專利名稱：長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
I、小麥育種目標(biāo)和其野生近緣種小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植面積最大、總產(chǎn)量?jī)H次于玉米的糧食作物。近半個(gè)世紀(jì)來，世界小麥的總產(chǎn)量已經(jīng)增加了兩倍多，其中，優(yōu)良的小麥品種對(duì)提高小麥產(chǎn)量發(fā)揮了決定性的 作用。目前小麥育種研究主要集中在四個(gè)方面提高小麥產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本；分子標(biāo)記輔助育種；小麥抗逆性育種；小麥營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)(何中虎等，2006)。為完成以上育種目標(biāo)，小麥本身的遺傳資源已經(jīng)明顯不夠，而與小麥具有近緣關(guān)系的許多野生物種中卻存在著大量小麥中所沒有的有利遺傳資源。因此，利用小麥近緣野生種中的優(yōu)良基因資源培育小麥新品種已經(jīng)成為小麥育種的目標(biāo)之一。普通小麥(AABBDD，2n=42)是異源六倍體植物，屬于禾本科小麥屬普通小麥種(Triticum aestivum L.),與小麥屬關(guān)系比較近的屬有大麥屬(Hordeum)、披堿草屬(Elymus)、帽草屬(Asperella)、細(xì)坦麥屬(Sitanion)、新麥草屬(Psathyrostachys)、棱軸草屬(Crithopsis)、帶芒草屬(Taeniatherum)、冰草屬(Agropyron)、簇毛麥屬(Haynaldia)、黑麥屬(Secale)、異形花屬(Heteranthelium)、無芒草屬(Henrardia)、旱麥草屬(Eremopyrum)、山羊草屬(Aegilops)。這些野生近緣種植物中蘊(yùn)含著大量?jī)?yōu)良基因，是一個(gè)巨大的具有潛在利用價(jià)值的遺傳基因庫。該基因庫的優(yōu)良基因如得到利用，對(duì)小麥遺傳改良將具有重要的價(jià)值，不僅能提高其產(chǎn)量、改良品質(zhì)，更能將豐富的抗病、抗逆基因轉(zhuǎn)入小麥中，改良小麥的抗病性和抗逆性。目前已經(jīng)與小麥進(jìn)行雜交的種屬有黑麥屬(Sando et al, 1953)、族毛麥屬(Sears et al, 1953; Hyde et al, 1953)、偃麥草屬(Dvordket al, 1974)、山羊草屬(Sears et al, 1956; Chapmna et al, 1970)、大麥屬(Kruse etal, 1973; Islam et al, 1975)等。這些遠(yuǎn)緣雜交的成功為近緣野生種的抗旱、耐鹽堿以及抗病蟲害的優(yōu)良基因向小麥基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)移奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，使得從小麥近緣種屬中尋找或開拓新的重要基因資源成為可能。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記與作物育種相結(jié)合，它不僅彌補(bǔ)了作物育種中傳統(tǒng)的選擇準(zhǔn)確率低的缺點(diǎn)，而且加快了育種進(jìn)程。2、小麥的赤霉病抗性小麥生產(chǎn)中倍受關(guān)注的病害為小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB),它是全球性致使小麥產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的主要病害之一，也是影響中國小麥生產(chǎn)的主要病害(陸維忠等，2001)。赤霉病大流行年份病穗率達(dá)50% 100%，減產(chǎn)高達(dá)10% 40% (姚金保等，2000)。該病由多種鐮刀菌引起，病原菌侵染小麥籽粒后產(chǎn)生多種真菌毒素，這些毒素對(duì)人畜有害(Bottalico et al, 1998),特別是其中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素，在50mg/kg的濃度下，就可以抑制人類T細(xì)胞80%的活性，嚴(yán)重威脅著人類和家畜的健康(宋鳳英等，2005)。我國長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)是小麥赤霉病的多發(fā)區(qū)和重災(zāi)區(qū)，近年來黃淮麥區(qū)和關(guān)中麥區(qū)小麥赤霉病發(fā)生也日趨嚴(yán)重，影響著國內(nèi)小麥主產(chǎn)區(qū)的糧食安全。隨著全球性氣候變暖和玉米-小麥輪作制度的增加，近10多年來小麥赤霉病在北美和歐洲也大面積發(fā)生，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失(Bai et al，2004)。因此，國內(nèi)外很多學(xué)者都圍繞小麥赤霉病開展了廣泛的研究工作。我國從上世紀(jì)70年代中期開始對(duì)小麥赤霉病進(jìn)行研究，研究結(jié)果認(rèn)為小麥赤霉病抗性具有遺傳基礎(chǔ)，并且培育出一批抗性較強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)小麥新品種，其中蘇麥3號(hào)目前已成為全世界公認(rèn)的赤霉病高抗品種(姚金寶等，2000)。多年的小麥抗赤霉病育種研究表明，小麥種內(nèi)抗赤霉病的資源很少，而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗性資源在小麥育種實(shí)際中也難以有效利用。從小麥近緣物種中開拓新的赤霉病抗源是小麥抗赤霉病育種中的重要策略，并且進(jìn)行了大量的相關(guān)研究。如小麥赤霉病抗源，現(xiàn)已成功地進(jìn)行了小麥與大賴草(Leymus racemosus)、長(zhǎng)穗偃麥草(Lophopyrum eIongatum) >中間偃麥草(L. intermedium)、黑麥(Secale cereale)、族毛麥(Haynaldia villosa)等多種近緣物種的雜交，并獲得了一些具有赤霉病抗性的材料(Oliver R. E, et al.，2005)。3、長(zhǎng)穗偃麥草赤霉病抗性及特異分子標(biāo)記發(fā)展 偃麥草屬(Thinopyrum)是禾本科大麥族(Horseae),小麥亞族(Triticeae)中的多年生草本植物，與普通小麥的親緣關(guān)系較近，世界范圍內(nèi)約有50種，主要分布在溫帶和寒帶地區(qū)。該屬適應(yīng)性和繁殖能力較強(qiáng)，并且具有許多優(yōu)良基因和性狀，如抗病、抗寒、抗旱、耐鹽堿和穗大多花等，是小麥遺傳改良中極具應(yīng)用價(jià)值的小麥近緣物種之一。自然界中存在3種類型的長(zhǎng)穗偃麥草，即二倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Th. elongatum, 2n=14)、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Th. elongatum, 2n=28)和十倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Th. ponticum, 2n=70)。二倍體長(zhǎng)穗偃麥草具有E染色體組，E染色體組是偃麥草屬多倍體物種的基本染色體組(Dewey etal, 1984)。一整套中國春-長(zhǎng)穗偃麥草二體異附加系、代換系的獲得為深入研究長(zhǎng)穗偃麥草奠定了很好的基礎(chǔ)(Dvordk J, et al.，1974)。有研究表明在長(zhǎng)穗偃麥草的IE (劉登才等，2001 ；Jauhar PP, et al. , 2009)、7E(Somers DJ, et al. , 2003 ；Shen X R, et al. , 2004 ；徐國輝等，2009 ；Zhang X L, et al. ,2011)染色體可能具有良好的赤霉病抗性基因，因此，長(zhǎng)穗偃麥草已成為改良普通小麥遺傳基礎(chǔ)、提高赤霉病抗性的重要野生近緣物種之一(王黎明等，2005)。目前小麥赤霉病的鑒定方法主要有自然誘發(fā)感病、室內(nèi)人工離體接種鑒定、田間人工接種鑒定等，但對(duì)于赤霉病抗性的鑒定，研究者使用的方法和表示參數(shù)各不相同，而且抗性鑒定結(jié)果受環(huán)境條件的影響比較大，建立穩(wěn)定可靠的赤霉病接種方法和鑒定標(biāo)準(zhǔn)是評(píng)價(jià)品種抗病性最關(guān)鍵的問題。為了使抗性鑒定更加準(zhǔn)確，研究者將目標(biāo)轉(zhuǎn)移到分子標(biāo)記。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker Assisted Selection, MAS)是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物品種改良過程中進(jìn)行選擇的一種輔助手段(Ribaut et al, 1998) 0其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，達(dá)到提高育種效率的目的。分子標(biāo)記輔助選擇是分子標(biāo)記技術(shù)用于作物改良的重要領(lǐng)域，是傳統(tǒng)育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。隨著20世紀(jì)80年代中后期PCR技術(shù)的誕生和人類基因組計(jì)劃及之后的水稻等多種作物基因組計(jì)劃的相繼推動(dòng)下，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的研究和應(yīng)用得到迅速發(fā)展。通常，目前所指的分子標(biāo)記就是DNA標(biāo)記，在不同植物中利用不同的方法發(fā)展分子標(biāo)記用于研究已經(jīng)成為重要的遺傳研究?jī)?nèi)容。
赤霉病抗性比較復(fù)雜，人工鑒定結(jié)果受環(huán)境的影響較大，因此利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇將是有效途徑。在長(zhǎng)穗偃麥草向小麥轉(zhuǎn)移優(yōu)良的抗赤霉病基因的研究中，已有部分研究進(jìn)行了長(zhǎng)穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記研究.長(zhǎng)穗偃麥草IE和3E染色體的3個(gè)特異的RAPD標(biāo)記0PE-0513(i(i、0PF-037(i(i和0PF-154(|(|，可以用來快速鑒定IE和3E染色體(劉樹兵等，1998)。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，建立了一個(gè)偃麥草E染色體組特異的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，該標(biāo)記也可以作為E染色體的特異SSR標(biāo)記(尤明山等，2003)。Shen等(2004)通過分布在第7連鎖群的52對(duì)SSR引物進(jìn)行特異擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)5對(duì)引物在7E上表現(xiàn)出特異性。陳國躍等(2007)利用已知植物抗病基因編碼氨基酸保守區(qū)域設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，應(yīng)用RGAP分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了一套完整的長(zhǎng)穗偃麥草IE 7E染色體的特異RGAP標(biāo)記。張麗等(2008)利用AFLP引物篩選出28個(gè)長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體特異分子標(biāo)記，并將其中5個(gè)轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記，可用于小麥背景中長(zhǎng)穗偃麥草遺傳物質(zhì)的檢測(cè)。然而，以上發(fā)展的長(zhǎng)穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記不但數(shù)量少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了小麥抗性育種實(shí)際的需要，而且染色體特異性 及穩(wěn)定性還不理想，發(fā)展更多的覆蓋相關(guān)染色體的分子標(biāo)記，進(jìn)一步研究這些分子標(biāo)記與抗病，抗逆基因的連鎖關(guān)系，在小麥抗逆，抗病育種實(shí)際中利用這些標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇是非常重要和迫切需要的。4、分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展4. I基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionFragment LengthPolymorphism, RFLP) 1974年Grodzicker等創(chuàng)立了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù),用作腺病毒溫度敏感突變的遺傳標(biāo)記(Grodzicker et al，1974)，它是一種以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標(biāo)記。利用特定的限制性內(nèi)切酶切割不同的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，通過凝膠電泳分離出不同帶，然后與克隆DNA探針進(jìn)行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個(gè)體特異性的RFLP圖譜。4. 2基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記4. 2. I 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD) 1990 年由Williams等人利用PCR技術(shù)發(fā)展的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法(Williams et al, 1990)。它利用隨機(jī)引物(一般為flObp)通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴(kuò)增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。但是RAPD受反應(yīng)條件影響較大，因而其檢測(cè)的重復(fù)性較差。4. 2. 2 序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence Tagged Sites, STS) 1989 年 Olson 等提出，是對(duì)以特定對(duì)引物序進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增的一類分子標(biāo)記的統(tǒng)稱。通過設(shè)計(jì)特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而可用來擴(kuò)增基因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。4. 2. 3 簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)也稱微衛(wèi)星 DNA (Tautz etal, 1989; Love et al, 1990),是一類由I 6個(gè)堿基組成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)序列,其中最常見是雙核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，如(CA)n、(AT)n, (TG)n, (GGC)n, (GAT)n等。每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目一般為10飛0，它們廣泛分布于絕大多數(shù)真核生物基因組中，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)重復(fù)數(shù)目的不同。微衛(wèi)星序列兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定多態(tài)性。SSR標(biāo)記一般檢測(cè)到的是單一的多等位基因位點(diǎn)，而且呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子。但是，傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法工作量大，需花費(fèi)大量人力、物力，而且效率較低。4. 2. 4 簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)(inter-simple sequence repeat, ISSR)Zietkeiwitcz等于1994年提出的一種以微衛(wèi)星為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，它檢測(cè)的是兩個(gè)SSR之間的一段短DNA序列上的多態(tài)性。由于SSR序列廣泛分布于高等生物的基因組中，所以ISSR具有很強(qiáng)的多態(tài)性。目前，ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于多種植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性等研究中，但在長(zhǎng)穗偃麥草中沒有進(jìn)行研究.4. 2. 5 反轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)間擴(kuò)增多態(tài)性(inter-retrotransposon amplifiedpolymorphism, I RAP)其原理是根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中LTR的保守序列設(shè)計(jì)引物，這些引物在PCR過程中可以與LTR序列退火，從而擴(kuò)增出相鄰的同一家族的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子成員間的片段。也可以根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶基因的相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增(Kalendar et al. 1999)。目前，IRAP 分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于大麥(Kalendar et al, 1999;Kalendar etal, 2000; Leigh et al, 2003)、柑橘(Bretoet al, 2001)、網(wǎng)茅(Yannic et al, 2004)、馬鈴薯等植物的遺傳研究中。4. 2. 7 反轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(retrotransposon microsatelliteamplified polymorphism, REMAP) 一種基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記技術(shù)(Kalendar etal, 1999)。REMAP技術(shù)原理是根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR保守序列和微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，然后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與鄰近的微衛(wèi)星間的片段，從而檢測(cè)出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與鄰近簡(jiǎn)單重復(fù)序列之間的多態(tài)性。4. 3基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedFragment Length Polymorphism, AFLP)AFLP是1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測(cè)DN A多態(tài)性的新方法(Zbaeauet al, 1993)。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，先利用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切割成不同大小的DNA片段，再使雙鏈人工接頭與酶切片段相邊接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加f 3個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板DNA基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同檢測(cè)出多態(tài)性。隨著技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，AFLP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)鑒定(Thomas et al, 1995)、遺傳圖譜構(gòu)建(Margueset al, 1998)、目的基因定位及遺傳多態(tài)性檢測(cè)(Pakniyat et al, 1997)等方面。4. 4基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記4. 4. I 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) Lander 于 1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記，是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，其多態(tài)性頻率大于1%。從分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)。4. 4. 2 多樣性微陣列技術(shù)(Diversity arrays technology, DArT) Jaccoud等(2001)開發(fā)了一種新的分子標(biāo)記技術(shù)多樣性微陣列技術(shù)(Diversity arraystechnology, DArT),并成功應(yīng)用于水稻研究中。DArT技術(shù)是依賴芯片雜交的方法來區(qū)分基因組中座位多態(tài)性的差異。將待檢測(cè)的不同樣本的基因組DNA等量混合后經(jīng)相關(guān)限制性內(nèi)切酶處理，根據(jù)電泳結(jié)果選擇回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而達(dá)到基因組復(fù)雜性減少，該部分DNA即為基因組代表(Genomic representation),并通過相關(guān)過程將該部分DNA固定到玻片上形成點(diǎn)陣列的芯片。以不同樣本單獨(dú)經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理所獲的基因組代表為探針，并組成相應(yīng)的探針組合對(duì)芯片進(jìn)行雜交，由于不同樣本的基因組DNA序列有差異，因而與芯片上同一點(diǎn)序列雜交的效率不一致，芯片上只有與探針DNA互補(bǔ)的點(diǎn)才具有雜交信號(hào)，通過掃描儀可識(shí)辨不同顏色雜交信號(hào)的強(qiáng)弱或有無來確定待檢測(cè)樣本的遺傳差別。DArT技術(shù)已在大麥、擬南芥、小麥和高梁等植物中得到應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用運(yùn)用抑制消減雜交(Suppressionsubtractive hybridization, SSH)技術(shù)(Diachenko L, et al. , 1996)去除實(shí)驗(yàn)組(二倍體長(zhǎng)穗偃麥草)及對(duì)照組(普通小麥中國春)兩個(gè)基因組DNA之間的同源序列，富集差異序列，獲得長(zhǎng)穗偃麥草特異的DNA片段，并根據(jù)特異片段發(fā)展長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記，這些特異標(biāo)記可跟蹤長(zhǎng)穗偃麥草的
染色體或染色質(zhì)，可用于抗赤霉病基因的連鎖分析，可用于分子標(biāo)記輔助選擇，從而提高小麥抗赤霉病和抗逆性育種的效率。本發(fā)明利用SSH技術(shù)，獲得長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異的分子標(biāo)記36個(gè)；所述的長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記，它是下列36對(duì)引物之一第I 對(duì)MEG-1303L: 5，-TGGATGGTGGCTGCTGAT-3， R: 5 ’ -CCGTTATGCTGCCCGATT-3，第2 對(duì)MEG-1258L: 5，-ACCAGCGGTAGCCCAGTCT-3’R: 5 ’ -ATCTGTGCGATTTCCCTA-3’第3 對(duì)=MEG-I253L: 5，-CCAGCGGTAACCCAGTCT-3 ’R: 5，-AGTGCGATTTCCCTGACG-3，第4 對(duì)=MEG-I211L: 5，-GCTCATCAACAGCCTACC-3，R: 5，-TGTGACTTTCCCACCATT-3，第5 對(duì)MEG-I242L: 5，-GAAAGGCTCCGAGAACAC-3 ’R: 5，-GTCAAAGGCTTAGCAATC-3 ’第6 對(duì)=MEG-I177L: 5，-TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5，-GGCAGGTACGACACCTAT-3，第7 對(duì)MEG-2301L: 5，-TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5，-TGGAACGGATGAAGACCC-3 ’第8 對(duì)MEG-2249 L: 5，-GCCGACTCAGGAGGTGTT-3’
R: 5 ’ -TTGCATCCGTTGGTATTG-3 ’第9 對(duì)MEG-2304L: 5，-TGTCCCACCATTGAGCAG-3，R: 5 ’ -CCGGGCAGGTTAGACTATA-3’第10 對(duì)MEG-2237L: 5，-CAGTGGCTTGTCAGAGTT-3， R: 5，-CGTAGCAGGATGGTTAGA-3 ’第11 對(duì)MEG_2422L: 5，-GCTTGCGTCATCTCCTTC-3，R: 5 ’ -TGATATGCCACTTCTCCTC-3，第12 對(duì)MEG-2407L: 5 ’ -TTAGTTAGGCAGTAGAGCA-3’R: 5，-CGACAAAGTAAGGTGGTG-3 ’第13 對(duì)MEG-2371L: 5，-TGGGTAATGCCCGTCCTC-3，R:5’ -TCTGAATGTTTCCGCTTGT-3’第14 對(duì)MEG-3258L: 5，-ATAGGGTTGCCAGTGAGGAG-3’R: 5，-GATTCATCATTTCCCATAGAG-3，第15 對(duì)MEG_3273L: 5 ’ -TTTACAAGGTGAAGGTCT-3 ’R: 5 ’ -CATTGCGGACTATGATTT-3 ’第16 對(duì)MEG-3236L: 5，-AGTGGCTTGTCAGAGTTG-3 ’R: 5，-CGTAGCAGGATGGTTAGA-3 ’第17 對(duì)MEG-3239L: 5，-TGCGATTTCCCTGTCATT-3 ’R: 5，-TCCCAGCCAGATCAAGAG-3’第I8 對(duì)MEG_3254 L: 5，-ATCTGTGCGATTTCCCTG-3，R: 5，-GCGGTAGCCAAGTCTGGT-3 ’第19 對(duì)MEG-3253L: 5，-CCAGCGGTAACCCAGTCT-3 ’R: 5 ’ -AGTGCGATTTCCCTGACG-3，第20 對(duì)MEG-3293L: 5 ’ -TGTTCACTCAGCCATCTC-3’R: 5，-ATCAACTTCAGCATCTTTA-3，第21 對(duì)MEG-3267L: 5，-AGGGGCAACAAGGATAAG-3，〔0103Ur °3-GCAGGTTCTTCCACCATTAI3.〔0104〕 llsx4:MEG-4i
〔0105Ur°3iqottgcgtcatctccttc-3 .
〔0106Ur °3-TTCGGTCATAGTTGCTCTTCI3.〔0107〕 H 27 迓sEG-r。
〔0108Ur°3-CCGTCTGTTACTCCATCGI3.
〔01 Osr °3-CTCTGAAGCGGCGTCTGC-3.
〔oils H 28 X4 :MEG-r3
〔0111ur°3-CCTTGTGAGCCCAGTTATI3.
I--iO112U R :°3-GCAGGTTCTTCCACCATTAI3.
〔0113〕 H 29 X4seg-4483
I--iO114I——IL :°3-ATCCCAATCTCAAATCAAG-3.
I--iO115I——IR :°3-TCAAATACTCAGCACGAAT-3.
〔0116〕 n30x4:MEG-53g
I--iO117I——IL :°3-CCCCAGGCAGAGGAACTA-3.
I--iO118U R :°3-CCCGGGCAGGTACATCTCI3.
〔0119〕鋮 31X4SEG-5I
〔012Sr°3_o>>tctcggagccatcat-3 .
I--iOI 21I——IR :°3-GGCCAGGTTCACATAAGG-3.
〔0122〕 H 32x4:MEG-5i
〔0123Ur°3-CATCTTCAGCGGTCTTGCI3.
〔0124I——Ir °3-CGAGCGTGTTGGGTAAGT-3.
〔0125〕鋮 33x4:meg-53
〔0122r°3-AAGTCAAGGCTGTCCCATA-3.
〔0127Ur °3-acttttcccatgctcaca—3 .
〔0128〕 H 34X4SEG-5I
〔0129Ur°3-ATTGAGCCTGCCGTAGAGI3.
11
R: 5，-GTCATTGAGCGTATCCTGTT-3’第35 對(duì)MEG_5456L: 5，-TCGCTGTCGTGCTTATCT-3，R: 5 ’ -TGTATTTGGTGTTCCCTCC-3，第36 對(duì)MEG_5333L: 5 ’ -TTTGTGACGAAGAGGAGCAT-3，R: 5，-GCCCGTAGACAGGAGAAGT-3，。本發(fā)明還公開了上述長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記在小麥抗赤霉病基因的連 鎖分析中的應(yīng)用。本發(fā)明所獲長(zhǎng)穗偃麥草染色體特異標(biāo)記在不同材料和不同世代間表現(xiàn)穩(wěn)定，可用于小麥背景中長(zhǎng)穗偃麥草染色質(zhì)的鑒定，可用于抗性基因的連鎖分析，也可作為特異分子標(biāo)記用于小麥抗赤霉病育種中進(jìn)行輔助選擇。由此本發(fā)明還公開了所述長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇，在提高小麥抗赤霉病和抗逆性育種的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的分子標(biāo)記發(fā)展技術(shù)在其他植物中已經(jīng)應(yīng)用，但在長(zhǎng)穗偃麥草中沒有應(yīng)用，本發(fā)明所獲長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記來自植物本身，對(duì)環(huán)境影響較小。并且這些標(biāo)記可用于長(zhǎng)穗偃麥草向小麥轉(zhuǎn)移染色體片段過程中的易位系鑒定，可用于抗赤霉病基因的連鎖分析，可作為特異分子標(biāo)記鑒定長(zhǎng)穗偃麥草染色質(zhì)而用于小麥抗赤霉病和抗逆性育種中。本發(fā)明的分子標(biāo)記重復(fù)性好，擴(kuò)增穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，為SSH技術(shù)在植物領(lǐng)域的應(yīng)用提供了成功案例。


圖I :酶切片段與接頭的連接效率1、3 PCR primer I 和 18s_254F ;2、4 :18s_254F 和 18s_254R。圖2兩輪PCR的擴(kuò)增片段I:消減后第一輪 PCR (PCRprimer I) ；2:未消減第一輪 PCR (PCRprimer I) ；3:消減后第二輪 PCR (Nest primer I 和 2) ；4:未消減第二輪 PCR (Nest primer I 和 2)。圖3消減雜交的效率檢測(cè)I 5 :消減后2輪PCR產(chǎn)物;6 10 :未消減2輪PCR產(chǎn)物.1、6 :18循環(huán);2、7 23循環(huán);3、8 :28循環(huán);4、9 :33循環(huán);5、10 :38循環(huán)。圖4消減文庫的克隆I 14:不同的克隆。圖5基因組特異分子標(biāo)記在不同材料中的擴(kuò)增(引物MEG_23Q1)IDA1E;2:DA2E;3:DA3E4:DA4E5:DA5E;6:DA6E;7:DA7E;8:EE;9:CS;10:Y158;11:Y16;12:N13;13:0425;14:Y14。圖6 :長(zhǎng)穗偃麥草染色體特異標(biāo)記的穩(wěn)定性I 2 :DS3E(3D) X 安農(nóng) 8455 的 Fl 代；3 20 :Y16XDS3E(3A)的 F2 代。圖7 :長(zhǎng)穗偃麥草染色體特異標(biāo)記的穩(wěn)定性I 2 :Y16XDS7E(7A)的 Fl 代；3 20 :Y16XDS7E(7A)的 F3 代。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I實(shí)驗(yàn)材料和PCR弓I物序列(I)實(shí)驗(yàn)材料普通小麥中國春(CS)，二倍體長(zhǎng)穗偃麥草(EE)，中國春-長(zhǎng)穗偃麥草二體附加系DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E (以上材料由加拿大農(nóng)業(yè)部的Dr. Fedax惠贈(zèng)，材料原始文獻(xiàn)為((Disomic and ditelosomic additions of diploid Agropyron elongatumchromosomes to Triticum aestivum》);揚(yáng)麥158 (Y158,由江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)科所利用揚(yáng)麥4號(hào)/ST1472 / 506育成，品種登記號(hào)為GS02001-1997),揚(yáng)麥16 (Y16，即揚(yáng)0-126是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)科所用揚(yáng)91F138和揚(yáng)90-30雜交育成)，寧麥13 (N13,即寧0078，國審麥2006004,由江蘇省農(nóng)科院糧食作物研究所從寧麥9號(hào)系選育)，揚(yáng)麥14(Y14，即揚(yáng)0-139， 江蘇里下河農(nóng)科所用揚(yáng)麥158和揚(yáng)麥6號(hào)雜交育成)，上述材料有江蘇省里下河農(nóng)科所提供，均有市售；安農(nóng)8455 (An8455，可從安徽華韻生物科技有限公司購買)。(2)引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI公布的18s rRNA基因的核苷酸序列(GenBank HQ870412. 1)，在兩個(gè)Rsa I 位點(diǎn)間序列設(shè)計(jì)引物，18s-254F :GCTCTGGATACATTAGCATG GGATA (SEQ ID No. I)；18s-254R TCGGCATCGTTTATGGTTGAG (SEQ ID No. 2)。其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 254bp,引物18S-254F和18S-254R所擴(kuò)增片段可在構(gòu)建文庫時(shí)檢測(cè)連接效率和消減效率。依據(jù)試劑盒(PCR-SeIect cDNA Subtraction Kit, Clontech 公司)中提供的接頭 I (adaptor I)和接頭 2R(adaptor 2R)序列設(shè)計(jì)以下三個(gè)引物。PCRprimer I CTAATACGACTCACTATAGGGC(SEQID No. 3) ；Nest primer I TCGAGCGGCCGCCCGGG CAGGT (SEQ ID No. 4) ；Nest primer 2 AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT (SEQ ID No. 5)。實(shí)施例2基因組DNA的提取供試材料生長(zhǎng)至兩葉一心期，以SDS法提取基因組DNA。其步驟如下(I)取幼嫩葉片(約0. lg)，剪碎裝入2ml的離心管中，置于液氮中冷卻，用研磨棒碾碎至粉末狀；(2)離心管放置于室溫稍冷卻，加入700 U I的緩沖液A，輕輕混勻，然后65°C水浴20min,期間每隔5min上下顛倒混勻一次；緩沖液A:NaCl29. 2gIM Tris-HCl100mlEDTA18. 6gSDS15gddH20定容至IL滅菌后用。(3)取出稍冷卻至室溫，加入苯酚和氯仿各350 iU，上下顛倒，充分混勻，抽提5min ；(4) 12000rpm，離心lOmin，將上清液吸取到一個(gè)新的離心管中；(5)加入約750ii I氯仿,上下顛倒,充分混勻,抽提5min ；(6) 12000rpm，離心lOmin，將上清液吸取到一個(gè)新的離心管中；(7)加入約560 U I異丙醇，輕慢混勻，室溫放置lOmin，可見絮狀沉淀；
(8) I2OOOrpm,離心 lOmin,棄去上清液；(9)加500 u I 70%的乙醇溶液洗滌兩次，每次2_3min.室溫晾干；(10)晾干的DNA溶解于20iil TER中，37°C溫浴45min. _20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3抑制消減雜交文庫的構(gòu)建利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建雜交文庫，具體步驟如下
(I)DNA酶切和連接及效率檢測(cè)。通過Rsa I酶(Clontech公司)對(duì)長(zhǎng)穗偃麥草、中國春的DNA進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)總體積50ii L，37°C孵育24h，中間補(bǔ)加一次RsaI 1.5iiL。長(zhǎng)穗偃麥草的酶切產(chǎn)物分別與接頭I、接頭2R進(jìn)行連接。連接反應(yīng)后對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行連接效率檢查，連接產(chǎn)物進(jìn)行2輪雜交、2輪PCR擴(kuò)增，相關(guān)操作按PCR-Select cDNASubtraction Kit說明進(jìn)行。長(zhǎng)穗偃麥草和中國春基因組DNA經(jīng)Rsa I酶切后的電泳結(jié)果顯示未消化的基因組DNA位于凝膠加樣孔的頂端，表明提取的基因組DNA沒有發(fā)生降解，質(zhì)量較好。而消化后的基因組DNA則表現(xiàn)為小于2500bp彌散的片段，酶切后DNA片段集中在200bp-2000bp，和預(yù)期結(jié)果一致。將酶切后的實(shí)驗(yàn)組DNA片段與接頭I和接頭2R進(jìn)行連接后得到實(shí)驗(yàn)組-I和實(shí)驗(yàn)組-2。以18s rRNA作為參照基因，利用18s rRNA基因特異性引物18S-254F和18S-254R，在長(zhǎng)穗偃麥草和中國春中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為254bp的片段，而具有接頭的片段利用PCRprimer I和18s_254F可擴(kuò)增出850bp左右的片段，2種長(zhǎng)度片段的亮度比較就可反映連接效率。以實(shí)驗(yàn)組-I和實(shí)驗(yàn)組-2為模板，用引物18S-254F和PCR primerI獲得850bp左右的片段，表明連接成功。該產(chǎn)物的亮度相當(dāng)于18S-254F和18s_254R擴(kuò)增所得產(chǎn)物的亮度的1/4，這表明酶切產(chǎn)物與接頭的連接效率滿足要求(圖I)。(2)消減雜交。第一輪消減雜交是將具有接頭I和接頭2R連接的長(zhǎng)穗偃麥草RsaI酶切基因組DNA分別與中國春Rsa I酶切基因組DNA (IOOng U L-I)混合，雜交完成后立即進(jìn)入第二輪。在PCR管中加入變性后的中國春Rsa I酶切基因組DNA和第一輪雜交產(chǎn)物，68°C維持24h，加入200ii L稀釋液，然后68°C 7min終止非特異性雜交，雜交產(chǎn)物貯存于-20°C保存。(3)抑制性PCR擴(kuò)增。取稀釋后的第二輪消減雜交產(chǎn)物、未消減雜交對(duì)照DNA加至無菌PCR管中進(jìn)行第一輪抑制性PCR。第一輪PCR首先在72°C作用5min以補(bǔ)平接頭，立即進(jìn)行如下循環(huán)94°C，2min ；94°C 40s,66°C 40s, 72°C I. 5min，28 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。取第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為第二輪PCR的模板。反應(yīng)體系中除Nest Iprimer和Nest 2primer (10 u M)替換 PCR primer I 外，其他成分相同。第二輪 PCR 程序94°C 2min ；94°C 45s, 68°C 45s, 72°C I. 5min, 15個(gè)循環(huán)；72°C 5min。2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。其余樣品儲(chǔ)存于_20°C。以長(zhǎng)穗偃麥草和中國春基因組DNA經(jīng)消減雜交的產(chǎn)物和未經(jīng)消減雜交的產(chǎn)物為模板分別進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)連續(xù)的彌散型條帶(圖2)。由圖可見消減產(chǎn)物主要分布在150bp 2000bp的范圍內(nèi)，與酶切產(chǎn)物的片段大小相近。經(jīng)過消減雜交的模板在彌散的條帶中有一些較集中的條帶，應(yīng)為實(shí)驗(yàn)組中特有的差異片段。經(jīng)第二輪PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物濃度高于第一輪PCR。說明經(jīng)過二次PCR使得差異片段特異性擴(kuò)增，從而得到富集。(4)消減雜交效率。取稀釋10倍后的消減雜交與未消減雜交對(duì)照的二輪PCR產(chǎn)物，加入引物 18s-254F 和 18s-254R 進(jìn)行 PCR。PCR 程序94°C 45s, 58°C 40s, 72°C lmin, 12循環(huán)結(jié)束后從每管取出5 PCR產(chǎn)物，剩余的樣品繼續(xù)進(jìn)行4個(gè)循環(huán)后再分別取出5 ULPCR產(chǎn)物。每4個(gè)循環(huán)重復(fù)一次，直至28個(gè)循環(huán)結(jié)束。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR結(jié)果(圖3)。從圖中可以看出，未消減組在18個(gè)循環(huán)即出現(xiàn)254bp的特異性條帶，而消減組在23個(gè)循環(huán)才表現(xiàn)254bp的特異性條帶，說明消減效率較高。(5)消減片段的連接反應(yīng)。將經(jīng)過消減后的第二輪PCR產(chǎn)物與pMD18/19-T載體(TaKaRa, Code:D102A)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)，藍(lán)白斑篩選構(gòu)建抑制消減雜交文庫。實(shí)施例4感受態(tài)大腸桿菌的制備和轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞(Bio Basic, No. BS525)(I)取少量?jī)龃婢甏竽c桿菌(E. coli)DH5 a，在LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱(37 °C )中培養(yǎng)16 20h。(2)挑取一個(gè)單菌落，接種于含2ml SOB培養(yǎng)液中，恒溫?fù)u床(37 °C，250rpm/min) 上培養(yǎng)12 16h。(3)接種Iml的培養(yǎng)物到500ml錐形瓶中(內(nèi)含100ml SOC培養(yǎng)液)，恒溫?fù)u床(37 0C，250rpm/min)上培養(yǎng)至 OD600 0. 35。(4)迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中20min，期間緩慢搖勻使內(nèi)容物充分均勻冷卻。同時(shí)將2個(gè)50ml離心管置于冰上預(yù)冷，為下一步做準(zhǔn)備。(5)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4°C,4000rpm離心15min,棄去上清。(6)用16ml的溶液A小心的懸浮細(xì)菌，冰上放置15min。(7) 4°C, 4000rpm 離心 15min,收集菌體。(8)用4ml溶液B重新懸浮細(xì)菌，分裝，80iil/管，液氮速凍，_70°C保存。(9)用于轉(zhuǎn)化時(shí)，將IOOpg到IOng DNA加到感受態(tài)細(xì)胞(冰上溶解)中。(10)細(xì)胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37°C培養(yǎng)5min或42°C培養(yǎng)90s，然后再次冰上放置2min。(11)加入Iml SOC培養(yǎng)基，37°C溫和搖動(dòng)培養(yǎng)lh。(12)在選擇性培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)細(xì)胞，恒溫培養(yǎng)箱(37°C )中培養(yǎng)12 16h。實(shí)施例5菌落PCR與測(cè)序?qū)⒕N接種到固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行菌落PCR。在96孔培養(yǎng)板孔中加入含有氨芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基30iU/孔，用滅菌槍頭從轉(zhuǎn)化平板上挑取一個(gè)白色菌落，在培養(yǎng)液中輕輕吹打幾下，確保槍頭上的菌體吹入培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)箱30min。配制PCR反應(yīng)母液，在另一塊96孔板中，順序加入預(yù)先準(zhǔn)備的菌落液0.5 ill和PCR反應(yīng)母液9.5 iil，將PCR板混勻離心后進(jìn)行反應(yīng)。最后PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。根據(jù)菌落PCR的結(jié)果，選擇適合大小的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。PCR具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見表I和表2。表I菌落PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記，它是下列36對(duì)引物之一第1 對(duì)=MEG-I303L: 5’ -TGGATGGTGGCTGCTGAT-3’R: 5’ -CCGTTATGCTGCCCGATT-3’第 2 對(duì)=MEG-I258L: 5’ -ACCAGCGGTAGCCCAGTCT-3’R: 5’ -ATCTGTGCGATTTCCCTA-3’第 3 對(duì)=MEG-I253L: 5’ -CCAGCGGTAACCCAGTCT-3’R: 5’ -AGTGCGATTTCCCTGACG-3’第 4 對(duì)=MEG-I211L: 5’ -GCTCATCAACAGCCTACC-3’R: 5’ -TGTGACTTTCCCACCATT-3’第 5 對(duì)=MEG-I242L: 5’ -GAAAGGCTCCGAGAACAC-3’R: 5， -GTCAAAGGCTTAGCAATC-3’第 6 對(duì)=MEG-I177L: 5’ -TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5’ -GGCAGGTACGACACCTAT-3’第 7 對(duì)MEG-2301L: 5’ -TTGGGCTCAAGAACATTA-3’R: 5， -TGGAACGGATGAAGACCC-3，第 8 對(duì)MEG-2249L: 5’ -GCCGACTCAGGAGGTGTT-3’R: 5’ -TTGCATCCGTTGGTATTG-3’第 9 對(duì)MEG-2304L: 5’ -TGTCCCACCATTGAGCAG-3’R: 5’ -CCGGGCAGGTTAGACTATA-3’第 10 對(duì)MEG-2237L: 5’ -CAGTGGCTTGTCAGAGTT-3’R: 5， -CGTAGCAGGATGGTTAGA-3，第 11 對(duì)MEG-2422L: 5’ -GCTTGCGTCATCTCCTTC-3’R: 5’ -TGATATGCCACTTCTCCTC-3’第 12 對(duì)MEG-2407L: 5， -TTAGTTAGGCAGTAGAGCA-3，R: 5， -CGACAAAGTAAGGTGGTG-3，第 13 對(duì)MEG-2371L: 5’ -TGGGTAATGCCCGTCCTC-3’R: 5- -TCCCAGCCAG>TCMG>G-:rH 15 IGI3IL:°3-ATCTGTGCGATTTCCCTG-TR: 5、 IGCGGTAGCCAAGTCTGGT-:rH 15smG-31L:°3-CCAGCGGTAACCCAGTCTI:rR: 5、 -AGTGCGATTTCCCTGACG-Tm20 smG_3iL: 5、 ITGTTCACTCAGCCATCTC-:r匁°3—ATCAACTTCAGCATCTTTA—r鋮 21 lolcoiL: 5- ι>οοοοο ο οο>^ οιω.R: 5、 ITACACTACCGACGAGCAG-:rm22 L:°3-ATGAGCCCAGTTGAGTTGTTTI:rR: 5、 ITACTATGGTTGACCACCTAAAGAG-:rm23 1013 ㈢L:°3-GCTCATCMCAGCCT>cc-:rR:°3ITGTGACTTTCCCACCATT-:rm 24 L:°3-TMCGCCGACACTTAGGA-TR: 5、-GGMACCCAGGGACATCAI:rm25 X4smG-41L: 5、 -CCTTGTGAGCCCAGTTATI:rR:°3-GCAGGTTCTTCCACCATTA—rM 26 SlfL: 5、 IGCTTGCGTCATCTCCTTC-:r 3R: 5’ -TTCGGTCATAGTTGCTCTTC-3’第 27 對(duì)MEG-4280L: 5’ -CCGTCTGTTACTCCATCG-3’R: 5’ -CTCTGAAGCGGCGTCTGC-3’第 28 對(duì)MEG-4353 L: 5’ -CCTTGTGAGCCCAGTTAT-3’R: 5’ -GCAGGTTCTTCCACCATTA-3’第 29 對(duì)MEG-4483L: 5’ -ATCCCAATCTCAAATCAAG-3’R: 5’ -TCAAATACTCAGCACGAAT-3’第 30 對(duì)MEG-535QL: 5’ -CCCCAGGCAGAGGAACTA-3’R: 5’ -CCCGGGCAGGTACATCTC-3’第 31 對(duì)MEG-5385L: 5’ -CAATCTCGGAGCCATCAT-3’R: 5， -GGCCAGGTTCACATAAGG-3’第 32 對(duì)MEG-5260L: 5’ -CATCTTCAGCGGTCTTGC-3’R: 5’ -CGAGCGTGTTGGGTAAGT-3’第 33 對(duì)MEG-5377L: 5’ -AAGTCAAGGCTGTCCCATA-3’R: 5’ -ACTTTTCCCATGCTCACA-3’第 34 對(duì)MEG-5254L: 5’ -ATTGAGCCTGCCGTAGAG-3’R: 5’ -GTCATTGAGCGTATCCTGTT-3’第 35 對(duì)MEG-5456L: 5’ -TCGCTGTCGTGCTTATCT-3’R: 5’ -TGTATTTGGTGTTCCCTCC-3’第 36 對(duì)MEG-5333L: 5’ -TTTGTGACGAAGAGGAGCAT-3’R: 5， -GCCCGTAGACAGGAGAAGT-3，。
2.權(quán)利要求I所述長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記在小麥抗赤霉病基因的連鎖分析中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異分子標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇，在提高小麥抗赤霉病和抗逆性育種的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體為根據(jù)NCBI公布的18srRNA基因的核苷酸序列，在兩個(gè)RsaⅠ位點(diǎn)間序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)去除兩個(gè)基因組DNA之間的同源序列,富集差異序列，獲得長(zhǎng)穗偃麥草特異的DNA片段并進(jìn)行測(cè)序,依據(jù)與小麥無同源性的序列重新設(shè)計(jì)引物而獲得長(zhǎng)穗偃麥草基因組特異的分子標(biāo)記36個(gè)。這些標(biāo)記可用于長(zhǎng)穗偃麥草向小麥轉(zhuǎn)移染色體片段過程中的易位系鑒定,可用于抗赤霉病基因的連鎖分析,可作為特異分子標(biāo)記鑒定長(zhǎng)穗偃麥草染色質(zhì)而用于小麥抗赤霉病和抗逆性育種中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676515SQ20121017824
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者葛江燕, 陳士強(qiáng), 陳建民, 高勇 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)