高效克隆篩選表達(dá)載體、其制備方法及用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效克隆篩選表達(dá)載體，該載體由piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的ITRs序列插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中得到。本發(fā)明還公開(kāi)了上述載體的制備方法及其用途。本發(fā)明利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的ITRs序列構(gòu)建高效克隆篩選表達(dá)載體，同時(shí)將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的能在小鼠中高效表達(dá)的轉(zhuǎn)錄酶基因克隆到另外一個(gè)真核表達(dá)載體上，通過(guò)含ITRs序列的表達(dá)載體和含轉(zhuǎn)錄酶的載體的共表達(dá)，將篩選標(biāo)記與目的基因一同整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而大大提高了轉(zhuǎn)染的效率和陽(yáng)性克隆的篩選率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】高效克隆篩選表達(dá)載體、其制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域,特別是涉及一種用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的ITRs序列構(gòu)建的高效克隆篩選表達(dá)載體，該載體的構(gòu)建方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動(dòng)的DNA序列，可以通過(guò)切割、重新整合等一系列過(guò)程從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置。轉(zhuǎn)座子占人和小鼠基因組序列的40%以上(Nature, 2001, 409, 860 - 921 ；Nature,2002, 420, 520 - 562)。
[0003]自從McClintock從玉米中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)轉(zhuǎn)座子以來(lái)(Proc.Natl.Acad.Sc1.1950, USA36, 344 - 345)，轉(zhuǎn)座因子已成為很多生物寶貴的遺傳分析工具。在原核生物中，利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行的突變研究發(fā)現(xiàn)了在有害微生物致病時(shí)起重要作用的基因(Science, 1999，286，2165 - 2169 ；J.Virol.2003，77，123 - 134)。在真核生物中，運(yùn)用 P 因子(一種轉(zhuǎn)座子)的轉(zhuǎn)基因和插入突變技術(shù)大大推動(dòng)了果蠅遺傳學(xué)的發(fā)展。包括P因子在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)座子在其天然宿主以外的生物體中沒(méi)有活性，說(shuō)明轉(zhuǎn)座過(guò)程涉及一些宿主因子(Arch.1nsect Biochem.Physiol.1993, 22, 373 - 384)。Tcl/Mariner 家族在內(nèi)的幾種轉(zhuǎn)座系統(tǒng)已應(yīng)用于小鼠和斑馬魚(yú)。一種利用比較系統(tǒng)發(fā)育學(xué)手段人工合成的Tcl類(lèi)轉(zhuǎn)座^ Sleeping Beauty (SB)被證明在小鼠和人的細(xì)胞中具有活性(Cell 1997，91，501-510 ;Proc.Natl.Acad.Sc1.1998，USA 95，10769 - 10773)。雖然 SB和Minos等轉(zhuǎn)座子已在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了插入突變測(cè)試，但由于新插入位點(diǎn)集中在原始位點(diǎn)周?chē)⑥D(zhuǎn)座效率低下以及攜帶DNA長(zhǎng)度有限等原因，這些轉(zhuǎn)座子并沒(méi)有被廣泛地應(yīng)用(Genomics 2003,81, 108-111 ；Mol.Cell.Biol.2003, 23, 9189-9207)。
[0004]PB因子是一種來(lái)源于飛蛾甘藍(lán)尺蠖中的`DNA轉(zhuǎn)座子，全長(zhǎng)2472個(gè)堿基。它兩端含有13個(gè)堿基的反向末端重復(fù)序列(ITR)，并編碼一個(gè)594個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)座酶。PB已被成功地用于黑腹果蠅和其它昆蟲(chóng)的遺傳分析。它特異地插入四堿基TTAA位點(diǎn)，并在插入位點(diǎn)兩側(cè)形成 TTAA 重復(fù)(Virology 1989，172，156 - 169 ；Virology 1995，211，397 - 407 ；InsectMol.Biol.1996，5，141 - 151)。由于其特有的轉(zhuǎn)座酶和TTAA目標(biāo)序列，PB成為了一個(gè)新的 DNA 轉(zhuǎn)座子家族——PiggyBac 家族的代表(In Mobile DNA II，2002，pp.1093 - 1110)。PB作為生殖系轉(zhuǎn)基因工具已被應(yīng)用于四個(gè)目的十余種昆蟲(chóng)(Insect Biochem.Mol.Biol.2003，33，449 - 458)。作為誘變劑，PB在黑腹果蠅中的轉(zhuǎn)座效率至少和P因子相當(dāng)(Nat.Genet.2004, 36, 283 - 287)。在紅色面象蟲(chóng) Tribolium castaneum 中，PB 在非同源染色體間也可高效轉(zhuǎn)座(Insect Mol.Biol.2003, 12,433 - 440)。霉菌到哺乳動(dòng)物等許多系統(tǒng)發(fā)育地位不同的物種基因組中都發(fā)現(xiàn)有很多類(lèi)似PB的序列，進(jìn)一步預(yù)示了 PB的活性可能并不僅局限在昆蟲(chóng)中(Mol.Genet.Genomics, 2003，270，173 - 180)。事實(shí)上，最近發(fā)現(xiàn)PB也能在渦蟲(chóng)Girardiatigrina、哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞中具有高效的轉(zhuǎn)座活性，已在動(dòng)物基因組功能研究、基因轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用(Proc.Natl.Acad.Sc1.2003，USA 100，14046 - 14051)。[0005]雖然PB系統(tǒng)具有廣泛的宿主性，以及高效的轉(zhuǎn)染效率，而且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已廣泛用于基因治療(Molecular Therapy, 2007, 15，139-145)，但是目前其在體外研究還未曾有相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種高效克隆篩選表達(dá)載體，它可以大大提高轉(zhuǎn)染效率和陽(yáng)性克隆的篩選率。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的高效克隆篩選表達(dá)載體，由piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的ITRs序列插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中得到。
[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供上述高效克隆篩選表達(dá)載體的制備方法。
[0009]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的高效克隆篩選表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟:
[0010]I)以pGH為克隆載體，全基因合成5’ ITR和3’ ITR DNA片段，片段的兩頭加入EcoRV的酶切位點(diǎn)，得到載體pGH-1TR5和pGH_ITR3 ；
[0011]2)以pGH為克隆載體，全基因合成GeneBank序列號(hào)為EF587698的轉(zhuǎn)錄酶基因片段，且片段的兩頭分別加入EcoRI和HindIII的酶切位點(diǎn)，得到載體pGH-Transposase ；
[0012]3)用 EcoRV 酶切載體 pGH_ITR5 和 pGH_ITR3，EcoRI 和 HindIII 酶切載體pGH—Transposase ；
[0013]4) NruI酶切 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，同時(shí)EcoRI和HindIII酶切表達(dá)載體pTriEx2 ；
[0014]5)將片段ITR5連接到經(jīng)過(guò)NruI酶切的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，得到含ITR5片段的表達(dá)載體；
[0015]6)同時(shí)將片段Transposase連接到經(jīng)過(guò)EcoRI和HindIII酶切的表達(dá)載體pTriEx2,得至Ij新表達(dá)載體 pTriEx2_Transposase ；
[0016]7) Bstz 171酶切步驟5)得到的含ITR5片段的表達(dá)載體；
[0017]8)將片段ITR3連接到步驟7)得到的表達(dá)載體。
[0018]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供上述高效克隆篩選表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞和篩選表達(dá)目的蛋白克隆中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的ITRs序列構(gòu)建高效克隆篩選表達(dá)載體，同時(shí)將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的能在小鼠中高效表達(dá)的轉(zhuǎn)錄酶基因克隆到另外一個(gè)真核表達(dá)載體上，通過(guò)含ITRs序列的表達(dá)載體和含轉(zhuǎn)錄酶的載體的共表達(dá)，將篩選標(biāo)記與目的基因一同整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而大大提高了轉(zhuǎn)染的效率和陽(yáng)性克隆的篩選率，也為構(gòu)建多個(gè)亞基共表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系提供了可能，為研究外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能提供了有利的條件。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)-1TRs的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021]圖2是表達(dá)載體pcDNA4 /T0-1TRs的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】[0022]為對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合圖示的實(shí)施方式，詳述如下:
[0023]實(shí)施例1 pcDNA3.1 (+)-1TRs載體的制備
[0024]pcDNA3.1 (+)-1TRs表達(dá)載體的構(gòu)建如圖1所示，以pc DNA3.1 (+)為載體，按照DNA序列正確的方向(見(jiàn)圖1)將ITRs序列插入到載體上，得到含ITRs序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+) -1TRs。該表達(dá)載體pcDNA3.1 (+) -1TRs在轉(zhuǎn)座時(shí)能夠攜帶著哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(CMV)、多克隆位點(diǎn)(MCS)處的目的基因以及篩選基因(Neomycin) —起整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
[0025]具體制備方法如下:
[0026](I)從商品化的pXL-BacII質(zhì)粒載體中，找出其5’ ITR和3’ ITR的具體序列；從已報(bào)道的文獻(xiàn)(Nucleic Acids Research, 2007, 35, e87)中找到經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的能在小鼠中高效表達(dá)的轉(zhuǎn)錄酶(Transposase)基因序列(GeneBank序列號(hào):EF587698)。其中，
[0027]5，ITR 序列(SEQ ID No:1)為:
【權(quán)利要求】
1.一種高效克隆篩選表達(dá)載體，其特征在于，該載體由piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的ITRs序列插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體為PCDNA3.1 (+)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，該載體具有如SEQID No:3所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體為PCDNA4/T0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，該載體具有如SEQID No:4所示的序列。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)以PGH為克隆載體，全基因合成5’ITR和3’ ITR DNA片段，片段的兩頭加入EcoRV的酶切位點(diǎn)，得到載體PGH-1TR5和pGH-1TR3 ； 2)以pGH為克隆載體，全基因合成GeneBank序列號(hào)為EF587698的轉(zhuǎn)錄酶基因片段，且片段的兩頭分別加入EcoRI和HindIII的酶切位點(diǎn),得到載體pGH_Transposase ； 3)用EcoRV 酶切載體 pGH-1TR5 和 pGH_ITR3，EcoRI 和 HindIII 酶切載體pGH—Transposase ；4)NruI酶切哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，同時(shí)EcoRI和HindIII酶切表達(dá)載體pTriEx2 ； 5)將片段ITR5連接到經(jīng)過(guò)NruI酶切的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，得到含ITR5片段的表達(dá)載體； 6)同時(shí)將片段Transposase連接到經(jīng)過(guò)EcoRI和HindIII酶切的表達(dá)載體pTriEx2，得到新表達(dá)載體pTriEx2_Transposase ； 7)Bstz 171酶切步驟5)得到的含ITR5片段的表達(dá)載體； 8)將片段ITR3連接到步驟7)得到的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括pcDNA3.1 (+)或 pcDNA4/T0。
8.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述載體在篩選表達(dá)目的蛋白克隆中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述載體在轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人胚腎細(xì)胞HEK293或人宮頸癌細(xì)胞Hela。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103834686SQ201210483844
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月23日
【發(fā)明者】樓莊偉, 孔云華, 梅佳, 賈園, 陳侃, 宋云鵬, 呂強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司, 蘇州藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司, 無(wú)錫藥明康德生物技術(shù)有限公司