專利名稱：一種蚓激酶干粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蚓激酶干粉的制備方法，是一種利用生物酶解技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)蚓激酶干粉的方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蚓激酶粉是一種以鮮蚯蚓為原料的生物提取藥品，其為淡黃色至黃褐色粉末。本藥品為一組蛋白水解酶，包含纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原激活劑成分，使過高的纖維蛋白原和血小板凝集率降低，改善癥狀并防止病情發(fā)展的作用，適用于缺血性腦血管病的治療及預(yù)防。臨床試驗(yàn)證明，本藥的膠囊劑對缺血性腦血管病、中風(fēng)癱瘓肢體及語言障礙的恢復(fù)效果顯著，是一種安全的口服纖溶藥物。治療后病人血漿中的纖維蛋白原濃度降低，優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間明顯好轉(zhuǎn)，同時(shí)全血粘度、血漿粘度降低，并且能夠緩解病人的血小板聚集 功能的增強(qiáng)。藥理作用明顯，副作用少，如百奧蚓激酶腸溶膠囊(國藥準(zhǔn)字H11021129)?？寡ㄋ幬锸袌龅募卸群芨?，蚓激酶在最新的抗血栓藥物主要品種醫(yī)院市場份額的排名中位列第五。目前國內(nèi)的蚓激酶生產(chǎn)具有簡單粗放、自動化程度低、環(huán)保壓力大、蚓激酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較低等特點(diǎn)。這些特點(diǎn)限制了蚓激酶的規(guī)?；a(chǎn)，不利于蚓激酶產(chǎn)品質(zhì)量的提高，不能很好的滿足我國重大疾病防治和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求。如專利(ZL03146692. 3)公開了采用包括陰離子交換層析、超濾、凝膠過濾脫鹽等分離方法獲得達(dá)電泳級的蛋白酶，生產(chǎn)成本較高，質(zhì)量控制復(fù)雜。專利(ZL200410039186.8)公開了提高蚓激酶有效組分含量的方法，但是總活性不高，收率變化大。以上方法由于缺少有效的前處理方法，層析前中間體純度低，層析載量低，介質(zhì)污染嚴(yán)重，再生頻繁，并且生產(chǎn)規(guī)模小，成本高，產(chǎn)品總活性收率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蚓激酶粉的制備方法，適合自動化大生產(chǎn)，用于生產(chǎn)降纖藥物的原料。本發(fā)明采用生物酶解方法降低反應(yīng)體系黏度，快速高效地進(jìn)行固液分離，通過調(diào)節(jié)PH值選擇目標(biāo)蛋白，層析前除去可溶性雜質(zhì)；提高層析介質(zhì)的交換容量，延長其使用壽命，降低成本，擴(kuò)大自動化生產(chǎn)規(guī)模，實(shí)現(xiàn)自動化的現(xiàn)代生物生產(chǎn)。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供生物酶類自動化、高收率的生產(chǎn)線。本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種蚓激酶干粉的制備方法，包括如下步驟I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的O. 5 2倍的水，將經(jīng)步驟I)化凍后的蚯蚓粉碎，制成勻漿；3)生物酶處理將步驟2)得到的勻漿在30 40°C，優(yōu)選35 40°C保溫，同時(shí)加入中性蛋白酶，按蚯蚓重量的O. 1% O. 3%加入勻漿液中，保溫靜置2 6小時(shí)，優(yōu)選保溫靜置2 4小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2 3. 5倍，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，得到一次
澄清液；6)超濾步驟5)得到的澄清液采用中空纖維柱超濾，得到超濾液；7)澄清經(jīng)步驟6)超濾后的溶液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，加水洗滌，加水I 2次，得到二次澄清液；8)調(diào)節(jié)PH :配制O. 5 IM的氫氧化鈉溶液，調(diào)整步驟7)得到的澄清液至pH6. 5 8. 5，用PH計(jì)監(jiān)測；9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃色為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水，且溶液電導(dǎo)率g O. 2 X IO3 μ s/cm合格；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一30 一40°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至40 45°C干燥得到蚓激酶干粉。其中，所述步驟2)至步驟8)是完整的預(yù)處理過程。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟3)中的中性蛋白酶，為，但不限于，選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶中的一種或者多種。更優(yōu)選，所述中性蛋白酶為沙雷肽酶和端肽酶中的一種或多種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟3)采用的生物酶是中性蛋白酶，按蚯蚓重量的O. 1% O. 3%加入，生物酶處理溫度30 40°C，保溫靜置2. O 6. O小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟5)中的膜過濾系統(tǒng)操作條件為操作壓力為O. 12MPa、洗脫液流速小于I. 6M3/hr。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟6)超濾是采用標(biāo)準(zhǔn)截流分子量為5K 10K，優(yōu)選8K的立式膜中空纖維柱進(jìn)行的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟8)調(diào)整pH6. 5 8. 5預(yù)取代磷酸鹽洗脫來獲取目標(biāo)蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟12)是將步驟11)的澄清液用冷凍干燥法得到蚓激酶干粉。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟8)調(diào)節(jié)澄清液至pH7. O 8. 5。本發(fā)明提供的方法與已有的技術(shù)相比，通過有效的前處理，提高了中間體的純度收率，直接提高層析介質(zhì)的工作能力，擴(kuò)大了生產(chǎn)規(guī)模。同時(shí)，在生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大的情況下，保證了生產(chǎn)周期沒有明顯變化。其優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明采用生物酶解及調(diào)節(jié)PH值的技術(shù)，可以有效的降低勻漿液的粘度，同時(shí)獲得目標(biāo)蛋白物，通過反復(fù)超濾除去懸浮顆粒物及小分子蛋白、核酸等雜質(zhì)，不同階段的收集目標(biāo)蛋白，獲得總活性較高、純度較高的蚓激酶干粉，減少了其它方法生產(chǎn)的蚓激酶粉引起的環(huán)保處理、在線監(jiān)控存在死角等問題；而且本發(fā)明提供放大生產(chǎn)可能性。


圖I.蚓激酶現(xiàn)有生產(chǎn)工藝路線流程2.改進(jìn)后的本發(fā)明的生產(chǎn)工藝路線流程圖
具體實(shí)施例方式原料和來源本申請所用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶購自安琪酵母股份有限 公司。實(shí)施例II)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入沙雷肽酶，控制在35°C，保溫靜置6小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾是采用標(biāo)準(zhǔn)截流分子量為8K的立式膜中空纖維柱進(jìn)行的；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃色為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率=O. 2Χ103μ s/cm合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 6%，酶活力21000IU/mg。實(shí)施例2
I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入菠蘿蛋白酶，控制在35°C，保溫靜置6小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；
6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實(shí)施例I相同的立式膜中空纖維柱進(jìn)行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 5%，酶活力15200IU/mg。實(shí)施例3I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入木瓜蛋白酶，控制在35°C，保溫靜置6小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實(shí)施例I相同的立式膜中空纖維柱進(jìn)行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至 42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 6%，酶活力15000IU/mg。實(shí)施例4I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入端肽酶，控制在35°C，保溫靜置6小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實(shí)施例I相同的立式膜中空纖維柱進(jìn)行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 6%，酶活力20000IU/mg。實(shí)施例5
I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入端肽酶，控制在40°C，保溫靜置3小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3 次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實(shí)施例I相同的立式膜中空纖維柱進(jìn)行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至8. 5 ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至42°C干燥得到5. 2Kg蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 5%，酶活力20000IU/mg。實(shí)施例6I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入菠蘿蛋白酶，控制在40°C，保溫靜置3小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實(shí)施例I相同的立式膜中空纖維柱進(jìn)行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至8. 5 ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至42°C干燥得到5. 2Kg蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 3%，酶活力14300IU/mg。實(shí)施例7I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入木瓜蛋白酶，控制在40°C，保溫靜置3小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實(shí)施例I相同的立式膜中空纖維柱進(jìn)行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至8. 5 ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至42°C干燥得到5. 2Kg蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 5%，酶活力14000IU/mg。實(shí)施例8
I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內(nèi)，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機(jī)將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時(shí)，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入沙雷肽酶，控制在40°C，保溫靜置3小時(shí)；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣；5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液； 6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實(shí)施例I相同的立式膜中空纖維柱進(jìn)行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調(diào)整pH值采用pH計(jì)監(jiān)測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調(diào)節(jié)步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水、小分子物質(zhì)，且溶液電導(dǎo)率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至42°C干燥得到5. 2g蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 6%，酶活力20000IU/mg。表I使用各生物蛋白酶的酶活力比較
權(quán)利要求
1.一種蚓激酶干粉的制備方法，包括如下步驟 1)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將凍蚓室溫放置自然化凍； 2)制漿加入蚯蚓體積的O.5 2倍的水，將經(jīng)步驟I)化凍后的蚯蚓粉碎，制成勻漿； 3)生物酶處理將步驟2)得到的勻漿在30 40°C，優(yōu)選35 40°C保溫，同時(shí)加入中性蛋白酶，按蚯蚓重量的O. 1% O. 3%加入勻漿液中，保溫靜置2 6小時(shí)，優(yōu)選保溫靜置2 4小時(shí)； 4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2 3.5倍，通過蝶片式離心機(jī)除去其中的粗渣； 5)澄清經(jīng)步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統(tǒng)內(nèi)，加水洗滌，得到一次澄清液； 6)超濾步驟5)得到的澄清液采用中空纖維柱超濾，得到超濾液； 7)澄清經(jīng)步驟6)超濾后的溶液經(jīng)泵再次打入膜過濾系統(tǒng)，加水洗滌，得到二次澄清液； 8)調(diào)節(jié)PH:配制O. 5 IM的氫氧化鈉溶液，調(diào)整步驟7)得到的澄清液至pH6. 5 8. 5，用PH計(jì)監(jiān)測； 9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調(diào)整PH值后的澄清液，用O.3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時(shí)開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃色為止； 10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經(jīng)中空纖維柱或自動化層析超濾系統(tǒng)超濾，除鹽脫水，且溶液電導(dǎo)率蘭O. 2 X IO3 μ s/cm合格； 11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質(zhì)，得到澄清液； 12)凍干在潔凈區(qū)將步驟11)的澄清液于一30 一 40°C下冷凍10小時(shí)，繼續(xù)升溫至40 45°C干燥得到蚓激酶干粉。
2.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，步驟3)中的所述生物酶為選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶中的一種或者多種。
3.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，步驟3)中的所述生物酶為選自沙雷肽酶和端肽酶中的一種或者多種。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟3)于35 40°C保溫靜置2 6小時(shí)。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟3)于35 40°C保溫靜置2 4小時(shí)。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中的膜過濾系統(tǒng)操作條件為操作壓力為O. 12MPa、洗脫液流速小于I. 6M3/hr。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟6)超濾是采用標(biāo)準(zhǔn)截流分子量為5K IOK的立式膜中空纖維柱進(jìn)行的。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟6)超濾是采用標(biāo)準(zhǔn)截流分子量為8K的立式膜中空纖維柱進(jìn)行的。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟8)調(diào)節(jié)澄清液至pH7. O 8. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蚓激酶干粉的制備方法，該方法包括如下步驟將冷凍后的鮮蚓室溫化凍，制漿，生物酶處理，離心經(jīng)過濾膜澄清，超濾去除小分子雜蛋白，再經(jīng)過濾膜二次澄清，調(diào)節(jié)pH值，經(jīng)陰離子交換層析，得澄清液濃縮超濾，澄清過濾，凍干，得到蚓激酶干粉。本發(fā)明提供的蚓激酶干粉制備方法，具有制備方法質(zhì)量可控性和穩(wěn)定性高，分階段、可控的收集目標(biāo)物，提高蚓激酶的總活性收率，收率穩(wěn)定，降低制備成本，減少層析介質(zhì)污染，且易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。
文檔編號C12N9/64GK102876652SQ20121037227
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者閆曉玲, 郭燕青, 張波, 呂學(xué)富, 王雪, 侯全民 申請人:北京百奧未來生物科技有限公司