專利名稱：一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法。
背景技術(shù)：
19世紀(jì)末，從丙烯酰氯與氨首次合成了丙烯酰胺。1954年，美國氰氨公司采用丙烯腈硫酸水解工藝進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。1972年，日本三井東壓化學(xué)公司首先建立了骨架銅催化丙烯腈水合制丙烯酰胺的工業(yè)裝置，此后各國相繼開發(fā)了不同類型的催化劑，采用此項(xiàng)工藝進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。80年代，日本日東化學(xué)工業(yè)公司實(shí)現(xiàn)了用生物催化劑由丙烯腈制丙烯酰胺的工業(yè)生產(chǎn)。微生物法是利用生物技術(shù)培養(yǎng)出的細(xì)胞體作為酶催化劑，在適宜的條件下
催化丙烯腈合成丙烯酰胺。微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的關(guān)鍵是制備高活力的腈水合酶。腈水合酶活力的提高，有利于丙烯腈向丙烯酰胺反應(yīng)方向進(jìn)行，降低丙烯酰胺生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，對(duì)微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺工業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在是提供一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，提高發(fā)酵獲得的腈水合酶的活性，從而促進(jìn)后續(xù)水合生產(chǎn)丙烯酰胺。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，其特征在于包括以下步驟
1)種子培養(yǎng)將諾卡氏菌用固體培養(yǎng)基在28°C培養(yǎng)箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，將三角瓶置于溫度設(shè)定為28±2°C、轉(zhuǎn)速為150-200 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h ；
2)補(bǔ)料分批發(fā)酵將5%種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)使用2. 5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐，發(fā)酵體積為1.2 L，發(fā)酵溫度28±2°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min，pH值和溶解氧由發(fā)酵罐控制單元控制，在發(fā)酵過程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養(yǎng)的需要，延長菌體生長時(shí)間，培養(yǎng)40-50h后發(fā)酵結(jié)束，測(cè)菌體酶活。進(jìn)一步地，所述的固體培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀0. 5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸鎂0. lg/L、味精lg/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L，尿素7g/L，瓊脂20 g/L0進(jìn)一步地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖25 g/L、酵母膏5 g/L、尿素8g/L、味精I(xiàn). 5 g/L、磷酸二氫鉀0. 8/L、磷酸氫二鉀0. 8 g/L、硫酸鎂I. Og/L、消泡劑150ppm。進(jìn)一步地，所述的堿液補(bǔ)加工藝為當(dāng)發(fā)酵液的pH小于6時(shí)，通過補(bǔ)加堿液使發(fā)酵液pH值維持在6. 0-7.0。進(jìn)一步地,所述的堿液為氫氧化鈉或氨水,所述的pH值為6. 5。進(jìn)一步地，所述的堿液為氨水。進(jìn)一步地，所述的補(bǔ)糖工藝為在發(fā)酵中后期，通過補(bǔ)加150_180g/L的葡萄糖溶液使其濃度保持在6-15g/L。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明在發(fā)酵過程中，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養(yǎng)的需要，不僅能延長菌體生長時(shí)間，而且使諾卡氏菌產(chǎn)酶水平有了較大的提高，該工藝的酶活達(dá)到2934. 6U/ml為分批發(fā)酵的9. 3倍，補(bǔ)料方式簡單易行，便于操作。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I分批發(fā)酵對(duì)照試驗(yàn) (I)固體培養(yǎng)基
葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀0. 5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸鎂0. lg/L、味精lg/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L,尿素7g/L,瓊脂20 g/L。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖25 g/L、酵母膏5 8/1、尿素88/1、味精1.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8/L、磷酸氫二鉀
0.8 g/L、硫酸鎂 I. Og/L、消泡劑 150ppm。(3)種子培養(yǎng)
將諾卡氏菌用固體培養(yǎng)基在28 °C培養(yǎng)箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，將三角瓶置于溫度設(shè)定為28±2°C、轉(zhuǎn)速為150-200 r/min的搖床中培養(yǎng)48h ；
(4)分批發(fā)酵培養(yǎng)
腈水合酶發(fā)酵制備在2. 5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵條件為發(fā)酵體積為I. 2 L，發(fā)酵溫度28±2°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min。(5)發(fā)酵結(jié)果
發(fā)酵進(jìn)行40h后結(jié)束，酶活為314. 56U/ml。實(shí)施例2補(bǔ)料分批發(fā)酵
(I)(2) (3)步驟同實(shí)施例I
(4)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)
以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)使用2. OL發(fā)酵罐，裝液量I. 2L，發(fā)酵溫度28±2°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中溶液pH小于
6.5時(shí)，補(bǔ)加2%的氨水維持發(fā)酵液pH在6. 5，在發(fā)酵中后期，補(bǔ)加180g/L的葡萄糖溶液使其濃度保持在6-15g/L。(5)發(fā)酵結(jié)果
發(fā)酵進(jìn)行50h后結(jié)束，與對(duì)照分批發(fā)酵延長了 10h，補(bǔ)料分批式培養(yǎng)的菌體酶活達(dá)到2934. 6 U/ml，為分批發(fā)酵的9. 3倍。
權(quán)利要求
1.一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，其特征在于包括以下步驟 1)種子培養(yǎng)將諾卡氏菌用固體培養(yǎng)基在28°C培養(yǎng)箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，將三角瓶置于溫度設(shè)定為28±2°C、轉(zhuǎn)速為150-200 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h ； 2)補(bǔ)料分批發(fā)酵將5%種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)使用2. 5L的自動(dòng)控制發(fā)酵罐，發(fā)酵體積為I. 2 L,發(fā)酵溫度28±2°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min，pH值和溶解氧由發(fā)酵罐控制單元控制，在發(fā)酵過程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養(yǎng)的需要，延長菌體生長時(shí)間，培養(yǎng)40-50h后發(fā)酵結(jié)束，測(cè)菌體酶活。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I種子培養(yǎng)基，其特征在于固體培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸鎂0. lg/L、味精lg/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L，尿素 7g/L，瓊脂 20 g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖25 g/L、酵母膏5 8/1、尿素88/1、味精1.5 g/L、磷酸二氫鉀0. 8/L、磷酸氫二鉀0. 8 g/L、硫酸鎂I. Og/L、消泡劑150ppm。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，其特征在于所述的堿液補(bǔ)加工藝為當(dāng)發(fā)酵液的PH小于6時(shí)，通過補(bǔ)加堿液使發(fā)酵液pH值維持在 6. 0-7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，其特征在于所述的堿液為氫氧化鈉或氨水，所述的pH值為6. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求書5所述的一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，其特征在于所述的堿液為氨水。
7.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法，其特征在于所述的補(bǔ)糖工藝為在發(fā)酵中后期，通過補(bǔ)加150-180g/L的葡萄糖溶液使其濃度保持在6-15g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)分批培養(yǎng)提高酶活力的方法。在發(fā)酵過程中，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養(yǎng)的需要，不僅能延長菌體生長時(shí)間，而且使諾卡氏菌產(chǎn)酶水平有了較大的提高，該工藝的酶活達(dá)到2934.6U/ml為分批發(fā)酵的9.3倍，補(bǔ)料方式簡單易行，便于操作。
文檔編號(hào)C12R1/365GK102776168SQ20121025162
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者丁建華, 曹艷, 楊濤, 沈瑞華, 熊光輝, 錢小方, 顧稀平 申請(qǐng)人:江蘇南天農(nóng)科化工有限公司