專利名稱：一種快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法，屬于生物學(xué)領(lǐng)域中分子生物學(xué)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
鹽分是限制植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一，土壤鹽漬化是一個(gè)世界性問(wèn)題。植物耐鹽新品種的選育，一直是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。絨毛白蠟(Fraxinus Velutina Torr.)為木犀科(Oleaceae)白蠟屬(Fraxinus Linn.)落葉喬木，原產(chǎn)為美國(guó)，生長(zhǎng)快，樹干通直，紋理美觀，抗逆，是鹽堿地造林、園林綠化和珍貴的用材樹種，是唯一的鹽堿地造林的大喬木樹種。但是，大多數(shù)絨毛白蠟不能夠在含鹽量超過(guò)0.3%以上的鹽堿地上正常生長(zhǎng)和繁殖，其中山東省林業(yè)科學(xué)研究院劉德璽選育的魯蠟3號(hào)(Fraxinus Velutina Torr. Lula 3)品種，具有非常強(qiáng)的耐鹽能力，能夠在含鹽量0.5-0.6%條件下可以正常生長(zhǎng)發(fā)育。該品種對(duì)沿海城市的綠化和美化、位于鹽堿地的油田地區(qū)的綠化、鹽堿地的土壤改良具有重要作用。
但從形態(tài)學(xué)鑒定耐鹽和鹽敏感植株非常困難，尤其是從耐鹽和鹽敏感植株雜交后代篩選出耐鹽個(gè)體，通常要進(jìn)行生理測(cè)定和耐鹽試驗(yàn)，耗時(shí)、費(fèi)力且許多表型特征的不穩(wěn)定性，而且可能破壞植株，另外形態(tài)特征測(cè)量和生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果時(shí)常出現(xiàn)誤差。植物的耐鹽性狀是受多基因控制的，耐鹽植株和鹽敏感植株在基因組上存在一定的差異性。以PCR 為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)是快速檢測(cè)生物基因組差異的重要方法之一，直接以DNA形式出現(xiàn)，在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境因素的影響，且取材少， 在苗期可以進(jìn)行選擇，從而大大提高育種效率。然而，經(jīng)檢索目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)絨毛白蠟植物耐鹽性狀分子快速檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對(duì)已有耐鹽品種雜交后代耐鹽鑒定方法中存在的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、準(zhǔn)確性低的缺點(diǎn)，提供一種具有快速、簡(jiǎn)便、成本低、靈敏度高的鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法。
本發(fā)明所述的快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法，步驟是
(1)應(yīng)用SEQ ID NO. 1所示核酸序列為SCAR標(biāo)記，以絨毛白蠟植物DNA為模板， 利用所述SCAR標(biāo)記的兩條引物在M 56°C的退火溫度下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述SCAR 標(biāo)記的兩條引物分別是
引物 1 :5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；
引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，；
(2)將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀測(cè)PCR結(jié)果；
(3)鑒定是否為耐鹽絨毛白蠟植株；如果PCR結(jié)果擴(kuò)增出一條592bp的DNA條帶， 判定為耐鹽植株；如果PCR結(jié)果擴(kuò)增不出592bp的DNA條帶，判定為鹽敏感植株。3
其中
步驟(1)所述的PCR反應(yīng)總體積優(yōu)選為25微升，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物 1(10μπιο1/υ μ 1，引物2(10μπιο1/υ μ l，20ng 基因組 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
步驟(1)所述的PCR反應(yīng)參數(shù)優(yōu)選為94°C預(yù)變性％iin，94°C變性30s，55°C退火 45s, 720C 1.5min，循環(huán) 30 次，72°C延伸 IOmin0
本發(fā)明采用RAPD技術(shù)，尋找與耐鹽堿性狀相關(guān)聯(lián)的RAPD分子標(biāo)記，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性、重復(fù)性強(qiáng)的SCAR標(biāo)記，該SCAR標(biāo)記是全長(zhǎng)592bp的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。應(yīng)用所述SCAR標(biāo)記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，采用簡(jiǎn)單易操作的 PCR擴(kuò)增，即可利用分子標(biāo)記快速檢測(cè)絨毛白蠟雜交后代的耐鹽植株與鹽敏感植株，為利用分子標(biāo)記輔助選育和基因工程等手段改良絨毛白蠟?zāi)望}新品種提供了基礎(chǔ)，加速了絨毛白蠟?zāi)望}育種進(jìn)程。為我國(guó)耐鹽堿林木種質(zhì)的選育研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)體系；豐富耐鹽堿綠化樹種的遺傳多樣性，扼制土地鹽漬化，提高土地生產(chǎn)力；增加生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益都具有現(xiàn)實(shí)而深遠(yuǎn)的意義。
本發(fā)明提供的快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法，具有靈敏度高，所需DNA 用量少的特點(diǎn)，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、耐鹽試驗(yàn)、生理指標(biāo)測(cè)定相比，本發(fā)明的有益效果是
1、簡(jiǎn)便易行在實(shí)驗(yàn)室采用常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)絨毛白蠟植株進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)一次PCR 擴(kuò)增就可以判斷絨毛白蠟是否為耐鹽單株或耐鹽品種，在植株生長(zhǎng)的任何時(shí)期都可以檢測(cè)。
2、檢測(cè)時(shí)間短該檢測(cè)方法從取樣到檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，大約6時(shí)間，常規(guī)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)、耐鹽試驗(yàn)至少需要3-4個(gè)月的時(shí)間。
3、準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好以基因組DNA為材料，不易受外界因素的影響，以592bp的 PCR擴(kuò)增條帶為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，減少人為判斷誤差，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。
4、縮短育種周期在絨毛白蠟的發(fā)芽期即可對(duì)其耐鹽性進(jìn)行早期檢測(cè)，大大縮短了絨毛白蠟?zāi)望}育種周期。


圖1 :SCAR標(biāo)記在Fl代絨毛白蠟單株中的PCR電泳譜帶圖。
其中M-DL2000Mark ；1-12-分別為耐鹽絨毛白蠟；13_23 鹽敏感絨毛白蠟。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1、挑選飽滿無(wú)病蟲害魯蠟3號(hào)品種(山東省林業(yè)科學(xué)研究院劉德璽選育的絨毛白蠟?zāi)望}新品種)F1代種子300粒，采自山東壽光試驗(yàn)站。分別放于1. 5ml離心管中，自來(lái)水沖洗干凈后浸泡lOmin，用70%乙醇滅菌30秒，再用0. 1 %氯化汞滅菌8分鐘，然后用無(wú)菌水洗滌5次，在無(wú)菌條件下接種到MS+5g/L瓊脂+30g/L蔗糖的萌發(fā)培養(yǎng)基中(pH值 5. 8)，每瓶培養(yǎng)基中10粒種子，共30瓶，培養(yǎng)條件為晝溫度25°C，夜溫度18°C，光照強(qiáng)度 40 μ mol · m_2 · s—1，光照時(shí)間14h · cf1 (培養(yǎng)條件下同)，獲得3葉1心種子苗。
其中MS 培養(yǎng)基組分為KN03 1900mg ·廠1，NH4NO3 1650mg ·廠1，MgSO4 · 7H20370mg · I/1，KH2PO4 170mg · I/1，CaCl2 · 2H20 440mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · ΙΛ ZnSO4 · 7H20 8. 6mg ·廠1，H3BO3 6. 2mg · Λ KI 0. 83mg ·廠1，NaMoO4 · 2H20 0. 25mg · ΙΛ CuSO4 · 5H20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · Λ Na2-EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7H2027. 8mg · L—1，鹽酸硫胺素 0. Img · L—1，鹽酸比哆醇 0. 5mg · L-1，煙酸 0. 5mg · L-1， 肌醇 IOOmg · L—1，甘氨酸 2. Omg · L-1。
2、挑選生長(zhǎng)一致的3葉1心種子苗連同根一起轉(zhuǎn)接MS+5g/L瓊脂+30g/L蔗糖 +200mMNaCl養(yǎng)基中(pH值5. 8)，每瓶培養(yǎng)基中6株種子苗，共30瓶，培養(yǎng)40d (培養(yǎng)條件同上)。篩選12株葉片全綠、生長(zhǎng)良好的為耐鹽株系，11株發(fā)育遲緩、葉片發(fā)黃為鹽敏感植株， 用CTAB法提取葉片基因組DNA。
CTAB提取方法為
1)取0. 05 0. Ig絨毛白蠟葉片，于液氮中研磨。加入800 μ 1 DNA提取緩沖液 含有 2 % (w/v)CTAB,20mmo 1 /LEDTA(pH = 8· 0)、100mmol/LTris-HCl (pH = 8.0)、1.4mol/ LNaCl和2% β -巰基乙醇，輕輕顛倒混勻；
2)于65°C水浴中溫育30min，每IOmin顛倒輕輕混勻，12000rpm，離心IOmin ；3)取上清700 μ 1，加入等體積氯仿/異戊醇04 1，V V)，輕輕顛倒混勻，4°C，12000rpm,離心 IOmin ；
4)取上清600 μ 1，加入等體積氯仿/異戊醇04 1，ν ν)，輕輕顛倒混勻，4°C， 12000rpm，離心 IOmin ；
5)取上清500 μ 1，加入2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，顛倒混勻，_20°C靜置30min ； 6) 40C，12000rpm,離心 IOmin ；
7)去上清，用預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀2次，4°C，lOOOOrpm，離心5min ；
8)在超凈工作臺(tái)干燥沉淀30min，力卩30 μ 1的滅菌ddH20溶解沉淀，待濃度和純度檢測(cè)后，置_20°C或_70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 3、以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標(biāo)記的兩條引物(引物1 5'TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ 1，20ng 基因組 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
4、在55°C的退火溫度下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性％iin，94°C變性 30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循環(huán)30次，72°C延伸IOmin0 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 0 %瓊月旨糖凝膠電泳上分離，GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。電泳Marker DL2000和試劑為TAKARA公司。
5、利用該SCAR標(biāo)記對(duì)絨毛白蠟?zāi)望}品種魯蠟3號(hào)Fl代植株進(jìn)行了 PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖1)，12株耐鹽植株中，10株擴(kuò)增出一條592bp的DNA條帶，說(shuō)明能擴(kuò)增出DNA 條帶的材料為耐鹽材料；11株鹽敏感植株都沒(méi)有擴(kuò)增出592bp的DNA條帶，說(shuō)明該材料為鹽敏感材料。
實(shí)施例2
1、挑選飽滿無(wú)病蟲害魯蠟3號(hào)(山東省林業(yè)科學(xué)研究院劉德璽選育的絨毛白蠟?zāi)望}新品種)F1代種子400粒，采自山東壽光試驗(yàn)站。浸泡于溫度為45°C的水中，每天換水 1次，4周種子露白后播種在草炭、珍珠巖、蛙石(體積比1 1 1)基質(zhì)中，溫度為25 530°C，相對(duì)濕度50 70%的溫室中，待幼苗長(zhǎng)到4片真葉時(shí)，將幼苗根部的草炭、珍珠巖和蛙石清洗干凈，然后移栽到盛有1/2濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。每個(gè)塑料容器10株，25個(gè)塑料容器共移栽250株，并每隔兩天將蒸發(fā)掉的水分用無(wú)離子水補(bǔ)充到原體積。
其中Hoagland’ s (霍格蘭氏)營(yíng)養(yǎng)液配方為硝酸鈣945mg · Γ1 ；硝酸鉀 607mg .L—1 ；磷酸銨 115mg .L—1 ；硫酸鎂 493mg-r1 ；鐵鹽溶液 2. 5ml .L—1 ；微量元素 5ml .L—1 ； PH = 6. 0。鐵鹽溶液七水硫酸亞鐵2. 78g ；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA. Na) 3. 73g ；蒸餾水 500ml ；pH = 5. 5。微量元素液碘化鉀 0. 83mg · L-1 ；硼酸 6. 2mg · L-1 ；硫酸錳 22. 3mg · L-1 ； 硫酸鋅 8. 6mg · L-1 ；鉬酸鈉 0. 25mg · L-1 ；硫酸銅 0. 025mg · L-1 ；氯化鈷 0. 025 · L-1。
2、挑選生長(zhǎng)一致的，15個(gè)塑料容器的植株，共150株，一周后開始加鹽。每天按 50mM NaCI增加鹽濃度，直至終鹽濃度達(dá)到150mM NaCI。培養(yǎng)于溫度25_30°C，相對(duì)濕度 50-70%的溫室20d，篩選10株葉片全綠、生長(zhǎng)良好的為耐鹽株系，10株發(fā)育遲緩、葉片發(fā)黃為鹽敏感植株，用CTAB法提取葉片基因組DNA。
3、以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標(biāo)記的兩條引物(引物1 5'TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ 1，20ng 基因組 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
4、在55°C的退火溫度下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性％iin，94°C變性 30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循環(huán)30次，72°C延伸IOmin0 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 0 %瓊月旨糖凝膠電泳上分離，GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。電泳Marker DL2000和試劑為TAKARA公司。
5、利用該SCAR標(biāo)記對(duì)絨毛白蠟?zāi)望}品種魯蠟3號(hào)Fl代植株進(jìn)行了 PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10株耐鹽植株中，10株都擴(kuò)增出一條592bp的DNA條帶，說(shuō)明能擴(kuò)增出DNA條帶的材料為耐鹽材料；10株鹽敏感植株都沒(méi)有擴(kuò)增出592bp的DNA條帶，說(shuō)明該材料為鹽敏感材料。
本發(fā)明所建立的檢測(cè)方法能準(zhǔn)確、快速的鑒定出耐鹽絨毛白蠟品種，為科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供了一種簡(jiǎn)便、快速、成本低廉的檢測(cè)絨毛白蠟抗性的技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法，步驟是(1)應(yīng)用SEQID NO. 1所示核酸序列為SCAR標(biāo)記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，利用所述SCAR標(biāo)記的兩條引物在M 56°C的退火溫度下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述SCAR標(biāo)記的兩條引物分別是引物 1 :5’ TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，；(2)將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀測(cè)PCR結(jié)果；(3)鑒定是否為耐鹽絨毛白蠟植株；如果PCR結(jié)果擴(kuò)增出一條592bp的DNA條帶，判定為耐鹽植株；如果PCR結(jié)果擴(kuò)增不出592bp的DNA條帶，判定為鹽敏感植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法，其特征在于步驟 (1)所述的 PCR 反應(yīng)總體積為 25 微升，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ 1，引物 1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ l，20ng 基因組 DNA 2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1) 所述的PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性％iin，94°C變性30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循環(huán) 30 次，72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測(cè)方法，是應(yīng)用SEQ ID NO.1所示核酸序列為SCAR標(biāo)記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，利用所述SCAR標(biāo)記的兩條引物在54～56℃的退火溫度下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀測(cè)PCR結(jié)果，進(jìn)行是否是耐鹽絨毛白蠟植株的鑒定；如果擴(kuò)增出一條592bp的DNA條帶為耐鹽植株；如果擴(kuò)增不出592bp的DNA條帶為鹽敏感植株。本發(fā)明可對(duì)絨毛白蠟植株在任何時(shí)期進(jìn)行耐鹽性檢測(cè)且不影響其正常生長(zhǎng)；可對(duì)絨毛白蠟植物分別歸于耐鹽和鹽敏感材料進(jìn)行快速分子檢測(cè)和判別；檢測(cè)迅速，費(fèi)用低。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102517398SQ20121000628
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者劉翠蘭, 夏陽(yáng), 李雙云, 束靖, 燕麗萍 申請(qǐng)人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院