專利名稱：檢測(cè)細(xì)胞dact2基因啟動(dòng)子區(qū)dna甲基化狀態(tài)的引物對(duì)及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)及試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性支氣管肺癌(簡(jiǎn)稱肺癌)是全世界范圍的高發(fā)病率的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率的上升速度亦高居腫瘤之首。其中大約80%的肺癌為非小細(xì)胞性肺癌(Gandara D,Narayan S, Lara PN,Jr. , Goldberg Z,Davies A,Lau DH,et al. Integration of novel therapeutics into combined modality therapy of locally advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2005 ；ll(13Pt 2) :5057s_5062s·)。2008 年世界范圍的統(tǒng)計(jì)表明，肺癌占惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的13% (160萬(wàn))，因肺癌死亡人數(shù)占總?cè)藬?shù)的18% (140 萬(wàn))。肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤、并且是男性癌癥患者死亡的首要原因。而在女性中，是第四位常見(jiàn)的惡性腫瘤，并且排在惡性腫瘤死亡原因的第二位。男性患者肺癌最高發(fā)的地區(qū)包括歐洲、北美和亞洲。盡管中國(guó)女性吸煙率較低(不足成人吸煙者總數(shù)的4%)，但卻有較高的肺癌摧患率，即每10萬(wàn)人中有21. 3個(gè)患者(Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E,Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011 ；61 (2) :69-90.)。 在發(fā)達(dá)國(guó)家中，肺癌5年存活率僅13% ;80%的患者在診斷肺癌后I年內(nèi)死亡。由于目前尚缺乏有效的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的方法，肺癌的早期診斷率僅為15%。因此，改善肺癌預(yù)后的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷。胃癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的消化道原發(fā)惡性腫瘤之一，在人類(lèi)惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的排位中居第二位，每年新增病例數(shù)超過(guò)600，000例，以日本、中國(guó)、東歐、南美為高發(fā)地區(qū)， 其中中國(guó)占到全世界胃癌發(fā)病例數(shù)的42 % (Washington K :7th edition of the AJCC cancer staging manual stomach. Ann Surg Oncol 2010,17 :3077-3079 ；Parkin DM,Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics,2002. CA J Clin.2005 ；5 :77-108 ； Juan Shang, AS Pena. Muhidisciplinary approach to underamnd the pathogenesis of gastric cancer. World J Gastroenterol, 2005,11 (27) :4131-4139.)。在我國(guó)男性、女性的胃癌死亡率均高于世界、發(fā)達(dá)及發(fā)展中國(guó)家的平均水平，男性居全世界排位中的第6位， 女性居第10位(段紀(jì)俊，陳萬(wàn)青，張思維.中國(guó)惡性腫瘤死亡率的國(guó)際比較.中國(guó)社會(huì)醫(yī)學(xué)雜志 2009 年 12 月第 26 卷第 6 期 Chinese Journal of Social Medicine, December2009, Vol. 26 (6) :377-378.)。胃癌起病隱襲，臨床癥狀往往不典型，病程的不同階段可出現(xiàn)不規(guī)律的腹痛、藥物不緩解、早飽、乏力、消瘦、便潛血陽(yáng)性等癥狀。胃鏡檢查雖然能夠較直觀的觀測(cè)胃內(nèi)粘膜病變，但最終診斷還是依賴于胃鏡下胃組織的病理活檢及手術(shù)標(biāo)本的病理診斷。單純外科手術(shù)切除并不能取得滿意的臨床效果，目前手術(shù)切除為主的綜合治療后， M分期I期患者的5年生存率僅為60-70%，而III、IV期患者的5年生存率甚至不超 20% (Hundahl SA, Phillips JL, Menck HR. The National Cancer Data Base Reporton poor survival of U.S. gastric carcinoma patients treated with gastrectomy Fifth Edition American Joint Committee on Cancer staging, proximal disease, and the “different disease，，hypothesis. Cancer 2000,88 :921-932.),因此胃癌預(yù)后不良。 多項(xiàng)大規(guī)模多中心對(duì)照研究均提示早診斷、早治療、尋求更為有效的化療藥物是提高胃癌生存率的有效措施。因此發(fā)現(xiàn)胃癌的早期診斷和治療的有效方法具有十分重要的意義。肺癌和胃癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤，目前由于尚缺乏早期診斷和治療的有效方法，病人預(yù)后常不良。因此針對(duì)肺癌和胃癌的診斷和治療手段，尤其是對(duì)腫瘤的早期診斷、殘留病灶及復(fù)發(fā)的檢測(cè)方法仍然十分有限，是目前迫切需要解決的問(wèn)題。近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)已逐漸成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)是相對(duì)于遺傳學(xué)而言的，其定義是指研究不依賴于DNA序列改變的可遺傳的基因表達(dá)變化的科學(xué)。表觀遺傳學(xué)概念的提出可以解釋部分經(jīng)典遺傳學(xué)所不能解釋的問(wèn)題如同卵雙生的雙胞胎具有完全相同的基因型，并在相同環(huán)境下成長(zhǎng)，但僅其中一人罹患腫瘤，而另一人身體健康，因此表觀遺傳改變?yōu)檫@一現(xiàn)象提供了合理的解釋。在腫瘤研究中，表觀遺傳學(xué)研究的范疇主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的主要方式，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化或全基因組范圍的低甲基化可以導(dǎo)致腫瘤。DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5號(hào)碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化改變可以是細(xì)胞癌變過(guò)程中的早期、頻發(fā)事件，因此特定基因的異常甲基化往往可以作為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)和預(yù)后判斷的手段等。近年來(lái)甲基化檢測(cè)手段不斷豐富，目前主要包括兩大類(lèi)一是亞硫酸氫鈉法(Sodium Bisulfite),包括亞硫酸氫鈉法依賴的基因測(cè)序法、亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法(COBRA)、甲基化特異性 PCR(Methylation Specific PCR, MSP)、甲基化敏感的單核苷酸擴(kuò)增法(Ms-SNuE)等；另一類(lèi)是甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性圖譜(MSRF)、 限制性標(biāo)記基因組掃描技術(shù)(RLGS)、差異性甲基化雜交分析(DMH)、甲基化CpG島擴(kuò)增子分析(MCA)等。特別是 1996 年 Herman 等(Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 ；93(18) :9821-9826.)發(fā)明了甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)技術(shù)后，優(yōu)化了 DNA甲基化的檢測(cè)方法，其突出優(yōu)點(diǎn)在于高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用及耗時(shí)均較少、不受限制性內(nèi)切酶的限制。MSP 的基本原理是DNA經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽硫化修飾后，CpG島上沒(méi)有發(fā)生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，最后轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶則保持不變，因此設(shè)計(jì)甲基化引物及非甲基化引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析結(jié)果，得出是否為甲基化的結(jié)論。人類(lèi)DACT (dapper, antagonist of beta-catenin)基因又名 dapper、dpr 和 frodo，該基因家族包括三個(gè)成員DACT1、DACT2和DACT3。人類(lèi)DACT2基因是2003年由 Kaoth 等(Katoh M. Identification and characterization of human DAPPERI and DAPPER2 genes in silico. Int J Oncol 2003 ；22(4) :907-913.)發(fā)現(xiàn)，該基因位于人類(lèi)染色體6q27，此位點(diǎn)是乳腺癌、肺癌和胃癌等惡性腫瘤常見(jiàn)的染色體缺失位點(diǎn)，因此推測(cè) DACT2可能是一個(gè)潛在的抑癌基因并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前針對(duì)DACT2的研究主要集中在胚胎發(fā)育領(lǐng)域，Waxman等(Waxman JS. Zebrafish Dapperl and Dapper2 play distinct roles in ffnt-mediated developmental processes. Development. 2004 ；131 :5909-21.) 認(rèn)為DACT2增強(qiáng)WNT/Ca2+-PCP信號(hào)通路中Stbm/Wntll的作用，調(diào)控原腸胚形成過(guò)程中細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。Cheyette 等(Cheyette BN, Waxman JS, Miller JR, Takemaru K, Sheldahl LC, Khlebtsova N,et al. Dapper, a Dishevelled-associated antagonist of beta-catenin and JNK signaling, is required for notochord formation. Dev Cell. 2002 ；2 :449-61.) 在非洲爪蟾胚胎脊索形成中發(fā)現(xiàn)DACT2是脊椎動(dòng)物脊索及頭部發(fā)育所必需的調(diào)節(jié)因子，其過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)WNT信號(hào)通路中Axin和GSK-3活性使β -catenin降解，同時(shí)DACT2是 Dvl的抑制因子,可抑制Dvl介導(dǎo)的β -catenin非依賴型Wnt通路中JNK活化。Hikasa等 (Hikasa H. The involvement of Frodo in TCF-dependent signaling and neural tissue development. Development. 2004 ；131 :4725-34.)發(fā)現(xiàn)在胚胎神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中 DACT2 通過(guò)影響Dvl和TCF調(diào)節(jié)Wnt下游靶基因。DACT2抑制Wntl介導(dǎo)β-catenin報(bào)告基因的熒光活性，抑制 WNT 信號(hào)通路激活(Waxman JS, Hocking AM, Stoick CL, Moon RT. Zebrafish Dapperl and Dapper2play distinct roles in ffnt-mediated developmental processes. Development 2004 ；131 (23) :5909-5921.)。相反的觀點(diǎn)認(rèn)為，DACT2 可能是 WNT 信號(hào)通路所必需的正向調(diào)控因子。此外，DACT2在TGF-β信號(hào)通路中的作用也已被發(fā)現(xiàn)。DACT2 促進(jìn)Nodal/TGF-β的I型受體經(jīng)溶酶體途徑降解抑制斑馬魚(yú)DACT2Nodal信號(hào)的中胚層誘導(dǎo)活性(Su Y, Zhang L, Gao X, Meng F, Wen J, Zhou H, et al. The evolutionalIy conserved activity of Dapper2in antagonizing TGF-beta signaling. FASEBJ 2007 ； 21(3) :682-690.)。Meng 等(Meng F,Cheng X,Yang L,Hou N,Yang X’Meng A. Accelerated re-epithelialization in Dpr2~deficient mice is associated with enhanced response to TGFbeta signaling. J Cell Sci2008 ； 121 (Pt 17) :2904-2912.)利用基因打靶技術(shù)制備了 DACT2基因完全敲除小鼠模型(Dact2-/_)，缺失DACT2基因?qū)π∈笈咛グl(fā)育、 生長(zhǎng)和腦的形態(tài)沒(méi)有影響，但是DACT2可以通過(guò)抑制TGF- β信號(hào)通路來(lái)抑制創(chuàng)傷皮膚的再表皮化，影響表皮細(xì)胞的遷移及粘附能力。綜上所述，DACT2在發(fā)育學(xué)中對(duì)WNT信號(hào)通路的調(diào)控作用尚存爭(zhēng)議，其在肺癌和胃癌中的表觀遺傳學(xué)改變及功能的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明人應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)方法率先對(duì)肺癌和胃癌細(xì)胞系及腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞DACT2基因呈高甲基化狀態(tài)，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)胞DACT2基因可能是肺癌和胃癌中新的抑癌基因，此外細(xì)胞DACT2基因的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)可能是一個(gè)嶄新的腫瘤分子標(biāo)記物。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人應(yīng)用MSP方法對(duì)大量肺癌和胃癌腫瘤組織標(biāo)本以及正常的肺組織及胃組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以明確細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)，即用于檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化狀態(tài)的一對(duì)特異性引物對(duì)，其包括甲基化引物和非甲基化引物，同時(shí)本發(fā)明還提供一種含有上述甲基化引物或非甲基化引物的試劑盒。本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5’ -GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’，下游引物核苷酸序列為 5’ -AACCCCACGAACGACGCCG-3’;所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5’ -TTGGGGTGT GTGTAGATITTGITITTTGT-3’，下游引物核苷酸序列為5’ -CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3’。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)肺癌和胃癌細(xì)胞的試劑盒，其中，該試劑盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)利用本發(fā)明所述引物對(duì)及試劑盒檢測(cè)肺組織及胃組織細(xì)胞，在肺癌及胃癌細(xì)胞中DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，甲基化率分別為41%和 56%，而在正常肺組織及胃組織細(xì)胞中，DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)，表明該基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)對(duì)于肺癌及胃癌細(xì)胞具有特異性；同時(shí)應(yīng)用本發(fā)明所述引物對(duì)及試劑盒可使檢測(cè)肺癌及胃癌細(xì)胞的靈敏度達(dá)到O. 5%，即1000個(gè)細(xì)胞中有5個(gè)甲基化的細(xì)胞就能夠被檢測(cè)出，這說(shuō)明DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)可作為肺癌和胃癌中新的分子標(biāo)志。本試劑盒首次選用細(xì)胞DACT2基因作為目標(biāo)基因，該基因是本發(fā)明人應(yīng)用MSP技術(shù)率先在肺癌和胃癌中篩選出的啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)的基因，具有首創(chuàng)性。因此，應(yīng)用本發(fā)明引物及試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)可作為肺癌和胃癌診斷、療效觀察、預(yù)后判斷、殘留病灶及復(fù)發(fā)檢測(cè)等的有力手段，而且，操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。


圖I以硫化修飾后的正常胃組織細(xì)胞DNA(非甲基化對(duì)照)、硫化修飾后的胃癌 PHM82細(xì)胞系DNA(甲基化對(duì)照)和ddH20(系統(tǒng)對(duì)照)建立對(duì)照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對(duì)肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行MSP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖所
/Jn ο圖2以硫化修飾后的正常胃組織細(xì)胞DNA(非甲基化對(duì)照)、硫化修飾后的胃癌 PHM82細(xì)胞系DNA(甲基化對(duì)照)和ddH20(系統(tǒng)對(duì)照)建立對(duì)照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對(duì)胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行MSP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖所圖3以硫化修飾后的正常胃組織細(xì)胞DNA(非甲基化對(duì)照)、硫化修飾后的胃癌 PHM82細(xì)胞系DNA(甲基化對(duì)照)和ddH20(系統(tǒng)對(duì)照)建立對(duì)照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對(duì)正常肺組織標(biāo)本和正常胃組織標(biāo)本進(jìn)行MSP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖所示。圖4將胃癌PHM82細(xì)胞系DNA(DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)100%甲基化)與正常胃組織細(xì)胞DNA(DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)100%非甲基化)按比例混合，進(jìn)行硫化修飾，此后用甲基化弓I物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖所示。
具體實(shí)施例方式經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)與推敲，本發(fā)明人選出一對(duì)特異性很好的甲基化及非甲基化的引物對(duì)，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)作為結(jié)果的檢出手段，得到了可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)在人類(lèi)肺癌和胃癌中具有較高的檢測(cè)特異性及靈敏性。利用所述引物對(duì)及試劑盒檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因甲基化狀態(tài)的靈敏度高，解決了上述現(xiàn)有技術(shù)中其他方法的檢出率低、結(jié)果不易分析、臨床難以推廣等一系列技術(shù)問(wèn)題，因此本發(fā)明所述的引物對(duì)及試劑盒可用于肺癌和胃癌的早期診斷、療效判定、殘留病灶及復(fù)發(fā)的檢測(cè)等。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如Primer-MF所述，即5’ -GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’，下游引物核苷酸序列如Primer-MR所述，即 5’ -AACCCCACGAACGACGCCG-3’ ；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如Primer-UF所述，即5’ -TTGGGGTGTGTGTAGATTTTGTTTTTTGT-3’，下游引物核苷酸序列如 Primer-UR 所述， 即5， -CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3，。利用上述甲基化引物，以硫化修飾后的DNA為模板進(jìn)行MSP擴(kuò)增，如果DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)存在甲基化，則會(huì)得到152bp大小的片段；如果DACT2基因未發(fā)生甲基化，則不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。基于此，本申請(qǐng)將該引物稱為甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的 Tm(50mM Na.) 52. 3，GC 含量 50% ;下游引物的 Tm(50mM Na+) 52. 4，GC 含量 68. 4%。利用上述非甲基化引物，以硫化修飾后的DNA為模板進(jìn)行MSP擴(kuò)增，如果DACT2 基因未發(fā)生甲基化，則會(huì)得到161bp大小的片段?；诖?，本申請(qǐng)將該引物稱為非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm(50mM Na+) 50. 8，GC含量34. 5% ;下游引物的 Tm(50mM Na+) 5L 9，GC 含量 52. 2% 0本發(fā)明提供的用于檢測(cè)肺癌和胃癌細(xì)胞的試劑盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還含有甲基化對(duì)照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)為100%甲基化的癌細(xì)胞DNA。在此，對(duì)該癌細(xì)胞沒(méi)有特別的限制，只要滿足“硫化修飾后的細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)100%甲基化”即可，例如可以為胃癌 PHM82細(xì)胞、肺癌H23細(xì)胞等。進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還含有非甲基化對(duì)照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)為100%非甲基化的正常細(xì)胞DNA。在此，對(duì)該正常細(xì)胞沒(méi)有特別的限制，只要滿足“硫化修飾后的細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)100%非甲基化”即可，例如可以為正常胃組織細(xì)胞、肺組織細(xì)胞等。進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還含有作為雙陰性系統(tǒng)對(duì)照的ddH20。進(jìn)一步，本發(fā)明的試劑盒還含有MSP反應(yīng)所需的下列成分50mMMgCl2，10XMSP buffer,IOmM dNTP mixture, Hot start Taq 酶。為更詳細(xì)地了解本發(fā)明，以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例一I、模板的制備(基因組DNA的提取及硫化修飾過(guò)程)DNA的制備獲取肺癌、胃癌組織標(biāo)本以及正常肺組織和胃組織標(biāo)本。在本實(shí)施例中各取5個(gè)肺癌組織標(biāo)本(LCl LC5)、5個(gè)胃癌組織標(biāo)本(GCl GC5)，2個(gè)正常肺組織標(biāo)本(NmLl和NmL2)以及2個(gè)胃組織標(biāo)本(NmGl和NmG2)。應(yīng)用酚-氯仿抽提的方法分別對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA提取，紫外分光光度儀測(cè)定吸光度(A)值確定其含量及純度。亞硫酸鹽修飾參考herman (J. G. Herman, J. R. Graff, S. Myohanen, B. D. Nelkinand S.B.Baylin, Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996)，9821-9826.)等報(bào)道的方法。取上述制備的基因組DNA，經(jīng)稀釋后精確取2ugDNA，加去離子水至終體積50ul，加入新鮮配制的3M的NaOH 5ul，37°C孵育25min。之后加入新鮮配制的IOmM的氫醌30ul及3M 亞硫酸氫鈉520ul混合均勻(其內(nèi)已加入新鮮配制的3M的NaOH，計(jì)算方法10ml 3M亞硫酸氫鈉中加入3M的NaOH 740ul)，50°C孵育16h，此后應(yīng)用DNA純化試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)純化并回收DNA，應(yīng)用50ul去離子水洗脫DNA，向其內(nèi)加入5ul 3M的NaOH以終止硫化修飾,用3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，最終硫化修飾后的DNA重新溶解在20ul去離子水中，得到DNA模板，立即使用或_20°C保存?zhèn)溆谩?、MSP 擴(kuò)增以甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的MSP反應(yīng)體系，以總體積25ul計(jì)，包括模板(硫化修飾后的DNA) 2ul ；甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’) 0. 5ul,下游引物(5，-AACCCCACGAACGACGCCG-3’) 0. 5ul ；50mM MgCl2 (Invitrogen 公司)0. 75ul ；10XMSPbuffer (緩沖液,Invitrogen 公司)2. 5ul ；IOmM dNTP mixture (Invitrogen 公司)1. 25ul ；Hot start Taq 酶(Invitrogen 公司，濃度為 5U/ μ L) 0. Iul ；ddH20 17. 4ul以非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的MSP反應(yīng)體系與以甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的MSP反應(yīng)體系的不同之處僅在于引物不同。具體地，以非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的MSP反應(yīng)體系，以總體積25ul計(jì),包括非甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-TTGGGGTGTGTGTAGATTTTGTTTTTTGT-3’) :0. 5ul,下游引物(5，-CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3，)0. 5ul ；其余組分及其用量均與以甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的MSP反應(yīng)體系中的相同。以上僅分別列舉了以甲基化引物和非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的MSP反應(yīng)體系中各組分的用量的一個(gè)例子，使用不同公司生產(chǎn)的MgCl2、MSP buffer緩沖液、dNTP mixture、Hot start Taq酶時(shí)，反應(yīng)體系中各組分的用量會(huì)有所不同，可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明對(duì)MSP反應(yīng)體系中各組分的用量沒(méi)有特別的限制，使用常規(guī)的用量即可。應(yīng)用上述MSP反應(yīng)體系對(duì)已制備的DNA模板(5個(gè)肺癌組織標(biāo)本LCl LC5、5個(gè)胃癌組織標(biāo)本GCl GC5，2個(gè)正常肺組織標(biāo)本NmLl和NmL2以及2個(gè)正常胃組織標(biāo)本NmGl 和NmG2)分別進(jìn)行擴(kuò)增，并以胃癌PHM82細(xì)胞系DNA為甲基化對(duì)照，以正常胃組織標(biāo)本(NG) 為非甲基化對(duì)照，以ddH20作為雙陰性的系統(tǒng)對(duì)照，擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，在95°C下變性30s，在62°C下退火30s，在72°C下延伸40s，共35個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)在72°C下延伸5min。3. MSP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)MSP產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀檢測(cè)并照相。
4.結(jié)果圖I以硫化修飾后的正常胃組織細(xì)胞DNA(非甲基化對(duì)照)、硫化修飾后的胃癌 PHM82細(xì)胞系DNA(甲基化對(duì)照)和ddH20(系統(tǒng)對(duì)照)建立對(duì)照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對(duì)肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行MSP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖所
/Jn ο圖中，LCl，LC2，LC3，LC4和LC5分別代表肺癌組織標(biāo)本；PHM82為M陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞系，此處作為甲基化對(duì)照；ddH20為雙陰性的系統(tǒng)對(duì)照，用以評(píng)估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如ddH20檢測(cè)的結(jié)果為雙陰性(M和U均為陰性)，則體系結(jié)果可信；NG為U陽(yáng)性的正常胃組織標(biāo)本，此處作為非甲基化對(duì)照。U代表非甲基化結(jié)果…代表甲基化結(jié)果；Marker為DL2000marker (分子量標(biāo)準(zhǔn)),上下兩條帶分別代表200bp和IOObp ；本體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小，U帶為161bp，M帶為152bp。圖2以硫化修飾后的正常胃組織細(xì)胞DNA(非甲基化對(duì)照)、硫化修飾后的胃癌 PHM82細(xì)胞系DNA(甲基化對(duì)照)和ddH20(系統(tǒng)對(duì)照)建立對(duì)照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對(duì)胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行MSP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖所
/Jn ο圖中，GCl，GC2，GC3，GC4和GC5分別代表胃癌組織標(biāo)本；PHM82為M陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞系，此處作為甲基化對(duì)照；ddH20為雙陰性的系統(tǒng)對(duì)照，用以評(píng)估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如ddH20檢測(cè)的結(jié)果為雙陰性(M和U均為陰性)，則體系結(jié)果可信；NG為U陽(yáng)性的正常胃組織標(biāo)本，此處作為非甲基化對(duì)照。U代表非甲基化結(jié)果…代表甲基化結(jié)果；Marker為DL2000marker (分子量標(biāo)準(zhǔn)),上下兩條帶分別代表200bp和IOObp ；本體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小，U帶為161bp，M帶為152bp。圖3以硫化修飾后的正常胃組織細(xì)胞DNA(非甲基化對(duì)照)、硫化修飾后的胃癌 PHM82細(xì)胞系DNA(甲基化對(duì)照)和ddH20(系統(tǒng)對(duì)照)建立對(duì)照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對(duì)正常肺組織標(biāo)本和正常胃組織標(biāo)本進(jìn)行MSP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖所示。圖中，NmLl和NmL2為正常肺組織標(biāo)本2例，NmGl和NmG2為正常胃組織標(biāo)本2例；PHM82為M陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞系，此處作為甲基化對(duì)照；ddH20為雙陰性的系統(tǒng)對(duì)照，用以評(píng)估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如ddH20檢測(cè)的結(jié)果為雙陰性(M和U均為陰性)，則體系結(jié)果可信；NG為U陽(yáng)性的正常胃組織標(biāo)本，此處作為非甲基化對(duì)照。U代表非甲基化結(jié)果…代表甲基化結(jié)果；Marker為DL2000marker (分子量標(biāo)準(zhǔn)),上下兩條帶分別代表200bp和IOObp ；本體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小，U帶為161bp，M帶為152bp。結(jié)果判讀方法如下應(yīng)用甲基化引物(圖中以M表示)進(jìn)行擴(kuò)增，有擴(kuò)增產(chǎn)物，并且應(yīng)用非甲基化引物(圖中以U表示)進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)本則判讀為完全甲基化結(jié)果；應(yīng)用甲基化引物及非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，均有擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)本判讀為部分甲基化結(jié)果；應(yīng)用非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，有擴(kuò)增產(chǎn)物，并且用甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)本則判讀為非甲基化結(jié)果。部分甲基化及完全甲基化的標(biāo)本均判讀為甲基化結(jié)果。如圖I所示，肺癌組織中，LCl、LC4和LC5為非甲基化結(jié)果，LC2和LC3為甲基化結(jié)果。如圖2所示，胃癌組織中，GC4和GC5為非甲基化結(jié)果，GCU GC2和GC3為甲基化結(jié)果。如圖3所示，正常肺組織(NmLl和NmL2)和正常胃組織(NmGl和NmG2)均為非甲基化結(jié)果。對(duì)照體系反應(yīng)正常，結(jié)果可信。實(shí)施例二臨床標(biāo)本檢測(cè)取106例肺癌組織標(biāo)本、95例胃癌組織標(biāo)本，4例正常肺組織標(biāo)本和7例正常胃組織標(biāo)本，進(jìn)行MSP擴(kuò)增，模板制備、MSP擴(kuò)增體系及條件、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)均與實(shí)施例一中的相同，檢測(cè)結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)下表I :表I
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5’-GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’，下游引物核苷酸序列為 5’ -AACCCCACGAACGACGCCG-3’;所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5’ -TTGGGGTGT GTGTAGATITTGITITTTGT-3’，下游引物核苷酸序列為5’ -CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3’。
2.一種檢測(cè)肺癌和胃癌細(xì)胞的試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求I中所述的甲基化引物或非甲基化引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于還含有甲基化對(duì)照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)100%甲基化的癌細(xì)胞DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于還含有非甲基化對(duì)照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)100%非甲基化的正常細(xì)胞DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于還含有作為雙陰性系統(tǒng)對(duì)照的ddH20。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于還含有MSP反應(yīng)所需的下列成分50mM MgCl2,10XMSP buffer, IOmMdNTP mixture, Hot start Taq 酶。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對(duì)及試劑盒。本試劑盒首次選用細(xì)胞DACT2基因作為目標(biāo)基因，該基因是本發(fā)明人應(yīng)用MSP技術(shù)率先在肺癌和胃癌細(xì)胞系及腫瘤組織中篩選出的啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)的基因，具有首創(chuàng)性。利用本發(fā)明所述試劑盒及特異性引物對(duì)檢測(cè)肺癌和胃癌腫瘤組織甲基化狀態(tài)的特異性好，可分別達(dá)到41％和56％；靈敏度高，達(dá)到5‰，即1000個(gè)細(xì)胞中有5個(gè)甲基化的細(xì)胞就能夠被檢測(cè)出。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞DACT2基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)可作為肺癌和胃癌診斷、療效觀察、預(yù)后判斷、殘留病灶及復(fù)發(fā)檢測(cè)等的有力手段，而且，操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102586425SQ20121000916
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者于源滋, 楊云生, 賈巖, 郭明洲, 韋立新, 韓為東 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院