專利名稱：利用scmv-cp基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法
利用SCMV-CP基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種運(yùn)用基因工程技術(shù)培育甘蔗抗花葉病 種質(zhì)材料的方法，包括甘蔗花葉病毒外殼蛋白(SCMV-CP)的氨基酸和核 酸序列，利用該序列構(gòu)建的載體及培育的轉(zhuǎn)基因植株，屬于植物基因工程 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘蔗花葉病是一種重要的世界性甘蔗病害，自1892年 Muschenbroek在爪哇首次記述甘蔗花葉病，至今全世界各大蔗區(qū)普遍發(fā) 生，并成為甘蔗生產(chǎn)的重要病害之一。近年來，我國的閩、臺、粵、桂、 滇、浙等省蔗區(qū)的果蔗及部分糖蔗品種也普遍發(fā)生。大田研究表明，當(dāng)初 侵染率達(dá)75%時，產(chǎn)量降低5% 19%，節(jié)間變短，品質(zhì)變差，嚴(yán)重影響商 品價值，而且蔗汁中還原糖增加，降低蔗糖的結(jié)晶率(陳宇航等，1988)。甘蔗花葉病可以經(jīng)病株汁液摩擦、蚜蟲、真菌和蔗種傳播，造成的損 火主要是感病植株作為蔗種，萌芽率降低，病株因葉綠體受到破壞而生長 較差，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量。目前除通過培育抗性品種外，主要是莖尖和愈 傷組織培養(yǎng)脫除感染的病毒，恢復(fù)品種特性，提高產(chǎn)量和糖分。但是脫毒 苗易退化而重新感病導(dǎo)致花葉病的爆發(fā)流行。因此，選育與利用抗病品種 是控制甘蔗花葉病發(fā)生的根本措施。由于甘蔗是異源多倍體，遺傳背景極其復(fù)雜，主要栽培種在正常栽培 條件下難以開花，用常規(guī)方法難以培育抗花葉病毒新品種(許莉萍等， 2001)。早期已報道，利用編碼病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株可以減少 或抵抗相同病毒的侵染，提高抗病毒性。這種現(xiàn)象稱為"外殼蛋白介導(dǎo)的 抗性"(參考Beachyetal, 1990 Annu. Rev. Phytopathol. 28:451-74)。 在有些情況下，轉(zhuǎn)基因植株也可能對相關(guān)CP基因來源的病毒產(chǎn)生抗性， 而對無關(guān)病毒仍保持敏感。從1986年，美國Powel-Abel最先報道了將 TMV-CP基因轉(zhuǎn)入煙草獲得了對TMV具有抗性的轉(zhuǎn)CP基因煙草植株以來， 利用病毒的CP基因獲得抗病植株的可行性已在多種病毒、多種植物中得 到證實。植物抗病毒基因工程迅速發(fā)展，已經(jīng)獲得許多植物抗病毒轉(zhuǎn)基因
植株，為抗病毒育種提供廣闊前景。本發(fā)明就是針對以上背景技術(shù)，通過分離克隆SCMV的外殼蛋白基因， 并利用其構(gòu)建高效植物表達(dá)載體，建立以抗生素為篩選劑的轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn) 化篩選體系，以及快速、高效的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)和抗病評價技術(shù)，大幅度 提高甘蔗抗花葉病育種效率，為甘蔗抗花葉病品種的培育奠定良好的技術(shù) 基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用SCMV-CP基因培育抗花 葉病甘蔗品種的方法。所解決的技術(shù)問題是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良甘蔗 抗花葉病的方法。具體地說，從高度感染甘庶花葉病的Badila中分離克 隆SCMV-CP基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)將其插入到甘蔗品 種Badila.的基因組中，培育抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗品種，以提高其抗病性。 所述的SCMV(Sugarcane Mosaic Virus)指甘蔗花葉病毒；所述的SCMV-CP 基因指編碼甘蔗花葉病毒的外殼蛋白基因。本發(fā)明利用SCMV-CP基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SCMV-CP 基因的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)CP基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病 轉(zhuǎn)CP基因材料的培育以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定，其 特征在于1 、 SCMV-CP的核苷酸序列為序列表中SEQ. ID. NO. l所示的堿基序列。2、 SCMV-CP的核苷酸序列所推演的氨基酸序列為序列表中SEQ. ID. NO. 2所示的氨基酸序列。3、 構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pUbi-SCMV-CP;所述的pUbi-SCMV-CP指以 SCMV-CP為目的基因，libi為啟動子，Nos為終止子，Z7/^II為篩選標(biāo)記基因 的植物表達(dá)載體。4、 利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗品種，其外源SCMV-CP基因插入基 因組的拷貝數(shù)為2 3個。根據(jù)上述培育方法獲得的轉(zhuǎn)SCMV-CP基因品種，其抗病性、光合能 力、產(chǎn)量、糖份都優(yōu)于甘蔗受體品種Badila及其組培后代。已獲得的轉(zhuǎn) SCMV-CP基因品種分別為福果2、福果36、福果38、福果48和福果51。
本發(fā)明的序列與己報道的其它病毒CP基因有明顯不同，SCMV-CP全長1170bp，包括病毒的完整外殼蛋白(Coat Protein, CP)序列及231bp 3'端非編碼區(qū)。由于病毒采用翻譯后修飾進(jìn)行蛋白編譯，整個病毒核酸 序列只有一個大的0RF，由一個起始密碼子ATG決定氨基酸編碼的起始位 置，所以所得基因序列的ORF并非始于ATG，在CP序列中存在DAG氨基 酸殘基序列，此結(jié)構(gòu)被認(rèn)為與蚜蟲傳播相關(guān)；在N-末端約100個氨基酸 為高度變異區(qū)，分析其5'末端核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)存在長度為20-30核苷 酸的重復(fù)序列，在此區(qū)域的氨基酸序列中，3個氨基酸的殘基數(shù)占總殘基 總數(shù)的60°/。以上，在SCMV-CP中它們?yōu)楣劝滨０?Q或Gln)、甘氨酸(G 或Gly)和丙氨酸(A或Ala);而在SrMV-CP中為天冬氨酸(D或Asp)、 賴氨酸(K或Lys)和丙氨酸(A或Ala)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因甘蔗品種具有以下優(yōu)點(diǎn)甘蔗花葉病發(fā)病率在0 20%之間，而且不同無性世代間基本保持穩(wěn)定，而受體品種拔地拉(Badila) 發(fā)病率達(dá)92% 100%，組培后代發(fā)病率也在30%以上(詳見表1);光合 能力明顯高于受體品種，凈光合速率達(dá)到36ii mol m—2 s—\為受體品種 的1. 5倍，光合作用關(guān)鍵酶PEPCase的活性達(dá)到1309. 2 U，為受體品種 的3倍(詳見表3);在大田生長快于受體品種，株高增加23% 32%，有 效莖數(shù)增加45% 55%。，每公頃蔗莖產(chǎn)量增加62% 80.6%，甘蔗糖份(絕 對值)提高1. 15% 2. 15% (詳見表2)。表l轉(zhuǎn)基因甘蔗花葉病的發(fā)病情況(％)試驗材料 -T無性繁殖世代 T2 T3T4抗性反應(yīng)抗病類型福果212. 312. 112. 012. 6MR恢復(fù)型6.45.65.48.6R延遲發(fā)病型轉(zhuǎn)基因品種 福果3824. 028.916.222. 1MR恢復(fù)型福果480. 00. 00.00.0HR免疫型福果5119.718.48. 010.9服恢復(fù)型受體原種(CK')91. 792. 1100. 099. 3HS/受體品種的組培后代(cig50. 041. 031. 636. 9S/注甘蔗花葉病的抗性反應(yīng)類型按照叢(株)感染率小于1.0%為高抗(HR)，叢(株)感染率1.1%~10.0%為抗病(R)，感染率10.1%~33.0%為中度抗病(MR)，叢 (株)感染率33.1%~66.0%為感病(S)，大于66.1%為高度感病(HS)。表2轉(zhuǎn)基因甘蔗的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)試驗材料甘蔗蔗 糖份(%)株高(cm)莖徑(cm)單莖重 (kg/條)有效莖 (萬條 /to2)蔗莖產(chǎn)量 (噸/ hm2)福果215.41213±8A3細(xì).1AB1.5肚0.09 AB5.6±0.1 a85.2±2.6 a轉(zhuǎn) 福果36 基14.85206±6 AB2.8士0.1B1.31±0.31 AB5.5士1.4a72.6士23.8a b因 福果3814.53211±3A3.1士0.3AB1.63±0.11 A5.6±0.4 a89.3土2.1a ' 福果4815.50221±3A3.0士0.1AB1.6±0.05 A5.9±0.8 a93.9士16.6a福果5114.50210±12A3.0i0.0AB1.45土0.12AB5.8土1.0a84.2±15.1 a受體原種(GQ14.05193±1B2.8±0.1BU9±0.08 B5.1 ±0.5 a60.9士4.4b受體品種的組 培后代(og13.35167±2C3.2土0.1A1.38±0.05 AB3,8±0.2 b52.0士3.3b汴統(tǒng)計分析采用Duncan新復(fù)極差法，小寫字母表示p<0.05，大寫字母表示P<0.01 。表3基因甘蔗(B48)與非轉(zhuǎn)基因甘蔗(Badila)葉片光合特性比較甘蔗葉片光合特性 非轉(zhuǎn)基因甘蔗(Badila) 轉(zhuǎn)基因甘蔗福果48凈光合速率(Pn) (ji mol m—2 s一1 )24. 7±1. 1B36. 0±0. 6A氣孔導(dǎo)度 (Cs)(咖ol m—2 s—1 )0.23 ±0.03B0. 36±0. 05A蒸騰速率(Tr) (mmol nf2. s—')3.68 ±0.63B5.79 ±0.63APEPCase活性(U)453.2 ±86.3B1309.2 ±89.4A注統(tǒng)計分析采用Duncan新復(fù)極差法，小寫字母表示p<0. 05，大寫字母表示P<0. 01;具體實施方式
為了進(jìn)一步更詳細(xì)地闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明， 以下結(jié)合實施例加以說明。實施例利用SCMV-CP基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括以下 步驟1、 甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因(SCMV-CP)的克隆通過GENBANK已經(jīng)公布的甘蔗花葉病毒亞組基因序列，并對其所編碼(2) RCP,第2組(3) FCP-(4) RCP:的多聚蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列分析后，根據(jù)保守氨基酸序列，設(shè)計 合成2組特異引物第1組(1) FCP" 5, -GGAAATAATAGTGGACAAC-3'5' -TCTCACCAAGAGACTCGCAG-3' 5' -CCATA丁ATAGCAGAAACAG-3' 5' -TAAAAGAAGGAGA-3' 利用上述第1組或第2組引物，以Trizol方法提取的感病葉片總RNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈，其反應(yīng)按照如下進(jìn)行:取5 y 1 總RNA樣品(約2 ug)，加入l u10. 5 ug/ul的Oligo(dT)w于70°C 溫育3 min，置冰上2 min后，分別加入下列成分5 P 1的5 X RNA M-MLV 緩沖液，9. 5 ii 1的無RNase的水，2 y 1的dNTPs， 0. 5 u 1的RNase抑制 劑以及2 w 1的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。輕輕混勻，稍離心，于42 r溫育60 min。 然后將反應(yīng)混合物加熱至75°C，溫育8 min終止反應(yīng)，冰上冷卻并稍離 心，-2(TC保存?zhèn)溆?。然后采用上述設(shè)計的RT-PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其 反應(yīng)組成如下.'5nl的IOXPCR緩沖液，36. 5ul的滅菌超純水，2yl 的dNTPs， 0. 5 u 1的TaKaRa Ex Taq酶以及FCP和RCP引物各1 P 1以及 4y 1的cDNA模板。PCR按如下反應(yīng)條件進(jìn)行94"變性2min，然后94°C 變性30sec、 52。C退火45sec、 72。C延長90sec， 30個循環(huán)，最后72。C延 長7 min， 4。C過夜。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，以新鮮的TAE Buffer為電泳緩沖 液，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用PCR Fragment Recovery Kit 的方法回收RT-PCR產(chǎn)物，然后連接到pMD-18-T載體上進(jìn)行酶切驗證和測 試，以RV-M和M13-47引物，在ABI PRISM 377XL型纖測序儀上對 pMD-18-T-CP質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，結(jié)果見SEQ. ID. NO. 1。采用BLAST、 D敲MAN 4.0、 OMIGA2.0軟件進(jìn)行序列分析，上述這些方法都是常規(guī)分子 生物學(xué)技術(shù)。2、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)SCMV-CP基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建用SscI和fe歷〃/雙酶切T-CP質(zhì)粒和pnNPTII表達(dá)載體，將切下的目 的基因CP片段和載體片段通過瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收，連接目 的基因和載體片段，轉(zhuǎn)化DH5 a并進(jìn)行PCR和酶切鑒定后得到Ubi啟動子
驅(qū)動的CP基因植物表達(dá)載體pUbi-SCMV-CP。采用基因槍的方法轉(zhuǎn)化甘蔗，篩選標(biāo)記基因為"/^I工。操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定為分子生物學(xué)的常規(guī)方法，參考薩姆布魯克和拉塞爾(黃培堂，王嘉璽等譯)，分子克隆實驗指南(第三版)，北京科學(xué)出版社，2002。3、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)SCMV-CP基因材料的培育(1) 受體材料預(yù)處理在基因槍轟擊前先將受體材料轉(zhuǎn)入JDA培養(yǎng) 基中預(yù)培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)入含滲透劑0.2 mol/L甘露醇和0.2 mol/L山 梨醇的JDA培養(yǎng)基中預(yù)處理4 6 h。(2) 基因槍轟擊將預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有愈傷組織的小培養(yǎng)皿放入基 因槍室的托盤上，關(guān)閉基因槍門，利用氣壓1100 psi和射擊距離6cm直 接轟擊甘蔗胚性愈傷組織。(3) 過渡培養(yǎng)轟擊后的愈傷組織仍放回預(yù)處理培養(yǎng)基(MS+2, 4-D 2 mg/L+Sorbitol 0.2 mol/L+Mannito1 0.2 mol/L)上繼續(xù)處理18h，其后 接入MS+2，4-D 2 mg/L的培養(yǎng)基上25。C暗恢復(fù)培養(yǎng)5 8 d。(4) 篩選繼代培養(yǎng)恢復(fù)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有30 mg/L G418 的JDA培養(yǎng)基上篩選繼代培養(yǎng)，15d繼代一次；(5) 篩選分化培養(yǎng)選擇繼代三次后仍存活的愈傷組織，轉(zhuǎn)接入含 有30 mg/L G418的ffl培養(yǎng)基進(jìn)行篩選分化。(6) 篩選促根培養(yǎng)抗性苗長到2-4cm后，轉(zhuǎn)入含有20mg/LG418 的SG培養(yǎng)基上篩選和生根培養(yǎng)。(7) 煉苗和移栽當(dāng)幼苗的根長至2.5 cm長時，移到室外煉苗2d， 然后將小苗取出，用流水洗凈附著的培養(yǎng)基，移栽到小花盆中(草木灰 砂子:耕作土=1:1:1，混合后高壓滅菌)定時噴澆稀釋10倍的MS無機(jī)鹽(8) 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測根據(jù)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的甘蔗花葉病病毒蛋白基 因序列設(shè)計特異引物，分別進(jìn)行PCR、 Southern和Northern雜交檢測， 對于標(biāo)記基因為，tl工基因的轉(zhuǎn)基因植株還進(jìn)行基因的分子檢測。 經(jīng)Southern雜交證實，轉(zhuǎn)基因抗花葉病品種的外源CP基因的拷貝數(shù)福 果2號、福果38和福果48分別為2個拷貝，福果36和福果51分別為3 個拷貝。Southern雜交采用Clontech公司ExpressHybM Hybridization Solution (產(chǎn)品號636833)的試劑盒，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒提供的 指南方法(ExpressHyb Hybridization Solution User Manual, PT1190-1 )。4、抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定根據(jù)國家轉(zhuǎn)基因安全管理條例，將獲得的轉(zhuǎn)基因植株及相應(yīng)的對照(空載體轟擊獲得的植株以及受體原種Badila)分別在人工氣候箱、大棚 溫室以及大田進(jìn)行抗病性和生長、產(chǎn)量和糖份的篩選鑒定，結(jié)合抗病、增 產(chǎn)的生理生化指標(biāo)，篩選評價轉(zhuǎn)基因無性系。在轉(zhuǎn)基因中間試驗階段，進(jìn) 行溫室和大田進(jìn)行人工接種鑒定；在環(huán)境釋放試驗階段進(jìn)行自然誘發(fā)接種 鑒定，并進(jìn)行工農(nóng)藝性狀的評價；在生產(chǎn)試驗示范階段進(jìn)行較大面積的田 間鑒定和工農(nóng)藝性狀的評價，篩選抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗新種質(zhì)材料。(1)抗病性鑒定 *接種鑒定病毒液粗提參照周仲駒等(1987)方法，取嚴(yán)重感染相同花葉病的 病葉加3倍量的(v/w) 0.1 mol/L pH7. 2含NaS0:,的磷酸緩沖液，經(jīng)高速組 織搗碎機(jī)搗碎5 min，雙層紗布過濾榨汁或12, 000 g離心10 min，取上清。 汁液用于田間或溫室病毒接種。接種方法用上述病毒汁液磨擦接種生長至7-8片葉的轉(zhuǎn)基因甘蔗植 株。接種時，接種葉片大小一致，先用鑷子輕輕劃傷嫩葉，然后沾取少量 病毒液涂抹傷口處。重復(fù)接種2次，每次間隔6 d。 .發(fā)病率調(diào)查首次接種7 d后開始調(diào)查發(fā)病率，以后每周調(diào)查一次， 直至發(fā)病率穩(wěn)定。 *自然誘發(fā)接種鑒定以空載體轉(zhuǎn)化植株、受體原種作為對照，每隔兩個轉(zhuǎn)基因甘蔗無性系， 種植一行原種作為誘發(fā)行。田間自然發(fā)病在甘蔗齊苗后開始調(diào)查發(fā)病率， 每周調(diào)查一次，直到發(fā)病率穩(wěn)定。*結(jié)果通過人工接種抗性鑒定和田間自然誘發(fā)鑒定，四個世代的轉(zhuǎn)基
因甘蔗與非轉(zhuǎn)基因甘蔗的發(fā)病情況見表l。在人工接種條件下，受體品種(原種)Badila的發(fā)病達(dá)91.7。/。，組培無性系發(fā)病率達(dá)50. 0%， Badila通過 組培后其發(fā)病率雖然也大幅度降低，但是還極易感病，而轉(zhuǎn)基因甘蔗的發(fā) 病率都低于25%，說明轉(zhuǎn)入外源SCMV-CP基因后提高了甘蔗抗花葉病的能 力。不同轉(zhuǎn)基因甘蔗無性系抗病性也存在著差異，其中福果48表現(xiàn)高抗， 在四個世代中均未發(fā)病，為免疫型；福果36表現(xiàn)抗病，平均發(fā)病率低于10%， 為延遲發(fā)病型(在田間葉片出現(xiàn)花葉病癥狀明顯遲于非轉(zhuǎn)基因甘蔗)；福 果2、福果38和福果51表現(xiàn)中抗，發(fā)病率在12. 3 22. 8%，為恢復(fù)型(即當(dāng) 發(fā)病率到達(dá)最大后，有些植株逐漸恢復(fù)，使得后期發(fā)病率降低)；比較不 同世代轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗病性，雖然在不同的世代其發(fā)病率有一定波動，但 基本保持較穩(wěn)定，說明其抗病能力可以通過無性繁殖穩(wěn)定的傳給下一代。(2) 生長和工農(nóng)藝性狀篩選 田間甘蔗出苗率達(dá)到50%以后，開始調(diào)查出苗率，每周調(diào)查一次，直至穩(wěn)定；甘蔗生長速度調(diào)查分蘗結(jié)束后開始，每30天調(diào)査一次直到11月份。 在甘蔗工藝成熟期，測量其錘度、株高、莖徑并計算有效徑數(shù)；糖份分析 在ll月中旬開始，每隔15天采樣分析蔗糖份、蔗汁純度、錘度、纖維分等。 結(jié)果見表2。(3) 轉(zhuǎn)基因甘蔗的光合特性*光合參數(shù)測定:在甘蔗生長的分蘗末期用LI-6400光合作用測量系統(tǒng)測 定甘蔗+l葉葉片的光合作用能力，以1500Wno1 m—2 s—'的固定光強(qiáng)測 定，每個重復(fù)隨機(jī)測定5株。* PEPCase酶活性測定參照現(xiàn)代植物生理實驗指南的方法，0. 3g樣品加 入2mL提取液(50聽l L—1 pH7. 5 Tris-HC1緩沖液，內(nèi)含l咖ol L-1 MgCl2， 2%PVP， 5咖ol.L—'DTT)研磨勻槳，8000 rpm離心10min，上 清液即為粗酶液，在lmL的反應(yīng)體系(50 mmol L—1 pH8. 0 HEPES—KOH 緩沖液，內(nèi)含IO mmol L—' NaHCO:,， 2%PVP， 5 mmol L—WgCl" 0.2 mmol.L—1 NADH， 4 mmol L—屮EP)中加入30 W的酶液啟動反應(yīng)，以 每mg蛋白每分鐘在340nm處OD值降低0. Ol作為一個酶活性單位。*結(jié)果光合特性結(jié)果見表3
序列表0625〈110〉 福建農(nóng)林大學(xué)< 120〉利用SCMV-CP基因培育抗花葉病甘庶品種的方法〈130〉"60〉 4、170〉 Patentln version 3.1"10> 1"11〉 1170112〉 DNA<213〉 Sugarcane Mosaic Virus (SCMV)〈400〉 1g('tggaacagtcgatgcaggcgctcaaggaggaggtgg犯acgccggaacccagccgcca60"('C3('t卿gC3gC3gCtC3C犯CC3CC3gcaactggggc3gctgcgcsa120r(:acccgcgactcaaggttcacaaccgcccacagggggagctactggtggaggtggtgca180ctggtgtaactggc'tcagttacaggaggccaaagagacaaggatgtagat240g(' Lggcacgacacagtgccaccatgtcaaagaagatgcgc300caa犯gggaaagatgttttgcatctggactttctgttgacatacaagccg360cacaagagcaaccagagaggagtttgataggtggtacg犯420g('cataaagaaatagatgacacacaaatgacagttgtcatgagtggtcta480("g'gtUggttggUgctcaatggaagttggacaatgatg540cttcccattgaaaccagttattg犯aacgcatctccaaca60011 ccgg'caaataatgcatcattt cagtgatgcagctgaagcatatatcga statagaaac660l (■ "ic叫-agcgatacatgccacgatatggacttxagcgaaatctcaccgactatagctta720catttgscttt tSCg3犯tgC3CC3gCt3g780grccacatgcagatgaaggccgcagcagtccgtggttcaaacac2tcgattgttcagtctg840wicgga朋tgtcggcg，cccaggagaatacagagagacacacagctggcgatgtcagt900actctctgttgggagtgcagcagc己ccactagtctcctggaaaccctgtt960atgtcagtgagg"ttctacctcgtctttact1020atattacgtatgtacttaaagcgtgaaccagtctgcaggac織gggttggacccagtgt1080("ctggtgtagcgtgtactagcgtcgagccacgtgacggacagcactgggtgtggctU1140g(、cattggtgctgcgagtctcUggtg卿1170〈210〉 2 <211〉 313 〈1M2〉 PRT〈213〉 Sugarcane Mosaic Virus (SCMV)、''100〉 2'\la Gly Thr Val Asp Ala Glv Ala Gin Gly Gly G1y Gly Asn Ala Gly 15 10 15Thr Gin Pro Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gin Gly Gly Ala Gin Pro 20 25 30Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gin Pro Pro Ala Thr Gin Glv Ser Gin 35 40 45
卩io卩]'。Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Glv Ala Gin Thr Gly Ala 50 55 60(;ly Val Thr Gly Ser Val Thr Gly Gly Gin Arg Asp Lys Asp Val Asp (i「〕 70 75 80Ala Glv Thr Thr Gly Lys lie Thr Val Pro Lvs Leu Lvs Ala Met Ser 85 90 95Lvs Met Arg Leu Pro Lys Ala l>vs Gly Lys Asp Val Leu His Leu 100 lt)5 110Asp Phe Leu Leu Thr Tyr Lys Pro Gin Gin Gin Asp lie Ser Asn Thr 115 120 125Arg Ala Thr Arg Glu Glu Phe Asp Arg Trp Tyr Glu Ala lie Lys Lys 130 135 140(;lu Tyr Glu lie Asp Asp Thr Gin Met Thr Val Val Met Ser Gly Leu 145 150 155 ' 160Mot Val Trp Cys lie Glu Asn Gly Cvs Ser Pro Asn lie Asn Gly Ser 165 ' 170 175IY卩Thr Met Met Asp Gly Asp Glu Gin Arg Val Phe Pro Leu Lys Pro 180 _ 185 190 'Lie Glu Asn Ala Ser Pro Thr Phe Arg Gin lie Met His His Phe 195 200 205Ser Asp Ala Ala Glu Ala Tyr lie Glu Tvr Arg Asn Ser Thr Glu Arg 2L0 215 220Tyr Mel Pro Arg Tyr Gly Leu Gin Arg Asn Leu Thr Asp Tyr Ser Leu 225 230 235 240Ala Arg Tyr Ala Phe Asp Phe Tyr Glu Met Asn Ser Arg Thr Pro Ala 245 250 255Arg /Ua Lys Glu Ala His Met Gin Met Lys Ala Ala Ala Val Arg Gly 260 265 270Ser Asn 丁hr Arg Leu Phe Ser Leu Asp Gly Asn Val Gly Glu Thr Gin 275 280 2&(;lu Asn Thr Glu Arg His Thr Ala Gly Asp Val Ser Arg Asn Met His 290 295 300Ser l.eu Leu Glv Val Gin Gin His His :U)5 310<210〉 3〈211〉 19<212〉 DNA<213〉 Sugarcane Mosaic Virus (SCMV)<formula>formula see original document page 13</formula>
權(quán)利要求
1、一種利用SCMV-CP基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SCMV-CP基因的克隆與測序、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)CP基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)CP基因材料的培育以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定，其特征在于(1)SCMV-CP的核苷酸序列為序列表中SEQ.ID.NO.1所示的堿基序列；(2)SCMV-CP的核苷酸序列所推演的氨基酸序列為序列表中SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列；(3)構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pUbi-SCMV-CP；(4)利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗品種，其外源SCMV-CP基因插入基因組的拷貝數(shù)為2～3個。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用SCMV-CP基因培育抗花葉病 甘蔗品種的方法，其特征在于設(shè)計合成的特異弓I物為(1) FCPl: 5， -GGAAATAATAGTGGACAAC-3，(2) RCP,: 5， -TCTCACCAAGAGACTCGCAG-3，。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法培育的轉(zhuǎn)SCMV-CP基因品種，其 抗病性、光合能力、產(chǎn)量、糖份都優(yōu)于甘蔗受體品種。
全文摘要
利用SCMV-CP基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SCMV-CP基因的克隆、抗花葉病轉(zhuǎn)CP基因甘蔗植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)CP基因材料的培育以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定。獲得的轉(zhuǎn)SCMV-CP基因甘蔗品種，其抗病性、光合能力、產(chǎn)量、糖份都優(yōu)于受體品種Badila及其組培后代。目前，已獲得轉(zhuǎn)SCMV-CP基因品種分別為福果2、福果36、福果38、福果48和福果51，發(fā)病率由受體品種的92％～100％，降至0～20％；凈光合速率達(dá)到36μmol·m^-2·s^-1，為受體品種的1.5倍；株高增加23％～32％，有效莖數(shù)增加45％～55％。每公頃蔗莖產(chǎn)量增加62％～80.6％，甘蔗糖份(絕對值)提高1.15％～2.15％。
文檔編號C12N15/82GK101126090SQ20071000922
公開日2008年2月20日 申請日期2007年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日
發(fā)明者偉 姚, 張木清, 鄧祖湖, 阮妙鴻, 陳如凱 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)