專利名稱：一種生物法生產γ-環(huán)糊精的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物法生產Y-環(huán)糊精的生產工藝，屬于環(huán)糊精生產技術領域。
背景技術：
環(huán)糊精(Cyclodextrins，通常簡稱為⑶)，是一類由淀粉或多糖在環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的由D-吡喃葡萄糖單元通過α -1,4-糖苷鍵首尾相連的環(huán)狀化合物的總稱，常見的有6、7和8個葡萄糖單元的分子，分別稱為α-、β-和Y-環(huán)糊精。環(huán)糊精由于其結構的特殊性，可以包埋許多有機物和無機化合物，作為品質改良劑、穩(wěn)定劑、藥物的載體和吸附劑等，所以它在食品、醫(yī)藥、化學、分析化學、農業(yè)環(huán)保、紡織技術和生物技術等領域都具有廣泛的應用。三種常用的環(huán)糊精中，β_環(huán)糊精水溶解度最小，易于通過分步結晶的方法制得，因此β_環(huán)糊精目前在生產中被大量制備和廣泛應用，但是β_環(huán)糊精 由于溶解度小使其在對藥物包合作用方面的應用受到限制，目前科技工作者正致力于提高β-環(huán)糊精的溶解度。盡管α-環(huán)糊精的需求很大，應用前景看好，但是由于現有CGTase生產α-環(huán)糊精時轉化率低，產物特異性差，且α-環(huán)糊精的溶解度相對較高，不容易通過濃縮、結晶的方法從反應液中分離純化出來，因此造成生產成本太高，大大限制了其工業(yè)大規(guī)模應用。相比于α -和β -環(huán)糊精，γ -環(huán)糊精由于具有更高的溶解度和更大的空腔，能夠包接分子量更大的化合物從而增加化合物的溶解度，改善化合物的乳化性等，且毒性最小，刺激性也很小，安全性高。在食品、醫(yī)藥等領域已顯示出巨大的優(yōu)勢。雖然市場對Y-環(huán)糊精產品需求量大，但由于Y-環(huán)糊精轉化效率低，導致Y-環(huán)糊精價格昂貴，大大限制了它的應用。目前國外也只有Wacker和Cyclolab等少數幾家公司生產Y-環(huán)糊精，而且產量非常有限。生產Y-環(huán)糊精方法目前只有生物法，有關生物法制備α-和環(huán)糊精的報道較多，但是關于生物法生產Y-環(huán)糊精的報道較少，曹新志等在制備Y-環(huán)糊精時，選用來源廣、價格便宜的甘薯淀粉為底物，配制5% (w/v)的淀粉液，加入適量來源于Bacillusalcalophilus的Y -CGTase粗酶液后測定Y -環(huán)糊精的產量，結果發(fā)現甘薯淀粉的轉化率最高約為30%，但是后續(xù)分離非常困難。(曹新志.環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶和Y-環(huán)糊精生物合成的研究[D].無錫，江南大學，2005)。在添加有機溶劑條件下，國外文獻報道最高轉化率也僅為40%左右。目前生物法生產Y-環(huán)糊精的主要問題在于一、缺少性質優(yōu)良并且具有高酶活的Y-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(Y-CGTase) ;二、缺少Y-環(huán)糊精相應的生產工藝，針對Y -環(huán)糊精在水中溶解度較高的問題，需要制定一套經濟高效的分離提取方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明所解決的技術問題是提供了一種生物法生產Y-環(huán)糊精的工藝，降低了Y-環(huán)糊精的生產成本。為解決上述問題，本發(fā)明技術方案為采用來源于嗜堿芽胞桿菌的Y-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶生產Y-環(huán)糊精；按照10-15%的濃度進行淀粉調漿，在60-90°C條件下攪拌5-15分鐘；設定溫度40-60°C，調ρΗΙΟ. O左右后，按照每克淀粉1-10個單位的量加入Y -環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶，加入2-5% (w/v)的有機溶劑后，充分反應8-10小時；回收有機溶劑，采用結晶方法得到Y-環(huán)糊精。所述微生物發(fā)酵生產Y -CGTase的方法為，在一定培養(yǎng)條件下，以E. coliBL21(DE3)/pET20b (+)-Y-CGTase (紀麗萍，吳丹，吳敬，陳堅·重組大腸桿菌產Y-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化中國生物工程雜志，2011,31(10) 50-56)發(fā)酵一定時間，得到含有Y-CGTase的發(fā)酵液，經過高速離心，去除菌體，上清即為粗酶液。所述在60_90°C條件下攪拌5-15分鐘淀粉調漿的目的在于使淀粉顆粒充分溶脹。所述Y -CGTase的最適反應溫度為40_50°C左右，溫度通過影響酶對底物的催化效率，從而影響酶的活力，溫度過高或過低都會影響酶的作用效果。從降低生產成本考慮，生產工藝的溫度不應過高或者過低，以降低加入的酶量，從而降低生產成本。
所述Y -CGTase的最適pH范圍為10. 5-11. O, Y -CGTase的活力受pH影響較大，考慮到降低成本，應該將生產工藝的pH選定在酶最適反應pH附近。所述γ-CGTase活力的測定采用溴甲酚綠(BCG)分光光度法在酸性條件下，溴甲酚綠呈現多個不同吸收峰，當加入Y-環(huán)糊精時，溴甲酚綠溶液呈現增色效應，最大增色波長為630nm。在波長630nm，一定濃度范圍內，溴甲酚綠的增加吸光光度值(ΛΑ)與Y-CGT濃度之間存在著線性關系。將適當稀釋的發(fā)酵上清液加入預先用50mmol/L Gly-NaOH緩沖液(ρΗΙΟ.Ο)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在40°C下反應IOmin后，加入50 μ L L0mol/L的鹽酸終止反應，再加入2mL0.2mol/L檸檬酸緩沖液(ρΗ4· 2)和80 μ L5mmol/L的溴甲酹綠,室溫靜置20min左右,在波長630nm下測定吸光度。一個酶活單位(U)定義為在上述條件下每分鐘生成Ιμηιο 的Y-環(huán)糊精所需的酶量。所述α-、β-和Y -環(huán)糊精的分析采用高效液相色譜法。色譜條件:Waters 600HPLC 色譜儀，Waters 自動進樣器，色譜柱 ZORBAX NH2 (4. 6mmX 150mm), Waters2410 示差檢測器；流動相(v/v)為75%乙腈水溶液，流速I. OmL/min ;柱溫40°C。處理樣品時，8000r/min離心15min,棄沉淀,上清液中加入0. ImLa-淀粉酶液作用Ih, 0. 45 μ m超濾膜過濾后取10 μ L上機分析。所述有機溶劑為環(huán)十二酮。環(huán)十二酮不僅能與Y-環(huán)糊精特異性的形成包絡物沉淀從而提高淀粉總的轉化率，而且環(huán)十二酮價格相對較低，沸點低，可以通過水蒸氣蒸餾幾乎全部除去，極少殘留在最終的產品中。所述回收有機溶劑，通過結晶手段得到Y-環(huán)糊精的具體方法為待反應結束后，將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括未反應的淀粉和有機溶劑與Y-環(huán)糊精形成的絡合物沉淀；將濾餅用水復溶，然后通過水蒸氣蒸餾的方法分離有機溶劑和Y-環(huán)糊精。蒸餾結束后，過濾蒸餾液以除去未反應的淀粉，即可得到Y-環(huán)糊精的水溶液。最后，將水溶液旋轉蒸發(fā)濃縮，低溫放置得到Y-環(huán)糊精的結晶。本發(fā)明的技術原理如下γ -CGTase除了能與淀粉發(fā)生環(huán)化反應產生Y -環(huán)糊精外，還能發(fā)生偶合、歧化和水解反應，偶合反應是環(huán)化反應的逆反應，該反應是打開環(huán)糊精的環(huán)，然后轉移到直鏈低聚糖上。在一定濃度麥芽低聚糖或葡萄糖等小分子糖的存在條件下，Y -CGTase的環(huán)化反應受到抑制，影響最終收率。本發(fā)明直接采用糊化的淀粉來生產環(huán)糊精，在中溫攪拌的條件下，淀粉顆粒充分溶脹，解除了小分子糖對環(huán)化反應的抑制，提高了 Y-CGTase的轉化率。由于Y-環(huán)糊精可以與有機物形成不溶于水的包絡物，添加一定比例的有機溶劑可以連續(xù)地從反應系統(tǒng)中去除環(huán)糊精，使反應向著環(huán)糊精的生成方向不斷進行，有利于環(huán)糊精生產，同時解除了 Y -環(huán)糊精對Y -CGTase的產物抑制作用。本發(fā)明是根據Y-CGTase以及產物Y-環(huán)糊精的特點生產Y-環(huán)糊精的工藝，相對于現有技術，具有以下優(yōu)點I)提供一種高轉化率、低成本的Y-環(huán)糊精的生產方法，填補了該技術領域內的空白，為生物法大規(guī)模生產Y-環(huán)糊精奠定基礎；2)本反應總的反應周期短，只需要8-10小時；3)酶反應的溫度比較低，不需要進行劇烈的溫度變化，低能耗，適合工業(yè)化生產；
4)直接利用原淀粉作為底物，解除了葡萄糖、麥芽糖等小分子糖對Y-環(huán)糊精的生成的抑制作用；添加一定比例的有機溶劑，連續(xù)地從反應系統(tǒng)中去除Y-環(huán)糊精，使其向生成Y-環(huán)糊精的方向不斷進行，提高了 Y-環(huán)糊的轉化率，總轉化率最高可達到60%左右，其中Y -環(huán)糊精和β -環(huán)糊精的比例約為9:1。5)有機溶劑去除過程方法簡單，得到的產品純度高，雜質少，可達90%左右，有機溶劑殘留量可用于醫(yī)藥行業(yè)等。總體來講，本發(fā)明具有生產周期短、原料轉化率高、產品純度高、工藝流程簡、生產成本低等優(yōu)點。
具體實施例方式實施例I :原料預處理按照10%的濃度進行馬鈴薯淀粉調漿，在65°C條件下攪拌10分鐘，使淀粉顆粒充分吸水溶脹；酶法生產工藝預處理后將溫度設定為50°C，調ρΗΙΟ. O后，按照每克淀粉6個單位的比例加入Y-CGTase,然后加入5% (w/v)的環(huán)十二酮后,充分反應9h ;Y-環(huán)糊精的提取工藝沸水浴滅酶后，將反應液過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括環(huán)十二酮與Y-環(huán)糊精形成的沉淀以及未反應的淀粉；將濾餅重新用水復溶，然后采用水蒸氣蒸餾除去環(huán)十二酮，待蒸餾結束后，過濾蒸餾液除去沒有反應的淀粉，即可得到Y -環(huán)糊精的水溶液；將水溶液蒸發(fā)濃縮，低溫放置即可得到Y-環(huán)糊精的結晶。所述α _、β -和Y -環(huán)糊精的分析采用高效液相色譜法。色譜條件=Waters 600HPLC色譜儀，Waters自動進樣器，色譜柱ZORBAX NH2 (4. 6mmX 150mm)，Waters2410示差檢測器；流動相(v/v)為75%乙腈水溶液，流速I. OmL/min ;柱溫40°C。處理樣品時，8000r/min離心15min,棄沉淀,上清液中加入O. ImLa-淀粉酶液作用Ih, O. 45 μ m超濾膜過濾后取10 μ L上機分析。結果見表I，淀粉總轉化率可達60%，產品中Y-CGT所占比例為55. 4%，β -CGT 占 4· 6%，表I不同實施例下Y-CGT的生產情況
權利要求
1.一種生物法生產Y-環(huán)糊精的生產工藝，其特征在于，采用來源于嗜堿芽胞桿菌(Alkalophilic Bacillus clarkii 7364)的Y -環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶生產Y-環(huán)糊精；按照10%的濃度進行淀粉調漿，在60-90°C條件下攪拌5-15分鐘；設定溫度40_60°C，調ρΗΙΟ. O左右后，按照每克淀粉1-10個單位的量加入Y -環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶，加入2-5% (w/v)的有機溶劑后，充分反應8-10小時；回收有機溶劑，采用結晶方法得到Y-環(huán)糊精。
2.根據權利要求I所述的生產工藝，其特征在于所述回收有機溶劑、結晶方法為將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括有機溶劑與Y -環(huán)糊精形成的絡合物沉淀以及沒有反應的淀粉；將濾餅重新復溶，然后采用水蒸氣蒸餾除去有機溶劑，待蒸餾結束后，過濾蒸餾液除去沒有反應的淀粉，即可得到Y -環(huán)糊精的水溶液；將水溶液蒸發(fā)濃縮，低溫放置即可得到Y-環(huán)糊精的結晶。
3.根據權利要求I或2所述的生產工藝，其特征在于，所述的有機溶劑為環(huán)十二酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物法生產γ-環(huán)糊精的生產工藝，屬于環(huán)糊精生產技術領域。本發(fā)明所解決的技術問題是提供了一種生物法生產γ-環(huán)糊精的工藝，降低了γ-環(huán)糊精的生產成本，技術方案為采用來源于嗜堿芽胞桿菌的γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶生產γ-環(huán)糊精；按照10％的濃度進行淀粉調漿，在60-90℃條件下攪拌5-15分鐘；設定溫度40-60℃，調pH10.0左右后，按照每克淀粉1-10個單位的量加入γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶，加入2-5％(w/v)的有機溶劑后，充分反應8-10小時；回收有機溶劑，采用結晶方法得到γ-環(huán)糊精。
文檔編號C12P19/18GK102827900SQ201210347398
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月10日 優(yōu)先權日2012年9月10日
發(fā)明者吳敬, 王磊, 吳丹, 陳堅 申請人:江南大學