專利名稱：一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌株的篩選方法，尤其是涉及一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法。
背景技術(shù)：
達(dá)托霉素(Daptomycin)是由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)發(fā)酵產(chǎn)生的新型環(huán)狀酸性脂肽類抗生素，該菌種最早由Falcao de Morias和Dailia Maia在1961 年代從土耳其Ararat山土樣中分離篩選得到。達(dá)托霉素早在20世紀(jì)80年代就由禮萊公司研究人員發(fā)現(xiàn)并隨后制成靜脈針劑用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌感染。在20世紀(jì)80年代和90年代早期，進(jìn)行了 I期和II期試驗(yàn)，其中參與人員超過(guò)370名。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，達(dá)托霉素對(duì)皮膚和軟組織感染和菌血癥的效果令人鼓舞。劑量的提高對(duì)感染性心內(nèi)膜炎也有效。1997年，Cubist公司從禮萊公司取得達(dá)托霉素的專利權(quán)，并分別在菌血病和復(fù)雜的皮膚和軟組織感染中進(jìn)行了 I期和II期臨床試驗(yàn)。為了滿足病人對(duì)新型耐藥抗生素的迫切需求，2003年底，美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)經(jīng)過(guò)快速審理程序批準(zhǔn)注射用達(dá)托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治療由一些革蘭氏陽(yáng)性敏感菌株引起的并發(fā)性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染，如膿腫、手術(shù)切口感染和皮膚潰瘍。通過(guò)靜脈注射，達(dá)托霉素產(chǎn)生的藥代動(dòng)力學(xué)為線性，半衰期為8h。在各種動(dòng)物模型中，達(dá)托霉素對(duì)藥物敏感與耐藥性革蘭氏陽(yáng)性菌均有效力。正在進(jìn)行的第三階段研究在每天給藥一次的基礎(chǔ)上研究達(dá)托霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌引起的嚴(yán)重感染的藥效，包括皮膚和軟組織感染，群落獲得性肺炎和VRE感染。其副作用小，安全性高。玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)具有以下特征孢子鏈呈直型，沒(méi)有卷曲，每個(gè)鏈上多于10個(gè)孢子，孢子表面光滑可產(chǎn)生紅色及淺棕色水溶性色素；在瓊脂-葡萄糖平板培養(yǎng)基上生成質(zhì)地致密、絲絨狀或有皺折、干燥，不透明的白色的干粉；菌落正反面的顏色因基內(nèi)菌絲和孢子所產(chǎn)生色素各異而不一致，因基內(nèi)菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合較緊，故不易挑起；且不產(chǎn)生水溶性色素。由于其孢子顏色為紅色或紅褐色，生理生化試驗(yàn)表明其菌物學(xué)特征與已知模式菌株不同，因此被分類定義為玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)?？股刈鳛榇x終產(chǎn)物對(duì)其產(chǎn)生菌可能有幾個(gè)方面的作用1)作為終產(chǎn)物對(duì)參與抗生素生物合成的有關(guān)酶進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)；2)對(duì)產(chǎn)生菌本身有抑制、殺死作用。因此篩選產(chǎn)生菌對(duì)自身代謝產(chǎn)物的耐受性的提高，將有利于抗生素產(chǎn)量的提高。如杜潤(rùn)泮將原始的卡那霉素鏈霉菌(Streptomyces kanamyceticus)用I 10萬(wàn)倫琴的、射線照射其孢子懸液后，菌株由原來(lái)耐受100 500 u g/mL濃度的自身代謝產(chǎn)物達(dá)到耐2000 20000 u g/ mL高濃度的菌株，發(fā)酵單位比原始菌株分別提高33. 3%。王錦經(jīng)過(guò)紫外誘變處理小諾霉素產(chǎn)生菌，利用菌株抗自身代謝物特征選育獲得小諾霉素生產(chǎn)突變株發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提聞 了 34. 39 %。
近年來(lái)，雖然存在玫瑰孢鏈霉菌選育工作的相關(guān)報(bào)導(dǎo)，盧文玉(盧文玉.天津大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，39 20-14)報(bào)道了癸酸抗性突變株流加發(fā)酵法生產(chǎn)達(dá)托霉素的相關(guān)研究，周劍 (周劍.輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，2008，26 (5) :317-320)報(bào)道了利用氮離子注入玫瑰孢鏈霉菌選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的研究。但是利用聯(lián)合抗性法來(lái)進(jìn)行篩選一直被人們忽略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以玫瑰孢鏈霉菌為出發(fā)菌株，以葡萄糖、麥芽提取物、酵母提取物、CaCO3、瓊脂粉作為培養(yǎng)基的主要原料用于培養(yǎng)菌株孢子，應(yīng)用于菌株篩選工作。本發(fā)明采用的菌種為玫瑰孢鏈霉菌D1000-S3-2 (Streptomyces roseosporus D1000-S3-2)，已于2011年7月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏中心保藏編號(hào)CCTCC NO :M2011236，該菌種也可購(gòu)買于美國(guó)菌種保藏中心 (ATCC),菌株編號(hào)Streptomyces roseosporus ATCC 11379。本發(fā)明包括以下步驟I)將無(wú)菌水和玻璃珠裝入離心管，滅菌備用；2)將DAl合成培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)好的孢子刮入離心管；3)將離心管置于振蕩器上震蕩，將孢子打散并均勻分散，得孢子懸液；4)配制DAl合成培養(yǎng)基,分裝至三角瓶,滅菌備用；5)分別配制達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)液和鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾后備用；6)分別取達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)液添加入DAl合成培養(yǎng)基，迅速倒板，制成100、200、300、 400、500、600、700mg/L的達(dá)托霉素濃度梯度平板，設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照；7)分別取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)液添加入DAl合成培養(yǎng)基，迅速倒板，制成0. 2,0. 4,0. 6、 0. 8、I. O、I. 2、I. 4mg/L的鏈霉素濃度梯度平板，設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照；8)將步驟3)制得的孢子懸液稀釋后涂布在達(dá)托霉素濃度梯度平板和鏈霉素濃度梯度平板上培養(yǎng)；9)觀察達(dá)托霉素濃度梯度平板和鏈霉素濃度梯度平板的菌落生長(zhǎng)情況，以與對(duì)照相比菌落有明顯減少的濃度為該抗生素對(duì)菌株的最小抑制濃度(MIC)；10)制備2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的抗性平板；11)制備2 5倍鏈霉素MIC濃度的抗性平板；12)制備2 5倍鏈霉素MIC濃度和2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的復(fù)合抗性平板；13)將孢子懸液稀釋后涂布在步驟10) 12)所得的2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的抗性平板、2 5倍鏈霉素MIC濃度的抗性平板、2 5倍鏈霉素MIC濃度和2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的復(fù)合抗性平板上，設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照；14)將涂布好孢子的平板培養(yǎng)，長(zhǎng)出的菌落即為達(dá)托霉素與鏈霉素抗性突變株；15)挑取形態(tài)和顏色變化較大的突變子到同等濃度的抗性平板純化后轉(zhuǎn)接到DAl 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，挑選高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏。在步驟2)中，所述刮入離心管可采用接種環(huán)刮入離心管。在步驟3)中，所述震蕩的時(shí)間可為3 5min。在步驟4)中，所述DAl合成培養(yǎng)基的組成可為葡萄糖4. 0g/L,麥芽提取物10g/L，酵母提取物4g/L，CaC032g/L，瓊脂15g/L。在步驟8)中，所述稀釋的倍數(shù)可為10 100倍；所述孢子懸液可加入20%甘油； 所述培養(yǎng)的條件可為培養(yǎng)7 9天，培養(yǎng)溫度28 30°C。在步驟14)中，所述平板培養(yǎng)的條件可于28 30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 9天。本發(fā)明篩選所得的抗性菌株搖瓶發(fā)酵生物量達(dá)到30g/L，達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到 59mg/L,相對(duì)原始菌株產(chǎn)量提高63. 8%。相對(duì)于其他篩選方法,本發(fā)明的菌株篩選方法簡(jiǎn)便、高效，可用于菌株的大量篩選，對(duì)于玫瑰孢鏈霉菌的達(dá)托霉素生產(chǎn)能力有顯著的提高。 而達(dá)托霉素的作為一種新的脂肽類抗生素，具有很好的醫(yī)用市場(chǎng)前景，因此該發(fā)明的菌株篩選方法具有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。


圖I為達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖。在圖I中，橫坐標(biāo)為時(shí)間/min ;峰7. 171相應(yīng)的峰面積為966. 878。圖2為發(fā)酵液樣品的HPLC圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為時(shí)間/min ;左峰7. 202相應(yīng)的峰面積為1726. 35，右峰為14. 631。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例I :達(dá)托霉素最低抑菌濃度的確定采用固體培養(yǎng)基DAl包括葡萄糖4. Og/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物4g/L， CaC032g/L,瓊脂15g/L ;分別取達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)液濾液適量添加入DAl合成培養(yǎng)基，迅速倒板，制成100、200、300、400、500、600、700mg/L的達(dá)托霉素濃度梯度平板。同時(shí)設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照。將孢子懸液稀釋10 100倍后均勻的涂布在達(dá)托霉素濃度梯度平板上。培養(yǎng)7 9天，培養(yǎng)溫度28 30°C，觀察各平板的菌落生長(zhǎng)情況。不同濃度的達(dá)托霉素對(duì)玫瑰孢鏈霉菌生長(zhǎng)的影響參見表I。表I不同濃度的達(dá)托霉素對(duì)玫瑰孢鏈霉菌生長(zhǎng)的影響
達(dá)托霉素濃度(mg/L) (〕 100 200 300 400 500 600 700生長(zhǎng)情況 +_f+ +++ +++ +++---注+++表示長(zhǎng)得好；++表示長(zhǎng)得一般；+表示長(zhǎng)得差表示單菌落數(shù)量稀少由表I可知，隨著達(dá)托霉素濃度的增加，玫瑰孢鏈霉菌在篩選平板上的單菌落逐漸減少，當(dāng)達(dá)托霉素濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，平板上菌落形態(tài)很差，而濃度達(dá)到500mg/L時(shí)單菌落的數(shù)量已經(jīng)很稀少，故可以確定玫瑰孢鏈霉菌對(duì)達(dá)托霉素的最低抑制濃度(MIC)為 400mg/L。實(shí)施例2 :鏈霉素最低抑菌濃度的確定采用如實(shí)施例I所述培養(yǎng)條件，考察不同濃度鏈霉素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。其區(qū)別在于所使用的抗生素為鏈霉素。取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)液濾液適量添加入DAl合成培養(yǎng)基，迅速倒板，制成0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4mg/L的鏈霉素濃度梯度平板。同時(shí)設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照。將孢子懸液稀釋10 100倍后均勻的涂布在鏈霉素濃度梯度平板上。培養(yǎng)7 9天，培養(yǎng)溫度28 30°C，觀察各平板的菌落生長(zhǎng)情況。不同濃度的鏈霉素對(duì)玫瑰孢鏈霉菌生長(zhǎng)的影響參見表2。表2不同濃度的鏈霉素對(duì)玫瑰孢鏈霉菌生長(zhǎng)的影響
權(quán)利要求
1.一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于所述玫瑰孢鏈霉菌 D1000-S3-2 (Streptomyces roseosporus D1000-S3-2),已于 2011 年 7 月 5 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號(hào)CCTCC NO M2011236 ；所述篩選方法包括以下步驟1)將無(wú)菌水和玻璃珠裝入離心管，滅菌備用；2)將DAl合成培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)好的孢子刮入離心管；3)將離心管置于振蕩器上震蕩，將孢子打散并均勻分散，得孢子懸液；4)配制DAl合成培養(yǎng)基，分裝至三角瓶，滅菌備用；5)分別配制達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)液和鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾后備用；6)分別取達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)液添加入DAl合成培養(yǎng)基，迅速倒板，制成100、200、300、400、 500、600、700mg/L的達(dá)托霉素濃度梯度平板，設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照；7)分別取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)液添加入DAl合成培養(yǎng)基，迅速倒板，制成O.2,0. 4,0. 6,0. 8、 I. O、I. 2、I. 4mg/L的鏈霉素濃度梯度平板，設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照；8)將步驟3)制得的孢子懸液稀釋后涂布在達(dá)托霉素濃度梯度平板和鏈霉素濃度梯度平板上培養(yǎng)；9)觀察達(dá)托霉素濃度梯度平板和鏈霉素濃度梯度平板的菌落生長(zhǎng)情況，以與對(duì)照相比菌落有明顯減少的濃度為該抗生素對(duì)菌株的最小抑制濃度；10)制備2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的抗性平板；11)制備2 5倍鏈霉素MIC濃度的抗性平板；12)制備2 5倍鏈霉素MIC濃度和2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的復(fù)合抗性平板；13)將孢子懸液稀釋后涂布在步驟10) 12)所得的2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的抗性平板、2 5倍鏈霉素MIC濃度的抗性平板、2 5倍鏈霉素MIC濃度和2 5倍達(dá)托霉素MIC濃度的復(fù)合抗性平板上，設(shè)置不添加抗生素的平板作為對(duì)照；14)將涂布好孢子的平板培養(yǎng)，長(zhǎng)出的菌落即為達(dá)托霉素與鏈霉素抗性突變株；15)挑取形態(tài)和顏色變化較大的突變子到同等濃度的抗性平板純化后轉(zhuǎn)接到DAl培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，挑選高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏。
2.如權(quán)利要求I所述的一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于在步驟2)中，所述刮入離心管采用接種環(huán)刮入離心管。
3.如權(quán)利要求I所述的一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于在步驟3)中，所述震蕩的時(shí)間為3 5min。
4.如權(quán)利要求I所述的一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于在步驟4)中，所述DAl合成培養(yǎng)基的組成為葡萄糖4. Og/L,麥芽提取物10g/L，酵母提取物 4g/L，CaC032g/L，瓊脂 15g/L。
5.如權(quán)利要求I所述的一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于在步驟8)中，所述稀釋的倍數(shù)為10 100倍。
6.如權(quán)利要求I所述的一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于在步驟8)中，所述孢子懸液加入20%甘油。
7.如權(quán)利要求I所述的一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于在步驟8)中，所述培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)7 9天，培養(yǎng)溫度28 30°C。
8.如權(quán)利要求I所述的一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，其特征在于在步驟8)中，在步驟14)中，所述平板培養(yǎng)的條件于28 30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 9天。
全文摘要
一種可高產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌的篩選方法，涉及一種菌株的篩選方法。以玫瑰孢鏈霉菌為出發(fā)菌株，以葡萄糖、麥芽提取物、酵母提取物、CaCO3、瓊脂粉作為培養(yǎng)基的主要原料用于培養(yǎng)菌株孢子，應(yīng)用于菌株篩選工作。篩選所得的抗性菌株搖瓶發(fā)酵生物量達(dá)到30g/L，達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到59mg/L，相對(duì)原始菌株產(chǎn)量提高63.8％。相對(duì)于其他篩選方法，菌株篩選方法簡(jiǎn)便、高效，可用于菌株的大量篩選，對(duì)于玫瑰孢鏈霉菌的達(dá)托霉素生產(chǎn)能力有顯著的提高。而達(dá)托霉素的作為一種新的脂肽類抗生素，具有很好的醫(yī)用市場(chǎng)前景，菌株篩選方法具有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102586147SQ20121003842
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者盧英華, 吳意珣, 張智翔, 敬科舉 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)