新的基因定量方法只需要原有的基因擴增設備，像LAMP和NASBA技術只需要一個恒溫環(huán)境即可，不需要額外的實驗設備，大大簡化了設備投入，成本投入低，適合基層和現(xiàn)場使用。2.本發(fā)明的一種新的基因定量方法計算簡單，只是應用了一個乘法計算，簡潔明了，易懂易用。3.本發(fā)明的一種新的基因定量方法省去了熒光定量PCR所需要的熒光劑、探針等物質(zhì)，成本更低。4.本發(fā)明的一種新的基因定量方法具有廣泛的適用性，可以和PCR、LAMP、NASBA等現(xiàn)有的基因擴增技術結合，完成定量過程。[具體實施方式
]
為了使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施。
本實施例采用LAMP技術定量檢測大腸桿菌。
實施例1
(1)按以下序列合成大腸桿菌寡聚脫氧核酸引物
ECFL :CTTCGCCACCGGTATTCC
ECBL GGATTAGATACCCTGGTAGTCC
ECBIP :GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGACCTCCAAGTCGACATCGTT
ECFIP :TCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC
ECB3 :CGTTAGCTCCGGAAGCCA
ECF3 :TCTCGTAGAGGGGGGTAGA
(2)制備工藝如下
將Bst DNA 聚合酶 10 單位 / 管，2mmol/L dNTP、50mmol/L Tris-HCl、20mmol/ LKCl、50mmol/L MgS04、0. 5 體積％ TritonX-100、lmmol/L甜菜堿、lmol/L HNB,內(nèi)引物FIP/ BIP1. 6ummol/L、外引物 F3/B30. 2ummol/L、環(huán)引物 LB/LP 0. 4ummol/L。
以上物質(zhì)溶于20ul水中。
(3)靈敏度的檢測和未知濃度的定量檢測
a.取冷藏的HBlOl大腸桿菌菌液在LB培養(yǎng)基上劃線分離單菌株。挑單菌落接種至IOml液體LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜，裂解法抽提大腸桿菌基因組DNA。
b.對抽提的DNA進行0D260分光光度計檢測，確定DNA的含量。取部分DNA進行 10倍等比稀釋，直至稀釋的濃度低于1拷貝/微升。
c.分別取各稀釋管中液體5ul，加入LAMP反應管，65度恒溫，60分鐘，最大倍數(shù)的稀釋管中基因的拷貝數(shù)就是該組試劑的檢測靈敏度。
d.將未知濃度的大腸桿菌按照10倍等比稀釋8組，分別取各稀釋管中液體5ul， 加入LAMP反應管，65度恒溫，60分鐘。
e.靈敏度乘最大稀釋倍數(shù)的數(shù)值就是該未知濃度檢測管的大腸桿菌濃度。
(4)材料
a.大腸桿菌HBlOl為分子生物學實驗室常用工程菌之一，為本實驗室保存。
b.Bst DNA聚合酶購買自北京紐英侖公司，HNB、甜菜堿購買自Sigma公司，引物由上海生工合成。
(5)結論
本發(fā)明方法操作簡單，方便快捷，且顯色結果清晰。本發(fā)明不需要特別設備和儀器，適合基層和現(xiàn)場使用，并且該方法具有廣泛的適用性。
最后應當說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明做了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。
權利要求
1.本發(fā)明提供了一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的方法包括(1)通過實驗鑒定出一組擴增試劑的靈敏度，即可以檢測到的最低基因數(shù)量；( 將待定量的模板稀釋不同倍數(shù)，然后對不同濃度的模板用同一組擴增試劑進行基因擴增；C3)通過能夠?qū)崿F(xiàn)基因擴增的最大稀釋倍數(shù)計算待定量的基因數(shù)量。
2.如權利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述將模板稀釋不同倍數(shù)，可以使等比稀釋，也可以是不同比例的稀釋，但稀釋的倍數(shù)是確定的。
3.如權利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的基因擴增包括聚合酶鏈式反應(PCR)、環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、核酸序列依賴性擴增技術(NASBA)。
4.如權利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述一組擴增試劑的靈敏度，即可以檢測到的最低基因數(shù)量是固定的，在只改變模板數(shù)量的條件下，這一數(shù)值不發(fā)生變化。
5.如權利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的不同倍數(shù)的模板包括可以實現(xiàn)擴增反應的模板濃度和不可實現(xiàn)反應的模板濃度。
6.如權利要求5所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的計算初始的模板濃度等于最低可以檢測到的極限模板濃度乘以稀釋倍數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的基因定量方法，所述的方法包括(1)通過實驗鑒定出一組擴增試劑的靈敏度，即可以檢測到的最低基因數(shù)量；(2)將待定量的模板稀釋不同倍數(shù)，然后對不同濃度的模板用同一組擴增試劑進行基因擴增；(3)通過能夠?qū)崿F(xiàn)基因擴增的最大稀釋倍數(shù)計算待定量的基因數(shù)量。本發(fā)明只需要原有的基因擴增設備，大大簡化了設備投入，成本低，適合基層和現(xiàn)場使用；本發(fā)明只是應用了一個乘法計算，簡潔明了，易懂易用；本發(fā)明具有廣泛的適用性，可以和PCR、LAMP、NASBA等現(xiàn)有的基因擴增技術結合，完成定量過程。
文檔編號C12Q1/68GK102517397SQ20121000237
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權日2012年1月5日
發(fā)明者俞國華, 李治國 申請人:俞國華, 李治國