花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDL1、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDL1、其編碼基因及應(yīng)用。所述花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDL1具有如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由SEQ?ID?NO.2衍生的氨基酸序列。本發(fā)明首次公開了一個(gè)花生根系檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，獲得了該基因cDNA全長(zhǎng)；AhFRDL1基因可調(diào)控檸檬酸向木質(zhì)部分泌，及木質(zhì)部鐵向地上部運(yùn)輸；為從植物分子育種角度獲得高鐵營(yíng)養(yǎng)高品質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品，從分子育種及基因工程技術(shù)角度培育耐鐵花生品種提供必要的基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDLK其編碼基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDLl、其編碼基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物要維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育就必須不斷的從土壤中獲得多種營(yíng)養(yǎng)元素，如大量元素N、P、K及微量元素鐵、錳、銅、鋅等。而鐵是包括植物在內(nèi)的大部分有機(jī)體的必需營(yíng)養(yǎng)元素之一。鐵在植物體中參與葉綠素的合成，參與植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)和電子傳遞是植物細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化物酶等與呼吸有關(guān)的酶類的重要組成部分，具有催化功能，直接或間接參與植物體內(nèi)的代謝過(guò)程(Imsande J, Touraine B.1994.N demand and theregulation of nitrate uptake.Plant Physiology.105:73-77)。雖然鐵在自然界中的豐度很高，但大多以生物有效性低的氧化態(tài)形式存在，特別是石灰性土壤上，石灰性土壤占世界土地面積的三分之一以上，高pH和高重碳酸鹽含量嚴(yán)重降低了土壤中鐵的有效性(Guerinot ML, Yi Y.1994.1ron:Nutritious, noxious and not readily available.PlantPhysiology.104:815-820;Schmidt ff.2003.1ron solutions:acquisition strategiesand signaling pathway in plants.Trends in Plant Science.8:188-193)。而在我國(guó)典型的北方石灰性土壤上缺鐵同樣是影響植物生長(zhǎng)的一個(gè)主要限制因子。
[0003]土壤溶液中的有效鐵含量非常低無(wú)法滿足植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育需求，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了兩種不同的活化和吸收鐵的機(jī)制，1986年，德國(guó)著名科學(xué)家RiVmheld.和Marschner揭示了不同植物適應(yīng)缺鐵脅迫的兩種反應(yīng)機(jī)制:機(jī)理I植物和機(jī)理II植物。機(jī)理I植物包括雙子葉植物和非禾本科單子葉植物，機(jī)理II植物是禾本科單子葉植物(Romheld V，Marschner H.1986.Evidence for a specific uptake system for ironphytosiderophores in roots of grasses.Plant Physiology.80:175 - 180)。
[0004]機(jī)理I植物和機(jī)理II植物的缺鐵適應(yīng)性變化包括生理變化和形態(tài)變化，形態(tài)學(xué)變化包括:根的伸長(zhǎng)受阻，根尖膨大，側(cè)根和根毛形成增加，根表皮細(xì)胞壁向內(nèi)褶皺，形成典型的轉(zhuǎn)移細(xì)胞等(Landsberg EC.1994.Transfer cell formation in sugar beet rootsinduced by latent Fe deficiency.Plant Soil.165:197-205)。生理變化包括植物H+-ATP酶向胞外釋放質(zhì)子，使土壤的pH值降低，提高土壤中鐵的有效性。
[0005]對(duì)于機(jī)理I植物來(lái)說(shuō)，主要通過(guò)兩步來(lái)完成對(duì)鐵的吸收:首先，質(zhì)膜上的H+-ATP酶向根際釋放質(zhì)子酸化根際，提高鐵的有效性。同時(shí)，根表皮質(zhì)膜上的Fe3+還原酶將Fe3+還原為 Fe2+(Robinson NJ, Procter CM, Connolly EL, Guerinot ML.1999.A ferric-chelatereductase for iron uptake from soils.Nature.397:694-697)。然后，植物根系質(zhì)膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT將Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。每一個(gè)鐵吸收過(guò)程都有相對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行控制從而保證根系從土壤中充分吸收鐵。而機(jī)理II植物在缺鐵情況下分泌麥根酸鐵載體，麥根酸在根際將鐵溶解，再通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜上的YSl轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將麥根酸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到根細(xì)胞內(nèi)(Curie C,Panaviene Z,Loulergue C，Dellaporta SL, Briat JF, Walker EL.2001.Maizeyellow stripe lencodes a membrane protein directly involved in Fe (III)uptake.Nature.409:346 - 349)。
[0006]當(dāng)鐵進(jìn)入根系之后，還需要經(jīng)過(guò)運(yùn)輸作用，將其運(yùn)往地上部加以利用，從而完成植物體對(duì)鐵的吸收與利用。木質(zhì)部是長(zhǎng)距離運(yùn)輸通道之一，鐵在木質(zhì)部中是以檸檬酸鐵的形式運(yùn)輸。最早被鑒定的負(fù)責(zé)將檸檬酸向木質(zhì)部分泌的基因是擬南芥AtFRD3(Durrett TP, Gassmann ff, Rogers EE.2007.The FRD3_mediated efflux of citrateinto the root vasculature is necessary for efficient iron translocation.Plant Physiology.144:197-205)，隨后在水稻中也發(fā)現(xiàn)了具有類似功能的基因OsFRDLl (Yokosho K, Yamaji N, Ueno D, Mitani N, Ma J F.2009.0sFRDLl is a citratetransporter required for efficient translocation of iron in rice.PlantPhysiology.149:297-305)。無(wú)論是擬南芥突變體frd3_l，還是敲除了 OsFRDLl的水稻轉(zhuǎn)基因植株，葉片都出現(xiàn)了明顯的缺鐵失綠黃化現(xiàn)象，同時(shí)在根中出現(xiàn)過(guò)量的鐵累積，結(jié)果表明AtFRD3、OsFRDLl是鐵通過(guò)木質(zhì)部由地下部向地上部運(yùn)輸不可或缺的基因。
[0007]花生是我國(guó)北方地區(qū)大量種植的主要的油料作物，但是由石灰性土壤引發(fā)的缺鐵現(xiàn)象已成為花生產(chǎn)量的主要限制因素之一(左元梅、劉永秀、張福鎖，玉米/花生混作改善花生鐵營(yíng)養(yǎng)對(duì)花生根瘤碳氮代謝及固氮的影響，生態(tài)學(xué)報(bào)，2004,24(11) = 2584-2590 )。到目前為止，有關(guān)花生吸收鐵的報(bào)道有AhIRTl基因(Ding H, Duan L，Li J, Yan H, Zhao M, ZhangF，Li WX.Cloning and functional analysis of the peanut iron transporter AhIRTlduring iron deficiency stress and intercropping with maize.Journal ofPlantPhysiology.2010)，但是與木質(zhì)部鐵運(yùn)輸有關(guān)的花生基因還沒有任何報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDLl、其編碼基因，以用于提高花生木質(zhì)部的鐵向地上部運(yùn)輸。
[0009]本發(fā)明另一目的是提供含有上述基因的載體。
[0010]本發(fā)明又一目的是提供含有上述基因或載體的宿主細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明再一目的是提供花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDLl或其編碼基因在提高花生木質(zhì)部的鐵向地上部運(yùn)輸中的應(yīng)用，及制備高鐵營(yíng)養(yǎng)農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明所述花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDLl，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0013]本發(fā)明所述花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AhFRDLl基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，共有2034bp，包括5’ -端UTR，蛋白編碼區(qū)和3’ -UTR包含ployA尾巴，表明是完整的核苷酸編碼序列。通過(guò)DNAman基因分析軟件分析得到了 SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，該AhFRDLl蛋白由520個(gè)氨基酸組成。
[0014]應(yīng)當(dāng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞，利用所述宿主細(xì)胞制備花生根系檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的方法等。
[0015]所述該序列經(jīng)替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，是指該序列的活性功能域之外的位點(diǎn)進(jìn)行有限氨基酸的保護(hù)替換所得的序列仍能保持原來(lái)的活性。
[0016]本發(fā)明通過(guò)一對(duì)引物擴(kuò)增上述花生根系檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因:
[0017]AhFRDLl-F: TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG
[0018]AhFRDLl-R:AACATGATTGCATTCATCTCCAT
[0019]把AhFRDLl基因轉(zhuǎn)入到擬南芥frd3_l突變體中。正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的條件下，相對(duì)于擬南芥frd3-l突變體，轉(zhuǎn)入AhFRDLl基因的擬南芥frd3_l突變體植株木質(zhì)部檸檬酸和鐵的濃度顯著增加，根系鐵含量顯著降低，葉片葉綠素總量上升，新葉活性鐵含量顯著增加，老葉活性鐵含量降低。
[0020]本發(fā)明有益效果:
[0021 ] I)本發(fā)明首次公開了一種花生根系檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，獲得了該基因cDNA全長(zhǎng)，并分析得到了其編碼的蛋白序列；
[0022]2)本發(fā)明的AhFRDLl基因可調(diào)控檸檬酸向木質(zhì)部分泌，并且參與木質(zhì)部鐵向地上部運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程；
[0023]3)本發(fā)明深入了植物鐵營(yíng)養(yǎng)分子機(jī)制的研究，為從植物分子育種角度獲得高鐵營(yíng)養(yǎng)高品質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)，為從分子育種及基因工程技術(shù)角度培育耐鐵花生品種提供必要的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為AhFRDLl基因與各物種同源基因之間的氨基酸序列相似性分析圖；
[0025]圖2為轉(zhuǎn)入AhFRDLl基因的擬南芥植株木質(zhì)部汁液檸檬酸含量圖；
[0026]圖3為轉(zhuǎn)入AhFRDLl基因的擬南芥植株木質(zhì)部汁液鐵含量圖；
[0027]圖4為轉(zhuǎn)入AhFRDLl基因的擬南芥植株根系總鐵含量圖；
[0028]圖5為轉(zhuǎn)入AhFRDLl基因的擬南芥植株新葉、老葉活性鐵含量圖；
[0029]圖6為轉(zhuǎn)入AhFRDLl基因的擬南芥植株葉片總?cè)~綠素含量圖；
[0030]其中，WT代表野生型、FRD3代表突變體、53、54、63、64代表不同的轉(zhuǎn)基因株系。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0032]實(shí)施例1花生AhFRDLl基因的克隆
[0033](1)花生水培培養(yǎng)
[0034]將花生種子魯花14(購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院)用10%雙氧水消毒20-30分鐘，清洗干凈后置于飽和硫酸鈣溶液中約8小時(shí)，并通氣避光。之后置于鋪有吸水紙的托盤中，澆適量的水后避光置于人工培養(yǎng)室中。培養(yǎng)室設(shè)置條件為光照14小時(shí)30度，黑暗10小時(shí)22度。1-2天左右花生發(fā)出小芽后移入石英砂中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出1-2片葉子后轉(zhuǎn)入水培營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)。水培營(yíng)養(yǎng)液配方如下=KH2PO4 (0.5mM)、K2SO4 (0.75mM)、KCl (0.1mM)、MgSO4.7H20(0.65mM)、CaSO4.2H20(2mM) ,H3BO3Cl μ M),MnSO4.4H20(1 μ M)、ZnS04.7H20(1 μ M)、CuSO4.5H20 (0.1 μ M)、(NH4) 6Μο7024.4Η20 (0.005 μ Μ)、EDTA-Fe (80 μ Μ)，pH 值為 5.8-6。
[0035](2)花生RNA提取
[0036]把保存于-80°C的花生根系及葉片樣品放入用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨植物樣品直至成粉末狀，取出約0.1g粉末樣品于1.5ml無(wú)RNase離心管中，加入ImlTrizol0渦旋震蕩15s，室溫靜置5min，加入200 μ I氯仿，充分混勻，靜置5min，4°C離心，12000rpm，15min，取上清液入1.5ml的離心管中，加入500 μ I異丙醇，混勻，室溫靜置lOmin，于4°C 12000rpm離心lOmin，取出后倒掉上清液，加入Iml 75%的乙醇，渦旋震蕩數(shù)秒，4°C 7500rpm離心5min，重復(fù)洗滌兩次，倒掉乙醇并吸去剩余上清液后，離心管于室溫下風(fēng)干。加入適量的DEPC水和RNA酶抑制劑，放于_20°C或_80°C冰箱中貯存?zhèn)溆?。[0037](3)基因全長(zhǎng)克隆
[0038]通過(guò)抑制性差減雜交獲得了花生AhFRDLl基因片段，用已知的片段序列設(shè)計(jì)引物，以花生根系RNA為模板,用invitrogen公司Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，Oligo(dT)15為引物，42°C反應(yīng)得到反轉(zhuǎn)錄cDNA模板。通過(guò)clonetech公司RACE試劑盒(SMARTRACE cDNA Amplification Kit)進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別克隆測(cè)序得AhFRDLl基因5’及3’端，5’端克隆引物為:
[0039]AhFRDL 1-5， -GSP ATCCGTGGCGCGCAGCTAAAGACG
[0040]3’端克隆引物為:
[0041]AhFRDL 1-3’ -GSP GCAGCCATTGCCCATGTCATTTCTCA
[0042]然后拼接得到全長(zhǎng)序列。
[0043]利用拼接的理論全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因全長(zhǎng)的引物，分別為:
[0044]AhFRDLl-F: TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG
[0045]AhFRDLl-R:AACATGATTGCATTCATCTCCAT
[0046]PCR反應(yīng)體系為:將根系cDNA稀釋5倍后取2 μ 1，10X反應(yīng)緩沖液2 μ 1，dNTP(10mM)0.5μ IjMgCl2 (50mM)0.5μ 1，正向引物 AhFRDLl-F (0.01mM)0.5μ 1，反向引物AhFRDLl-R (0.01mM) 0.5 μ I, ddH2013.7μ I，TaqDNA 聚合酶(invitrogen 公司)0.3 μ 1.將上述混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸2min ；30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0
[0047]PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳得到預(yù)期約1.6kb的DNA條帶，進(jìn)行膠回收純化，獲得DNA全長(zhǎng)。然后將回收得到的DNA連接到pMD20-T載體(TaKaRa公司)，16°C過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN公司)，涂于含Amp抗生素的LB板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑單克隆于LB液體37°C過(guò)夜搖菌，送菌液測(cè)序(上海生物工程公司)確定序列的正確性。對(duì)得到的cDNA進(jìn)行分析，利用DNAman軟件翻譯得到蛋白序列。AhFRDLl基因序列如SEQ ID N0.1所示(2034bp)，對(duì)應(yīng)氨基酸序列為SEQ ID N0.2。本發(fā)明基因與目前已經(jīng)鑒定的各個(gè)物種中的同源基因之間的氨基酸序列相似性分析如圖1所示。
[0048]實(shí)施例2轉(zhuǎn)入AhFRDLl基因的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化
[0049](I)將實(shí)施例1中構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，劃板培養(yǎng)，挑取單克隆到培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中28°C過(guò)夜培養(yǎng)。所述培養(yǎng)基為5ml的LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基中含IOg氯化鈉，IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0)中加入50mg/L Rif，25mg/L Gen, 50mg/L Kan ;將過(guò)夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌接種到500ml的培養(yǎng)瓶中，加入50mg/L Rif,50g Sucrose, 500ul Silwet-L77, IL MQ water，28°C過(guò)夜培養(yǎng)約 12h ;取上述菌液離心，4000-6500rpm, 15_20min,棄去上清液,用轉(zhuǎn)化介質(zhì)重懸沉淀至OD值達(dá)到
0.8左右備用。
[0050](2)用1%的瓊脂糖浸泡擬南芥frd3_l突變體種子(由美國(guó)康奈爾大學(xué)植物生理系 Leon Kochian 教授惠贈(zèng)，參見 “Durret TP, Gassmann ff, Rogers EE.2007.TheFRD3_mediated efflux of citrate into the root vasculature is necessary forefficient iron translocation.Plant Physiology.144:197-205.，，)，裝盆，點(diǎn)種前燒水至飽和。在20-22°C的溫室，光照16h黑暗8h光照處理，2-3天澆一次水。第一個(gè)花序長(zhǎng)到5-15cm,第二個(gè)花序剛出現(xiàn)時(shí)移苗到另一個(gè)盆中。
[0051]將擬南芥植株的花浸入含有農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基中l(wèi)min，保濕暗培養(yǎng)過(guò)夜。每天澆水，擬南芥正常生長(zhǎng)。當(dāng)種子成熟時(shí)，將種子收集到15ml或50ml的管子中。
[0052]種子滅菌:將種子放入50ml的滅菌管中，加入下列滅菌混合液:100 μ I TritonX-100, 3ml Bleach, 6.9ml MQ water,混合15min,短暫離心后將滅菌液倒出。用無(wú)菌水清洗種子4次。
[0053]篩選轉(zhuǎn)化子:將種子均勻的懸浮在1%的瓊脂糖中，將種子點(diǎn)到MS培養(yǎng)基上，點(diǎn)種后放置25-35min晾干培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方:4.3g/L MS salts，1%的蔗糖，5g/L MES8%phytagar,加瓊脂粉之前用IMNaOH調(diào)節(jié)pH值到5.7,高壓滅菌20min,冷卻后加入50mg/L Kan，在培養(yǎng)基凝固之前將培養(yǎng)基倒板。
[0054]培養(yǎng)基置于4°C的冰箱中`春化兩天后放在培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)；觀察擬南芥的生長(zhǎng)是否受細(xì)菌的威脅，如果被污染將擬南芥移到另一個(gè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；擬南芥幼苗至少有一個(gè)真葉時(shí)，將其移到擬南芥培養(yǎng)室的小盆中，將根上的瓊脂糖沖洗掉，將根系埋在土中，黑暗培養(yǎng)，2-3天澆一次水；擬南芥長(zhǎng)到一周后，用2μ 1/L的除草劑噴轉(zhuǎn)基因植株，每?jī)商靽娨淮危B續(xù)噴4-5次，約10-20%的植株能夠生存下來(lái)。
[0055]實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因植株T3代種子的獲得
[0056]將T2代種子放入1.5ml滅菌管中，加入里面Iml滅菌水，放入4°C的冰箱中春化2天。將蛭石和營(yíng)養(yǎng)滅菌，120°C，20min。將蛭石與營(yíng)養(yǎng)土以1:1的比例混合均勻，裝盆，點(diǎn)種前燒水至飽和。
[0057]將春化后的種子點(diǎn)種，點(diǎn)種后用塑料薄膜覆蓋住盆子，放在擬南芥培養(yǎng)室中培養(yǎng)，室內(nèi)溫度21_22°C，光照16h黑暗8h光照處理，光照植物出苗后，將塑料薄膜揭開，適當(dāng)澆水。
[0058]擬南芥長(zhǎng)到4-6片葉子時(shí)噴100mg/L的除草劑，每隔兩天噴一次連續(xù)噴三次，部分?jǐn)M南芥死亡。擬南芥成熟時(shí),收種子。
[0059]實(shí)施例4花生AhFRDLl基因生物學(xué)功能的驗(yàn)證
[0060]將T3代種子放入1.5ml離心管中，加入Iml滅菌水。將離心管放入4°C冰箱春化至少48h。配制母液(營(yíng)養(yǎng)液配方見表1 )，使用時(shí)將其稀釋1000倍，NaOH調(diào)節(jié)pH值在5.8-6.0之間。盆中裝入適量營(yíng)養(yǎng)液使點(diǎn)種板剛好漂浮起來(lái)，點(diǎn)種子。三天換一次營(yíng)養(yǎng)液。
[0061]點(diǎn)完種子后，放在擬南介培養(yǎng)室中黑暗培養(yǎng)72h。再培養(yǎng)5天后間苗留一棵。以后每3天換一次營(yíng)養(yǎng)液，等擬南芥長(zhǎng)即將抽薹的時(shí)候，收集擬南芥木質(zhì)部汁液，取樣測(cè)定。
[0062]表1擬南芥營(yíng)養(yǎng)液配方
【權(quán)利要求】
1.一種花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID N0.2衍生的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所載體的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因在提高植物木質(zhì)部鐵向地上部運(yùn)輸中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述花生檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因在制備高鐵營(yíng)養(yǎng)農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103665123SQ201210348268
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月18日
【發(fā)明者】左元梅, 邱巍, 郭笑彤, 李輝, 熊宏春 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)