專利名稱：一種應(yīng)用于紅霉素發(fā)酵的糖醇混合補料新方法
一種應(yīng)用于紅霉素發(fā)酵的糖醇混合補料新方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于紅霉素發(fā)酵的糖醇混合補料新方法。
背景技術(shù)：
紅霉素是由紅色糖多孢菌經(jīng)過次級代謝合成的十四元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要應(yīng)用于治療革蘭氏陽性細(xì)菌感染。其作用機理為通過與細(xì)菌核蛋白體50S亞基核糖體結(jié)合抑制轉(zhuǎn)肽作用和信使核糖核酸(mRNA)移位殺死致病細(xì)菌。紅霉素是全球銷量居前的抗感染藥物，全球銷售額達(dá)到上百億美元。隨著以紅霉素為原料的新型半合成紅霉素藥物如羅紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素等銷售額的連年猛增，帶動了紅霉素需求的不斷增加，紅霉素原料藥的生產(chǎn)和銷售日趨活躍。
目前大多數(shù)生產(chǎn)廠家采用黃豆餅粉和淀粉作為主要的培養(yǎng)基成份。在此配方的基礎(chǔ)上添加少量的速效氮源能夠促進(jìn)紅色糖多孢菌菌體的前期生長并有效地提高紅霉素的發(fā)酵水平。在發(fā)酵過程中隨著淀粉的消耗，菌體會被迫水解利用黃豆餅粉。黃豆餅粉的脫氨基作用引起PH的升高。為了控制發(fā)酵過程的pH值，可以采用補加酸堿的方法控制發(fā)酵過程 pH。隨著工藝的逐漸完善，在紅霉素發(fā)酵工業(yè)中，普遍采用在發(fā)酵進(jìn)入菌體生長穩(wěn)定期后開始采用流加葡萄糖控制PH值的發(fā)酵工藝，結(jié)果顯示該方法不僅優(yōu)于單純補加酸堿控制pH 值的方法，而且比依據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)堑钠咸烟茄a加工藝更能提高最終紅霉素發(fā)酵水平。
除了在發(fā)酵過程中補加葡萄糖外，豆油和正丙醇作為紅霉素合成前體的重要來源，也是過程補料的重要內(nèi)容。然而，一直以來尚未形成統(tǒng)一的豆油和正丙醇的補加方法。 一些廠家完全根據(jù)多年的生產(chǎn)經(jīng)驗來進(jìn)行豆油和正丙醇的補料工藝。這些方法缺少一定的理論依據(jù)，在實施中多依靠有經(jīng)驗的技術(shù)人員的分析判斷。
因此，本領(lǐng)域迫切需要深入研究紅霉素的發(fā)酵機制，優(yōu)化紅霉素的發(fā)酵工藝，有效提聞紅霉素的廣量。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用于紅霉素發(fā)酵的糖醇混合補料新方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種采用pH值反饋控制法進(jìn)行紅霉素發(fā)酵的方法，所述方法包括設(shè)定PH預(yù)設(shè)值6. 95-7. 1(如6. 95,7.0,7. 05,7. I)，進(jìn)行三階段發(fā)酵
第一階段培養(yǎng)紅色糖多胞菌至菌體生長穩(wěn)定期，當(dāng)發(fā)酵液pH值高于預(yù)設(shè)值時， 開始第二階段；
第二階段當(dāng)發(fā)酵液pH值高于預(yù)設(shè)值時，通過補加葡萄糖產(chǎn)生有機酸來控制pH值在預(yù)設(shè)值；同時補加正丙醇，使加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量滿足菌體生產(chǎn)所需； 當(dāng)正丙醇補加速率低于0.07-0. OSgL-1IT1 (如O. OTegL-1^1)時，開始第三階段；
第三階段維持正丙醇補加速率0.07-0. OSgL^r1 (如O. (^egL—V1);補加葡萄糖使發(fā)酵液pH值在預(yù)設(shè)值。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述方法的第二階段中，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，在O. 25-0. 35mol/L。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，由第二階段起始時的O. 26mol/L增加到O. 31mol/L,之后下降(較佳地,下降至O. 24mol/L)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的pH預(yù)設(shè)值為7. 0-7. 05。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法的第二階段中，每一時間點加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量等于以下發(fā)酵方法a相應(yīng)(或相同)時間點發(fā)酵液中葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量
當(dāng)發(fā)酵液pH值高于6. 9時補加葡萄糖，平均葡萄糖補加速率O. liOg-rV1 ;同時補加正丙醇，平均正丙醇補加速率O. 058g · T1IT1至發(fā)酵結(jié)束。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的方法中，正丙醇補加速率=(發(fā)酵方法a葡萄糖補加速率X6+發(fā)酵方法a正丙醇補加速率X3)-葡萄糖補加速率X6]+3。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，發(fā)酵的溫度在34±1°C。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，發(fā)酵的溶氧30±5%。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，發(fā)酵的初始培養(yǎng)基包括淀粉35±5g/L，糊精5±lg/L，黃豆餅粉 33 ± 5g/L，玉米漿 18 ± 2g/L，NaCl2 ±O. 4g/L，CaC037 ± I. 5g/L，豆油 5 ± lmL/L。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，發(fā)酵的初始培養(yǎng)基還包括消泡劑。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、紅色糖多胞菌的接種-發(fā)酵流程。圖2、高低補糖下對紅霉素發(fā)酵的影響。▼線表示模式a補糖曲線(預(yù)設(shè)pH=6.9),▽線表示模式b (預(yù)設(shè)pH=7. 3)下的補糖曲線， 線表示模式a下紅霉素合成曲線，〇線表示預(yù)設(shè)PH=7. 3下的紅霉素合成曲線。圖3、在高低補糖下溶氧曲線比較。圖4、在圖2-3的基礎(chǔ)上設(shè)計的四種總碳原子相等原則的補料模式，顯示了補糖和補醇速率的變化，即在不同階段控制葡萄糖和正丙醇的比例。圖5、根據(jù)模式I-模式4工藝下獲得的過程發(fā)酵參數(shù)。圖6、不同補加模式下的攝氧速率OUR和呼吸商RQ。圖7、葡萄糖和正丙醇在代謝中的去向考察。
具體實施例方式為了解決現(xiàn)有技術(shù)中紅霉素發(fā)酵過程中補糖補醇以經(jīng)驗為主、缺乏理論依據(jù)的問題，本發(fā)明從葡萄糖和正丙醇之間的相互利用間的關(guān)聯(lián)性為出發(fā)點，揭示了一種糖醇混合補料新方法。與傳統(tǒng)補加工藝相比，本發(fā)明的補料方法通過控制不同發(fā)酵階段的補糖速率來控制正丙醇的利用效率，同時依據(jù)葡萄糖補加速率對正丙醇補加速率進(jìn)行調(diào)控，可以很好地控制菌體處于適于紅霉素合成的最佳生理狀態(tài)。
本發(fā)明的方法基于以下原理通過在一定范圍內(nèi)調(diào)控發(fā)酵過程中的pH設(shè)定值，能夠有效地改變葡萄糖的補加速率，當(dāng)葡萄糖補加速率降低時，正丙醇的利用速率會增加。正丙醇是紅霉素合成前體的重要來源，其利用率增加則使得紅霉素產(chǎn)量增加?；诖?，研究了改變PH設(shè)定值調(diào)控補糖速率以及依據(jù)葡萄糖補加速率控制正丙醇補加速率的新型混合補料模式，實現(xiàn)了紅霉素發(fā)酵水平的提高。
葡萄糖和正丙醇在代謝中的去向如圖7所示，葡萄糖可以合成紅霉素前體，正丙醇也可以合成紅霉素前體。葡萄糖代謝要經(jīng)過EMP、TCA等代謝途徑，在這些途徑中，使得大部分葡萄糖以二氧化碳的形式釋放掉，并沒有很好的合成紅霉素。而正丙醇代謝與紅霉素合成更直接相關(guān)，正丙醇可被菌株利用的利用率高。因此，本發(fā)明人本著提供足夠的總碳原子量且提高正丙醇的加料、葡萄糖的加入僅滿足控制PH的原則，開發(fā)了本發(fā)明的高效產(chǎn)紅霉素的方法。
如本文所用，所述的“菌體生長穩(wěn)定期”是指微生物經(jīng)過一段時間的生長，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)已不多，只能維持菌體基本新陳代謝和合成次級代謝產(chǎn)物的需要，因此菌體的比生長速度基本為零，菌體濃度基本上處于恒定。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明人依據(jù)葡萄糖和正丙醇的碳原子總和不變原則提高正丙醇補加速率。在碳原子總和不變原則下，葡萄糖平均補加速率降低，正丙醇平均補加速率提高，紅霉素產(chǎn)量大幅增加。與傳統(tǒng)的單純依據(jù)PH補糖和恒速補醇策略相比，該方法充分考慮到葡萄糖和正丙醇的利用關(guān)系，保證了菌體持續(xù)快速的合成紅霉素產(chǎn)物。
本發(fā)明的方法采取三階段發(fā)酵法，首先培養(yǎng)紅色糖多孢基因工程菌，在發(fā)酵液中葡萄糖濃度降低到接近零時，發(fā)酵液的PH值會開始升高，當(dāng)發(fā)酵液pH值高于預(yù)設(shè)值時，開始第二階段補加葡萄糖以控制PH值。
之后，進(jìn)行第二階段，補加葡萄糖的同時啟動正丙醇補加程序，根據(jù)方程計算出正丙醇的補加速率。方程為，正丙醇補加速率=(原工藝葡萄糖補加速率X 6 +原工藝正丙醇補加速率X3)-葡萄糖補加速率X6]+3，補加速率單位為mmol L^Vl0
之后，進(jìn)行第三階段，在較低的正丙醇補加速率下，補加葡萄糖控制pH值在預(yù)設(shè)值。
與傳統(tǒng)的糖醇補料工藝相比，本發(fā)明的新型糖醇混合補料方法具有在菌體代謝活躍期補糖速率低、補醇速率高和在菌體代謝衰亡期補糖速率高、補醇速率低的特點。該特點使菌體處于一個適合于合成紅霉素的生理狀態(tài)，即菌體代謝活躍期降低補糖速率刺激正丙醇的利用，從而提高來源于正丙醇的紅霉素前體的濃度，而在菌體代謝衰亡期提高補糖速率來減緩菌體的衰亡，同時降低補醇速率，從而降低了正丙醇對菌體的傷害作用。
在本發(fā)明的實施實例中，采用新型補加策略進(jìn)行紅霉素發(fā)酵，結(jié)果表明新型補料方法可以實現(xiàn)不同發(fā)酵階段的葡萄糖補加速率和正丙醇補加速率的聯(lián)動效應(yīng)。降低葡萄糖補加速率能夠顯著提高正丙醇的利用速率。采用新型糖醇混合補料方法，可以實現(xiàn)菌體持續(xù)快速的合成紅霉素，大幅度提高了最終紅霉素水平。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
實施例I、葡萄糖-正丙醇(糖醇)混合補料新方法提高紅霉素發(fā)酵水平
I、培養(yǎng)方法和參數(shù)檢測方法
菌種紅色糖多胞基因工程菌ZL1004(Saccharopolyapora erythraea ZL1004) (基因型為 permK*-K-K-G+permE*-K+permA*-G)。
一級種子罐培養(yǎng)基淀粉 30g/L，糊精 40g/L，豆粉 20g/L，CaC035g/L, NaC13g/L, (NH4)2S042g/L。
二級種子罐培養(yǎng)基淀粉30g/L，糊精30g/L，豆粉30g/L，玉米漿10g/L，CaC035g/ L，消泡劑10mL/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉35g/L，糊精5g/L，黃豆餅粉33g/L，玉米漿18g/L，NaC12g/L, CaC037g/L，豆油5mL/L，消泡劑(有機硅類消泡劑，購自宜興市高時化工有限公司)56mL/L。
培養(yǎng)方法
采用三級發(fā)酵方式，挖取新鮮斜面菌種(IcmXlcm)接種到裝有50mL培養(yǎng)基的 500mL種子搖瓶中，220r/min轉(zhuǎn)速下34°C培養(yǎng)40h，之后轉(zhuǎn)入15L種子罐，二級種子培養(yǎng)過程維持溶氧40%以上，34°C培養(yǎng)40h。將二級種子培養(yǎng)液移入50L發(fā)酵罐，34°C培養(yǎng)191h， 過程維持溶氧30%以上。主要流程如圖I。
不同pH值設(shè)定值的研究(模式a_模式b)
發(fā)酵起始第1-34小時，隨溶氧降低逐漸提高轉(zhuǎn)速和通氣維持溶氧在30%以上，菌體通過利用培養(yǎng)基提供的成分生長和繁殖。第35小時起至發(fā)酵結(jié)束，采取表I的方式設(shè)定 pH及補料。
表I
權(quán)利要求
1.一種采用pH值反饋控制法進(jìn)行紅霉素發(fā)酵的方法，其特征在于，所述設(shè)定pH預(yù)設(shè)值6.95-7. I，進(jìn)行三階段發(fā)酵第一階段培養(yǎng)紅色糖多胞菌至菌體生長穩(wěn)定期，當(dāng)發(fā)酵液PH值高于預(yù)設(shè)值時，開始第二階段；第二階段當(dāng)發(fā)酵液PH值高于預(yù)設(shè)值時，通過補加葡萄糖產(chǎn)生有機酸來控制pH值在預(yù)設(shè)值；同時補加正丙醇，使加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量滿足菌體生產(chǎn)所需；當(dāng)正丙醇補加速率低于O. 07-0. OSgL-1IT1時，開始第三階段；第三階段維持正丙醇補加速率O. 07-0. OSgL^r1 ;補加葡萄糖使發(fā)酵液pH值在預(yù)設(shè)值。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，第二階段中，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，在O. 25-0. 35mol/L。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，由第二階段起始時的O. 26mol/L增加到O. 31mol/L，之后下降。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的pH預(yù)設(shè)值為7.0-7. 05。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，第二階段中，每一時間點加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量等于以下發(fā)酵方法a相應(yīng)時間點發(fā)酵液中葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量當(dāng)發(fā)酵液PH值高于6.9時補加葡萄糖，平均葡萄糖補加速率O. liOg-rV1 ;同時補加正丙醇，平均正丙醇補加速率O. 058g · T1IT1至發(fā)酵結(jié)束。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，正丙醇補加速率=(發(fā)酵方法a葡萄糖補加速率X6+發(fā)酵方法a正丙醇補加速率X 3)-所述方法葡萄糖補加速率X6]+3。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的溫度在34±1°C。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的溶氧30±5%。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的初始培養(yǎng)基包括淀粉35±5g/L，糊精 5±lg/L，黃豆餅粉 33±5g/L，玉米漿 18±2g/L，NaC12±0. 4g/L，CaC037± I. 5g/L，豆油 5±lmL/L。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的初始培養(yǎng)基還包括消泡劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于紅霉素發(fā)酵的糖醇混合補料新方法。本發(fā)明的補料方法通過控制不同發(fā)酵階段的補糖速率來控制正丙醇的利用效率，同時依據(jù)葡萄糖補加速率對正丙醇補加速率進(jìn)行調(diào)控，可以很好地控制菌體處于適于紅霉素合成的最佳生理狀態(tài)。
文檔編號C12R1/645GK102978266SQ20121057173
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者儲炬, 陳勇, 莊英萍, 張嗣良, 譚俊, 于曉光 申請人:華東理工大學(xué)