人微小rna啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物及應(yīng)用。一種人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物，為Hsa-microRNA-145-5p啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化位點(diǎn)堿基序列的PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸定量甲基化測(cè)序的特異引物；所述的擴(kuò)增引物包括3對(duì)，所述的甲基化測(cè)序檢測(cè)的特異引物包括miR-145-S2、miR-145-S5、miR-145-S4。本發(fā)明對(duì)喉鱗癌或者其他人類(lèi)惡性腫瘤的篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測(cè)具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值及臨床意義。
【專利說(shuō)明】人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物及其應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種人屬微小RNA,具體涉及Hsa-microRNA-145_5p (Hsa-miR-145_5p)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化位點(diǎn)堿基序列的PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸定量甲基化水平測(cè)序的特異性引物，這些引物在腫瘤或其他疾病研究中的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
頭頸鱗癌為全世界第六位高發(fā)腫瘤，位居歐洲男性高發(fā)腫瘤的第4位，而喉鱗癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)源于喉黏膜上皮，發(fā)病率居頭頸鱗癌的第2位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界范圍內(nèi)喉鱗癌發(fā)病略有上升，且年輕化趨勢(shì)逐漸顯現(xiàn)。
[0002]喉解剖結(jié)構(gòu)局限且黏膜下淋巴管豐富，因此喉鱗癌具有局部侵襲及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)特性，成為患者治療后復(fù)發(fā)及預(yù)后不良的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，這也是近30年來(lái)喉鱗癌5年生存率并未有明顯提升的一個(gè)重要因素。在喉鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中勢(shì)必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的異常表達(dá)，如抑癌基因的下調(diào)表達(dá)，癌基因的上調(diào)表達(dá)。因此探索這些與喉鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)紊亂的分子生物學(xué)機(jī)制著重要的臨床意義。
[0003]microR NAs (miRNAs)是目前新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度約為22nt的內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，它能夠與其相應(yīng)靶基因信使RNA (mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3’ -UTR區(qū))結(jié)合，從而降解mRNA或抑制其翻譯。研究表明miRNAs與腫瘤關(guān)系密切，充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、惡性間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用。
[0004]甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要的修飾，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一。DNA甲基化則是最常見(jiàn)的甲基化修飾方式之一，可引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。其是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下，以s_腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過(guò)程。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在5’ -CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG是指由胞嘧啶(C)和鳥(niǎo)嘧啶(G)組成的一個(gè)2個(gè)核苷酸的鏈，當(dāng)中的P是C和G之間的磷酸，在哺乳動(dòng)物中CpG以兩種形式存在:一種是分散于DNA序列中；另一種呈現(xiàn)高度聚集狀態(tài)，人們稱之為CpG島(CpG island)，其是由胞嘧啶(C)和鳥(niǎo)嘧啶(G)組成的串聯(lián)重復(fù)序列，常位于CATbox附近，可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄的效率。人類(lèi)基因組中大小為IOO-1OOObp左右，富含CpG 二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態(tài)，并且CpG島常位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近，與56%的人類(lèi)基因組編碼基因相關(guān)，因此DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。
[0005]由于DNA甲基化與人類(lèi)腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活問(wèn)題。以往研究表明大量抑癌基因CpG島的局部高度甲基化要早于細(xì)胞惡性增生，故其甲基化的檢測(cè)可用于腫瘤的預(yù)測(cè)、診斷、分級(jí)以及預(yù)后評(píng)估。因此抑癌基因轉(zhuǎn)錄區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)研究已經(jīng)成為腫瘤領(lǐng)域中表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。
[0006]發(fā)明人通過(guò)microRNA 芯片(Agilent human 8*15k mi RNA V12.0)檢測(cè)了喉鱗癌患者及同患者癌旁正常黏膜切緣蠟包埋組織中差異表達(dá)的microRNA分子，發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中比癌旁正常黏膜組織中下調(diào)了約2.74倍(P〈0.05);而Hsa-miR-145-5p表達(dá)水平與喉鱗癌患者不良臨床參數(shù)成負(fù)相關(guān)，且表達(dá)水平越低，喉鱗癌患者的預(yù)后越差。因此發(fā)明人結(jié)合Hsa-miR-145-5p啟動(dòng)子甲基化的思路，探索喉鱗癌中Hsa-miR-145-5p轉(zhuǎn)錄抑制的分子生物學(xué)機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供Hsa-microRNA-145-5p(Hsa-miR-145-5p)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化位點(diǎn)堿基序列的PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸定量甲基化水平測(cè)序的特異性引物。本發(fā)明的思路是:發(fā)明人基于microRNA芯片(Agilent human 8*15k miRNA V12.0)檢測(cè)了喉鱗癌患者及同患者癌旁正常黏膜切緣蠟包埋組織中差異表達(dá)的microRNA分子，發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中比癌旁正常黏膜組織中下調(diào)了約2.74倍(P〈0.05);而Hsa-miR-145-5p表達(dá)水平與喉鱗癌患者不良臨床參數(shù)成負(fù)相關(guān)，且表達(dá)水平越低，喉鱗癌低表達(dá)患者的預(yù)后不良越差。因此Hsa-miR-145-5p作為抑癌基因在喉鱗癌中發(fā)揮重要生物學(xué)作用。為此，本發(fā)明在于明確Hsa-miR-145-5p為何在喉鱗癌組織及細(xì)胞株H印-2、TU-177中表達(dá)減低，進(jìn)一步結(jié)合DNA甲基化的思路，調(diào)取了 Hsa-miR-145-5p啟動(dòng)子1425個(gè)堿基序列，并進(jìn)行甲基化生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，瞄定了 336個(gè)堿基中可能有11個(gè)高甲基化位點(diǎn)(CpG site)，根據(jù)這些堿基，設(shè)計(jì)了 3段PCR擴(kuò)增引物，及相應(yīng)的經(jīng)亞硫酸鹽修飾后的焦磷酸定量測(cè)序引物，以明確這11個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平，從而試圖闡明Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌中轉(zhuǎn)錄抑制的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
[0008]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物，其中所述的引物為Hsa-microRNA-145-5p啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化位點(diǎn)堿基序列的PCR擴(kuò)增引物及焦磷酸定量甲基化測(cè)序特異引物；所述的PCR擴(kuò)增引物包括3對(duì)，分別為miR-145-Fl:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, miR-145-Rl:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ；m i R -1 4 5 - F I:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, m i R -1 4 5 - R I:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ;miR-145_F2:GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT,miR-145-R2:Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA ;所述的焦磷酸定量甲基化測(cè)序特異引物包括 miR-145-S2:AGTTTTGGGGGTGGG ;miR-145_S5:TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA ;miR-145_S4:TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。
[0009]上述人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物在制備用于喉鱗癌篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測(cè)試劑盒中的用途，尤其應(yīng)用于喉鱗癌離體組織或喉鱗癌細(xì)胞系ifep-2及TU-177中Hsa-microRNA-145-5p啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)。
[0010]本發(fā)明所述焦磷酸定量甲基化測(cè)序技術(shù)是指PyroMark CpG Assays技術(shù)，由QIAGEN公司研發(fā),其是基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)研發(fā)的CpG位點(diǎn)甲基化定量分析檢測(cè)體系。PyroMark CpG Assays基于引物延伸的Pyrosequencing技術(shù),通過(guò)將鏈合成過(guò)程中釋放出的焦磷酸(PPi)轉(zhuǎn)化成光信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)鏈的合成過(guò)程，通過(guò)檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C/T滲入的比例對(duì) 目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，其可以完全克服BSP法大量挑取單克隆測(cè)序的繁瑣及較高假陽(yáng)性率，以及MSP法不能獲得定量分析結(jié)果的缺點(diǎn)。其具有檢測(cè)全面、檢測(cè)準(zhǔn)確、檢測(cè)快速并能將甲基化水平定量化的優(yōu)點(diǎn)。
[0012]本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)特點(diǎn)和顯著的技術(shù)效果是:基于焦磷酸定量甲基化測(cè)序技術(shù)，利用甲基化生物信息學(xué)預(yù)測(cè)手段，針對(duì)Hsa-miR-145-5p啟動(dòng)子區(qū)域1467堿基中可能存在11個(gè)高甲基化點(diǎn)的336個(gè)堿基區(qū)域。為此，本發(fā)明提供了三段特異性PCR引物及焦磷酸測(cè)序引物，有效檢測(cè)出這11個(gè)位點(diǎn)的甲基化定量水平，明確了喉鱗癌細(xì)胞系H印-2、TU-177中Hsa-miR-145-5p表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。這無(wú)疑對(duì)喉鱗癌或者其他人類(lèi)惡性腫瘤的篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測(cè)具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值及臨床意義。[0013]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1:qRT-PCR 檢測(cè) Hsa-miR-145-5p 在 Hep-2, TU-177 及對(duì)照株 HOK 中的表達(dá)；A:miR-145-5p在HOK中相對(duì)表達(dá)量為6.79 ± 1.29，分別高于其在H印-2中的相對(duì)表達(dá)量1.00(P=0.001)及在 TU-177 中的相對(duì)表達(dá)量 1.17±0.53 (P=0.002)；
圖2:Hsa-mir-145-5p啟動(dòng)子甲基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果I (通過(guò)MethPrimer -DNA甲基化CpG島預(yù)測(cè)及引物設(shè)計(jì)在線軟件預(yù)測(cè))；
圖3:Hsa-mir-145_5p啟動(dòng)子甲基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果2 (通過(guò)CpG Island Searcher預(yù)
測(cè))；
圖4:H印-2、TU-177及HOK三個(gè)細(xì)胞株11個(gè)位點(diǎn)的甲基化測(cè)序定量顯示圖。
[0014]圖5:H印-2、TU_177及HOK 11個(gè)位點(diǎn)甲基化水平曲線圖，灰色框所示為高甲基化的2-7位點(diǎn)；
圖6:H印-2、TU-177及HOK中11個(gè)位點(diǎn)甲基化平均水平柱狀圖；
圖7: Hep-2, TU-177及HOK中2_7位點(diǎn)甲基化平均水平柱狀圖；
圖8:實(shí)施例PCR反應(yīng)條件。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0016]一、實(shí)驗(yàn)所需主要試劑、耗材及儀器
【權(quán)利要求】
1.一種人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物，其特征在于，所述的引物為Hsa-miCiORNA-145-5p啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化位點(diǎn)堿基序列的擴(kuò)增引物及焦磷酸定量甲基化測(cè)序的特異引物；所述的擴(kuò)增引物為3對(duì)，包括miR-145-Fl:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, miR-145-Rl:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ；m i R -1 4 5 - F I:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, m i R -1 4 5 - R I:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ;miR-145_F2:GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT,miR-145-R2:Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA ;所述的焦磷酸定量甲基化測(cè)序特異引物包括 miR-145-S2:AGTTTTGGGGGTGGG, miR-145_S5:TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA, miR-145_S4:TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。
2.權(quán)利要求1所述的人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物在制備用于喉鱗癌篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的人微小RNA啟動(dòng)子甲基化擴(kuò)增及測(cè)序引物應(yīng)用于喉鱗癌離體組織或喉鱗癌細(xì)胞系ifep-2及TU-177中Hsa-microRNA-145-5p啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103571830SQ201310359969
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月16日
【發(fā)明者】高偉, 王斌全, 張春明, 陳鋼鋼, 皇甫輝, 溫樹(shù)信, 張海利, 馮彥 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院