專(zhuān)利名稱(chēng)：奶山羊泌乳相關(guān)miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于奶山羊選育技術(shù)領(lǐng)域，涉及奶山羊泌乳量相關(guān)miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)和其作為輔助選擇標(biāo)記在奶山羊育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)山羊品種資源豐富，養(yǎng)羊業(yè)的歷史悠久，羊的存欄數(shù)量占世界前列。在廣大的農(nóng)村、牧區(qū)及城市郊區(qū)發(fā)展養(yǎng)羊業(yè)有巨大的潛力。山羊業(yè)為我們的生活提供了奶、肉、羊毛、絨及皮革等多種生活產(chǎn)品。其中，奶山羊業(yè)，投資小，易飼養(yǎng)，見(jiàn)效快，被稱(chēng)為“農(nóng)家的奶?！?趙有璋2002)。羊奶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不含過(guò)敏原，營(yíng)養(yǎng)成分均衡，易消化吸收，與人乳蛋白質(zhì)組成相似，特別適宜于病人、嬰幼兒及老年人飲用，因此山羊奶是最符合人類(lèi)需求的 功能性保健食品(Haenlein，2004)。然而，在我國(guó)與其它養(yǎng)殖業(yè)相比，奶山羊養(yǎng)殖規(guī)模和方式相對(duì)落后。近年來(lái)，我國(guó)奶山羊存欄總數(shù)為580萬(wàn)只左右，發(fā)展非常緩慢，年產(chǎn)商品奶約占全國(guó)總奶量的3%。因此，利用分子育種技術(shù)加快良種選育從而發(fā)展和提高奶山羊業(yè)，這是我國(guó)未來(lái)奶業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)內(nèi)容之一，尤其是在“三聚氰胺事件”后對(duì)牛奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響，山羊奶則越來(lái)越受到人們的重視。應(yīng)用分子標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加奶山羊的泌乳量和改善乳品質(zhì)的先進(jìn)的有效的方法。應(yīng)用分子標(biāo)記育種首先是在DNA水平上篩查和檢測(cè)與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記；其次是建立其基因多態(tài)性的快速檢測(cè)方法；然后實(shí)現(xiàn)遺傳標(biāo)記輔助選擇和實(shí)現(xiàn)早期診斷選擇。近年來(lái)，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見(jiàn)的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、PCR-RFLP和直接測(cè)序技術(shù)等，但SSCP操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果易造成誤判；普通的PCR-RFLP方法要求待測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)是某ー特定酶切位點(diǎn)，應(yīng)用范圍局限；直接測(cè)序技術(shù)成本較高。MicroRNA(miRNA)在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)扮演著極其重要的角色。miRNA是ー類(lèi)小的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，能夠與靶mRNA的特定序列結(jié)合，通過(guò)降解靶mRNA或抑制翻譯發(fā)揮其重要調(diào)控作用(Bartel，2004)。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞分化與凋亡、生長(zhǎng)發(fā)育、糖脂代謝、炎癥、免疫應(yīng)答以及腫瘤發(fā)生等多個(gè)生理和病理過(guò)程中均扮演著關(guān)鍵角色，己有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明ー些miRNAs在乳腺上皮細(xì)胞的分化增殖過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Stefanie等(Stefanie et al.，2009)應(yīng)用高能量測(cè)序的方法研究產(chǎn)后母小鼠乳腺發(fā)育相關(guān)的miRNA表達(dá)變化規(guī)律，結(jié)果顯示miR-196a參考了小鼠產(chǎn)后腺發(fā)育的調(diào)控。但miR-196a在奶山羊上的研究目前還未見(jiàn)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供ー種奶山羊泌乳相關(guān)miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，該基因的單核苷酸多態(tài)性其檢測(cè)方便，可以作為輔助選擇標(biāo)記在奶山羊育種中應(yīng)用，加快良種選育速度和提高種群品質(zhì)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)ー種奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括在如SEQ ID No. I所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位為C或T的單核苷酸多態(tài)性。ー種奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，包括以下步驟I)以包含miR_196a基因的待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增奶山羊miR-196a基因；
所述的引物對(duì)P為正向引物CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA；反向引物GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT；2)用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的單核苷酸多態(tài)性CC基因型表現(xiàn)為265bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為265，241和24bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為241和24bp條帶。所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán);72°C延伸IOmin0所述瓊脂糖凝膠電泳為I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。所述將奶山羊miR_196a基因第340位SNP位點(diǎn)的CT基因型作為有效DNA標(biāo)記。所述的有效DNA標(biāo)記為CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標(biāo)記。所述的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性在奶山羊標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。所述奶山羊miR_196a基因第340位的單核苷酸多態(tài)性中的CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標(biāo)記。所述的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性在區(qū)分絨山羊與奶山羊的分子遺傳標(biāo)記中的應(yīng)用。所述的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性在區(qū)分絨山羊與奶山羊的分子遺傳標(biāo)記中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性，利用DNA池測(cè)序的方法篩查奶山羊miR-196a基因的多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)果表明該基因第340位為C或T的堿基多態(tài)性，而且進(jìn)一歩表明該基因與奶山羊的泌乳量相關(guān)，多態(tài)性可作為輔助選擇標(biāo)記在奶山羊育種中應(yīng)用，從而加快良種選育速度和提聞種群品質(zhì)。本發(fā)明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，針對(duì)其多態(tài)性的特性，設(shè)計(jì)了特定的PCR引物擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定SNP多態(tài)性，能夠簡(jiǎn)單、快速、成本低、精確的檢測(cè)其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性，對(duì)2個(gè)奶山羊品種和2個(gè)絨山羊樣品的上述SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，結(jié)果表明這個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)能夠成為絨山羊與奶山羊的區(qū)分特征；同時(shí)也對(duì)HinfI多態(tài)位點(diǎn)與莎能奶山羊各胎年泌乳量之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。方差分析結(jié)果表明，HinfI多態(tài)位點(diǎn)能夠成為提高奶山羊第二胎和第三胎泌乳量的分子標(biāo)記。本發(fā)明提供的奶山羊miR_196a基因的單核苷酸多態(tài)性，提供了ー種用簡(jiǎn)單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應(yīng)用的在DNA水平上篩查和檢測(cè)與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于奶山羊的輔助選擇和分子育種。


圖I是本發(fā)明的流程示意圖；圖2是本發(fā)明中PCR克隆篩查到的奶山羊miR_196a第340位C-T突變的SNP多態(tài)性測(cè)序結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明用來(lái)檢測(cè)SNP多態(tài)性的PCR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)突變的示意圖，其中方框中表示突變位點(diǎn)、帶下劃線為內(nèi)切酶識(shí)別序列，小寫(xiě)“g”是引入的錯(cuò)配堿基;圖4是本發(fā)明多態(tài)性檢測(cè)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中瓊脂糖凝膠濃度為 I. 5% ；圖5是本發(fā)明中奶山羊miR-196a基因第340位的HinfI-RFLP的三種基因型電泳結(jié)果，瓊脂糖凝膠濃度為2. 5% ;其中，TT基因型表現(xiàn)為355bp條帶，TC基因型表現(xiàn)為355，334和2Ibp條帶，CC基因型表現(xiàn)為334和2Ibp條帶；由于2Ibp較小，故在瓊脂糖電泳中看不到，但不影響判別基因型。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先根據(jù)miR_196a基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，分別以4種山羊品種的基因組DNA池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化，測(cè)序。然后，進(jìn)行測(cè)序圖的分析和序列的比對(duì)篩查出SNP位點(diǎn)；其次，對(duì)待測(cè)群體進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)的HinfI-RFLP檢測(cè)；最后，根據(jù)在群體中檢測(cè)到的基因型，進(jìn)行群體遺傳統(tǒng)計(jì)分析和泌乳量的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記。下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。a、山羊miR_196a基因DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測(cè)I、山羊血樣的采集及處理取山羊血樣10mL，加入O. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，_80°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用了 4種山羊品種，包括2中奶山羊和絨山羊，具體為I)關(guān)中奶山羊血樣440份采自陜西省西安市三原塔南保種場(chǎng)；
2)薩能奶山羊血樣268份采自陜西省寶雞市千陽(yáng)縣薩能奶山羊繁育中心(201份)和西北農(nóng)林科技大學(xué)奶山羊場(chǎng)(67份)；3)南疆白絨山羊血樣230份采自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊地區(qū)；4)新疆白絨山羊血樣119份采自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊地區(qū)；2、血樣基因組DNA的提取I)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至I. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin(4°C ),棄去上清液,重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA 和2. 5g的SDS加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?)加蛋白酶K3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過(guò)夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加I μ L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5mL離心管中，重復(fù)一次。5)加氯仿500 μ L,充分混勻20min,4°C, 12000r/min離心IOmin,將上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5mL離心管中。6)加O. I倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無(wú)水こ醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20°C保存30 60min。7) 4°C,12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%的冰冷こ醇漂洗DNA沉淀2次。8) 4°C, 12000r/min離心IOmin,棄上清液,室溫下使こ醇揮發(fā)干凈。9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完全溶解，O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80°C保存。3、DNA池的構(gòu)建用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和OD26tl/OD280的比值。如OD26(i/OD28(i比值小于I. 6，說(shuō)明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于I. 8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(ng ) =50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù)DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/ U L，然后從關(guān)中奶山羊品種30個(gè)濃度為50ng/ μ L DNA樣品中取10 μ L混合構(gòu)建成品種DNA池；按照同樣的方法也構(gòu)建薩能奶山羊、南疆絨山羊、新疆絨山羊品種DNA池。4、擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)由于山羊pri-miR_196a序列至今未知，故從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/)獲得同源動(dòng)物牛的GenBank登錄號(hào)為AC_000162. I 的pri_miR-196a DNA序列，以該基因序列同源保守區(qū)序列為參考用Primer5. O設(shè)計(jì)山羊pri_miR-196a的測(cè)序PCR引物對(duì)，擴(kuò)增片段總長(zhǎng)度為578bp。其測(cè)序引物對(duì)序列如下正向引物5’-GGTTTGGCGGCTTGAGGT-3’ 18bp ；
反向引物5’-GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT-3’22bp ；5、PCR 克隆山羊的 pri-miRNA_196a DNA 序列分別以4個(gè)山羊品種的DNA池為模版，用相應(yīng)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μ L，見(jiàn)表I ;PCR反應(yīng)程序，見(jiàn)表2。表IPCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種奶山羊rniR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括 在如SEQ ID No. I所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位為C或T的單核苷酸多態(tài)性。
2.一種奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 O以包含miR-196a基因的待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增奶山羊miR-196a基因； 所述的引物對(duì)P為 正向引物CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA ； 反向引物GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT ； 2)用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的單核苷酸多態(tài)性CC基因型表現(xiàn)為265bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為265，241和24bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為241和24bp條帶。
3.如權(quán)利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán);72°C延伸IOmin0
4.如權(quán)利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳為I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。
5.如權(quán)利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，將奶山羊miR-196a基因第340位SNP位點(diǎn)的CT基因型作為有效DNA標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求5所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的有效DNA標(biāo)記為 CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標(biāo)記。
7.權(quán)利要求I所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性在奶山羊標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，奶山羊miR-196a基因第340位的單核苷酸多態(tài)性中的CT基因型作為奶山羊泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遺傳標(biāo)記。
9.權(quán)利要求I所述的奶山羊miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性在區(qū)分絨山羊與奶山羊的分子遺傳標(biāo)記中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奶山羊泌乳相關(guān)miR-196a基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，其基因單核苷酸多態(tài)性包括在如SEQ ID No.1所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位為C或T的單核苷酸多態(tài)性。RFLP多態(tài)性與泌乳量關(guān)聯(lián)分析證實(shí)HinfI多態(tài)位點(diǎn)與泌乳量之間有顯著相關(guān)，基因型為CT的第二胎和第三胎泌乳量顯著高于基因型為CC和TT個(gè)體的，此外TT個(gè)體的體高顯著高于基因型CC和CT個(gè)體的。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可以用于西農(nóng)薩能奶山羊泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的奶山羊種群。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102839171SQ20121037198
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者陳宏 , 李轉(zhuǎn)見(jiàn), 郭文嬌, 藍(lán)賢勇, 黃永震, 孫加節(jié), 王璟 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)