本發(fā)明屬于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，具體涉及一種腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型生物標(biāo)志物的篩選及確定方法。

背景技術(shù)：

“證”是中醫(yī)學(xué)理論體系的核心，中醫(yī)臨床首重辨證論治，但辨證很大程度上受醫(yī)家自身（如對(duì)中醫(yī)藥知識(shí)的理解、臨床經(jīng)驗(yàn)等）及患者主觀因素的影響，難以客觀化和定量化，造成辨證結(jié)果不統(tǒng)一，影響治法的確立、選方用藥及臨床療效的評(píng)價(jià)，阻礙中醫(yī)學(xué)的研究及發(fā)展。中醫(yī)基礎(chǔ)研究中采用動(dòng)物模型可以模擬疾病的真實(shí)過(guò)程，與“證”的生理和病理狀態(tài)相似，因此借助腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型是研究腎虛證實(shí)質(zhì)的必由之路。

本實(shí)驗(yàn)采用氫化可的松肌肉注射所模擬出的腎陽(yáng)虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測(cè)及cAMP/cGMP比值結(jié)果符合目前常用的腎陽(yáng)虛證模型的鑒定要求，表明本研究的腎陽(yáng)虛模型制作是成功的，但以上評(píng)價(jià)方法以主觀評(píng)價(jià)為主，評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏特異性、客觀性，研究結(jié)果能否科學(xué)闡明中醫(yī)“證”的實(shí)質(zhì)以及所復(fù)制的動(dòng)物證候模型是否具有代表性，同樣涉及辨證的客觀化和定量化的問(wèn)題。因此尋找具有一定特異性的客觀指標(biāo)來(lái)判別鑒定腎陽(yáng)虛模型是否成功，是進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

基于中醫(yī)“腎主骨”的理論，骨組織作為“腎”功能的外在表現(xiàn)部位之一，其內(nèi)在生物學(xué)特征的變化與“腎”的功能狀態(tài)必然存在著密切聯(lián)系。蛋白質(zhì)是體現(xiàn)組織細(xì)胞功能與執(zhí)行生命活動(dòng)最直接的活性物質(zhì)，骨組織的結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)最終體現(xiàn)于其內(nèi)在功能蛋白質(zhì)組和基因組的表達(dá)狀態(tài)。隨著對(duì)疾病中醫(yī)“證”與蛋白質(zhì)組相關(guān)研究的深入，目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到：中醫(yī)“證”的表現(xiàn)實(shí)質(zhì)是疾病個(gè)體特定的功能蛋白質(zhì)組及其基因組的表達(dá)水平；疾病不同中醫(yī)證型之間區(qū)別的實(shí)質(zhì)是功能蛋白質(zhì)組及其基因組表達(dá)水平的差異。因此，通過(guò)對(duì)骨組織差異蛋白質(zhì)組表達(dá)水平的檢測(cè)，有望從骨組織功能蛋白質(zhì)組層面上進(jìn)一步揭示中醫(yī)腎陽(yáng)虛證候的實(shí)質(zhì)。

基于以上理論基礎(chǔ)與研究背景，本研究借助于蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路和技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)，以大鼠的骨組織（松質(zhì)骨）為研究對(duì)象，分別展示它們?cè)谀I陽(yáng)虛與正常狀態(tài)下松質(zhì)骨的蛋白質(zhì)組圖譜，比較它們之間存在的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，從松質(zhì)骨功能蛋白質(zhì)組層面深入探討中醫(yī)腎陽(yáng)虛證的實(shí)質(zhì)，進(jìn)一步深化對(duì)中醫(yī)“腎”與骨內(nèi)在關(guān)聯(lián)的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能在腎陽(yáng)虛證發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能是腎陽(yáng)虛證診斷的潛在生物標(biāo)志物。由于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)是冗長(zhǎng)而又繁雜的過(guò)程，需借助多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從多層面多角度反復(fù)鑒定、驗(yàn)證及確認(rèn)。故對(duì)于初步篩選的差異蛋白，我們需要從蛋白水平、基因水平進(jìn)一步對(duì)靶定蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，以規(guī)避單一實(shí)驗(yàn)方法的局限，保證前期蛋白質(zhì)組學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如何選取感興趣的候選蛋白，對(duì)其進(jìn)一步研究，探討其與腎陽(yáng)虛證的密切聯(lián)系，并同時(shí)證明本生物標(biāo)志物篩選方法的可行性是本研究的重點(diǎn)。

當(dāng)今科技正步入云媒體、大數(shù)據(jù)的時(shí)代，各種信息蜂擁而至，經(jīng)云計(jì)算、大數(shù)據(jù)挖掘，一些功能強(qiáng)大、內(nèi)容豐富、更新頻繁的在線蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(PPI Database)應(yīng)運(yùn)而生，已成為研究預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能重要手段之一。本部分研究利用免費(fèi)在線PPI Database –String10對(duì)前期所鑒定出已知蛋白進(jìn)行系統(tǒng)綜合分析，篩選候選蛋白作進(jìn)一步研究。該數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋面廣、整合度高、更新頻率快，并能對(duì)蛋白質(zhì)之間直接和間接相互作用的關(guān)系能做出一定的預(yù)測(cè)，從而可初步在生物信息學(xué)層面對(duì)所鑒定的差異蛋白在疾病中的作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，為對(duì)后續(xù)的驗(yàn)證性研究提供思路。借助于String數(shù)據(jù)庫(kù)檢索提供的生物學(xué)信息提示，同時(shí)我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合前期研究結(jié)果，我們推測(cè)腎陽(yáng)虛證癥狀和體征的改變可能與某幾個(gè)關(guān)鍵差異蛋白所在蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控密切相關(guān)。因此我們挑選了Ⅰ型膠原α-1鏈和GDP解離抑制因子1作為驗(yàn)證對(duì)象。

此外，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物模型的骨骼標(biāo)本不易獲取，相對(duì)而言血標(biāo)本獲取較為便捷且容易保存。血液檢測(cè)已是臨床上預(yù)防和診治疾病最普遍的輔助手段之一。血液幾乎涵蓋來(lái)自機(jī)體各器官組織的蛋白，既然在腎陽(yáng)虛與正常大鼠骨組織（松質(zhì)骨）之間存在差異蛋白質(zhì)，那么在血液中是否也存在這種差異。鑒于此，我們還試圖抽取兩組實(shí)驗(yàn)大鼠血液測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)的含量，并分析其濃度與骨組織（松質(zhì)骨）相應(yīng)蛋白表達(dá)水平的一致性，參照臨床上的“醫(yī)學(xué)參考值范圍”的定義：將腎陽(yáng)虛大鼠模型的ELISA測(cè)定結(jié)果與正常組大鼠的數(shù)值進(jìn)行比較，觀察測(cè)定值是否超出了正常大鼠相應(yīng)指標(biāo)的波動(dòng)范圍，我們選用正態(tài)分布資料雙側(cè)95%參考值范圍的公式（±1.96S）計(jì)算出正常組大鼠血清中相應(yīng)蛋白含量的波動(dòng)范圍，作為判別測(cè)定結(jié)果的重要參考，探尋腎陽(yáng)虛證診斷的潛在血液標(biāo)志物。

基于以上所述，本研究以大鼠的骨組織（松質(zhì)骨）為研究對(duì)象，在前期蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取在腎陽(yáng)虛證發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到重要作用的差異蛋白質(zhì)，使用Western-Blot和RT-PCR技術(shù)從蛋白及基因水平進(jìn)行雙重驗(yàn)證，進(jìn)一步明確腎陽(yáng)虛證的骨組織（松質(zhì)骨）差異蛋白質(zhì)。同時(shí)，采用ELISA測(cè)定相應(yīng)蛋白在腎陽(yáng)虛證與正常大鼠的血液中含量，為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中腎陽(yáng)虛證模型的評(píng)價(jià)奠定研究基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服目前腎陽(yáng)虛證辨證技術(shù)未客觀化的不足，應(yīng)用雙向凝膠電泳（2DE）及MALDI-TOF/MS技術(shù)，獲取腎陽(yáng)虛證及正常組大鼠骨組織蛋白圖譜，經(jīng)質(zhì)譜分析及鑒定，篩選出松質(zhì)骨中存在差異表達(dá)的蛋白，并且選取可能在腎陽(yáng)虛證發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的部分蛋白進(jìn)行Western-Blot和RT-PCR技術(shù)從蛋白及基因水平雙重驗(yàn)證，并結(jié)合血清中相關(guān)蛋白的ELISA檢測(cè)，最終靶定可以成為腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型的潛在生物標(biāo)志物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型生物標(biāo)志物的篩選及方法，其具體步驟如下：

（1）腎陽(yáng)虛證大鼠模型的建立；用于構(gòu)建動(dòng)物模型的大鼠為WISTAR大鼠。

（2）差異蛋白的篩選。具體包括如下步驟：

a)大鼠松質(zhì)骨總蛋白的提取；

b)測(cè)定蛋白濃度；

c)雙向凝膠電泳分析；

d)凝膠蛋白點(diǎn)的檢測(cè)與差異蛋白點(diǎn)顯示分析；

e)差異蛋白的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析；

f)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及鑒定，確定差異蛋白。

（3）部分差異蛋白的驗(yàn)證。具體采用以下兩種方法進(jìn)行差異蛋白的驗(yàn)證：

a)應(yīng)用Western-Blot方法從蛋白質(zhì)水平對(duì)標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證；

b)應(yīng)用RT-PCR方法從基因水平對(duì)標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。

（4）腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型生物標(biāo)志物的確定。其確定方法為：將血清蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果與Western-Blot、RT-PCR檢測(cè)對(duì)比分析，選取表達(dá)趨勢(shì)一致且在正常值范圍之外的差異蛋白作為生物標(biāo)志物。

較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”理論，以腎陽(yáng)虛證狀態(tài)下骨組織作為研究對(duì)象，采用蛋白組學(xué)等先進(jìn)研究方法，深化了對(duì)“腎主骨”理論的科學(xué)認(rèn)識(shí)。

（2）本發(fā)明建立在完整的蛋白組學(xué)方法基礎(chǔ)之上，經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證和篩選，挑選出的待測(cè)蛋白能反應(yīng)腎陽(yáng)虛證的病理本質(zhì)。

（3）血液涵蓋了幾乎來(lái)自全身機(jī)體組織的蛋白質(zhì)，因此血液檢測(cè)是臨床上最普遍的輔助診療手段之一；而ELISA技術(shù)可直接用于檢測(cè)體液中大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明將二者有機(jī)結(jié)合，篩選出的腎陽(yáng)虛證的標(biāo)志蛋白，可應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)其在血液中含量，并運(yùn)用正態(tài)分布資料雙側(cè)95%參考值范圍的公式（±1.96S）計(jì)算出正常組大鼠血清中相應(yīng)蛋白含量的波動(dòng)范圍，作為判別測(cè)定結(jié)果的重要參考，因此可十分簡(jiǎn)便高效地對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎陽(yáng)虛的狀態(tài)進(jìn)行判斷，篩選符合需求的動(dòng)物模型。

（4）本發(fā)明可以進(jìn)一步推動(dòng)中醫(yī)診斷的便捷、客觀化，促進(jìn)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型的科學(xué)評(píng)定。

附圖說(shuō)明

圖1正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠股骨干松質(zhì)骨差異蛋白點(diǎn)標(biāo)識(shí)。

圖2 GDP解離抑制因子1（Arhgdia）的MAIDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜圖。

圖3 Ⅰ型膠原α-1鏈（Col1a1）的MAIDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜圖。

圖4正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠松質(zhì)骨中Col1a1和Arhgdia 蛋白表達(dá)的比較。

圖5正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠松質(zhì)骨中Col1a1 mRNA表達(dá)的比較。

圖6正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠松質(zhì)骨中Arhgdia mRNA表達(dá)的比較。

圖7正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠血清中Col1a1和Arhgdia含量表達(dá)的比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明：

實(shí)施例一：

腎陽(yáng)虛證模型大鼠的建立和鑒定：

1 實(shí)驗(yàn)耗材

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性3月齡健康SPF（Specific Pathogen Free）級(jí)WISTAR大鼠共40只，體重200~240 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：2007000548015。福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0001。

1.2 主要試劑及藥物

表1 主要試劑及藥物

1.3 主要儀器

表2 主要儀器

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

40只WISTAR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、腎陽(yáng)虛組，每組20只。腎陽(yáng)虛大鼠連續(xù)造模15 d后，模型穩(wěn)定觀察21 d，兩組大鼠均正常飼養(yǎng)。

2.2 腎陽(yáng)虛證大鼠模型造模方法

2.2. 1 腎陽(yáng)虛證大鼠模型

氫化可的松注射液充分混勻后，按照2.5 mg／100g比例于大鼠后肢肌肉注射，每日1次，正常飲食、飲水，連續(xù)15d。

2.3 大鼠模型鑒定及模型穩(wěn)定性觀察方法

2.3.1一般狀態(tài)觀察

觀察模型大鼠一般狀態(tài)、日?；顒?dòng)、精神狀態(tài)、反應(yīng)靈敏、弓背情況，毛發(fā)爪甲色澤，糞便質(zhì)地等方面并記錄大鼠體重與體溫的變化。

2.3.2大鼠血清中環(huán)核苷酸系統(tǒng)的變化檢測(cè)

造模結(jié)束時(shí)，取腎陽(yáng)虛及正常組大鼠，乙醚麻醉后，眶后靜脈叢進(jìn)行采血1-1.5 ml。4℃冰箱放置4 h后，2000 rpm離心10 min取上清，使用cAMP和cGMP ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中cAMP、cGMP含量。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書操作。

造模結(jié)束后21 d，腹主動(dòng)脈采血3~5 ml。具體檢測(cè)方法同造模結(jié)束時(shí)。

2.4 松質(zhì)骨標(biāo)本的獲取

造模結(jié)束后21 d，取腎陽(yáng)虛模型穩(wěn)定大鼠及正常大鼠，腹腔麻醉，放血處死，在冰上快速切取各組大鼠雙側(cè)股骨髁，對(duì)半剖開(kāi)股骨髁，刮匙刮取松質(zhì)骨，放入5 ml EP管，標(biāo)記后置于液氮罐中，快速轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱，備用。

實(shí)施例二：

差異蛋白的篩選，它包括以下步驟：

1.松質(zhì)骨總蛋白的提取

①將冰凍新鮮股骨干用骨剪剪開(kāi)，用超純水將骨髓沖洗干凈，并用刮匙將股骨干松質(zhì)骨輕輕刮入研缽（提前液氮預(yù)冷）中，往研缽中加入液氮并迅速研磨粉碎，重復(fù)研磨3～5次，取粉末并稱取質(zhì)量，然后按照1 g骨組織加1.8 mL裂解液的比例加入蛋白樣品裂解液，置于4℃冰箱裂解提取蛋白4 h（每隔1h充分混勻1次）；②將盛有骨組織混懸液的EP管置于低溫高速離心機(jī)中，4℃ 100000 rpm離心1 h，吸取上清液；③加核酸酶：每1 ml裂解液加入2 ul Dnase和2 ul Rnase，冰上放置15 min；④超聲：用超聲清洗儀超聲致液體不黏稠為止。然后置低溫高速離心機(jī)中，4℃ 100000 rpm離心30 min，吸取上清液；⑤2-D clean-up試劑盒提純濃縮蛋白。

2 Bradford法測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算上樣蛋白體積

參照Bio-Rad公司Bradford蛋白定量試劑盒操作說(shuō)明書操作，按照蛋白上樣總質(zhì)量為2500 ug計(jì)算所需蛋白樣本體積為：2500ug/蛋白濃度。

表3 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線上樣體系

3.雙向凝膠電泳

雙向電泳主要參照美國(guó)Bio-Rad公司的2-DE操作指南進(jìn)行操作。

3.1上樣量及電泳條件 吸?。?500ug/蛋白濃度）蛋白樣本與適量水化上樣緩沖液充分混合，總體積為380 ul。膠條在20℃，50 V低電壓條件下泡脹12 h后，進(jìn)行等電聚焦。泡脹和等電聚焦參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 IEF參數(shù)設(shè)置

3.2灌制12%的垂直板SDS-PAGE凝膠 按表5中配方比例配制凝膠溶液。

表5 12%SDS-PAGE凝膠配方

3.3膠條平衡 分別在膠條平衡緩沖液、中平衡潤(rùn)洗15分鐘，濾干并轉(zhuǎn)移至二向凝膠上。

3.4第二向SDS-PAGE凝膠電泳

設(shè)置循環(huán)水溫度10℃進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為：接通電源，起初以100 V的恒電壓40 min，后換用300 V恒電壓4.5 h進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)跑至距凝膠底部約1 cm處時(shí)停止電泳。

4.凝膠染色與掃描顯示

電泳結(jié)束后取出凝膠，并作好標(biāo)記?？捡R斯亮藍(lán)染色后用Image Scanner掃描儀獲取2-DE凝膠圖片。

5.凝膠蛋白點(diǎn)的檢測(cè)與差異蛋白點(diǎn)顯示分析

利用Bio-Rad公司提供的PD Quest 8.0分析軟件進(jìn)行骨組織（松質(zhì)骨）雙向電泳凝膠圖譜蛋白點(diǎn)檢測(cè)及差異蛋白點(diǎn)顯示分析。設(shè)置faint spot、small spot和large spot三個(gè)參數(shù)并去除背景及橫縱條紋等進(jìn)行蛋白點(diǎn)的自動(dòng)檢測(cè)。待檢測(cè)完畢后，設(shè)置點(diǎn)的匹配分析參數(shù)，以點(diǎn)的體積作為蛋白點(diǎn)含量的測(cè)量值，設(shè)定蛋白點(diǎn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化體積變化達(dá)1.5倍以上作為差異蛋白點(diǎn)的匹配分析的基本參數(shù)并設(shè)置t檢驗(yàn)達(dá)99%為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初步匹配完成后，進(jìn)行手動(dòng)人工校正，對(duì)每個(gè)匹配的蛋白點(diǎn)進(jìn)行放大觀察，以排除一些非真實(shí)的蛋白點(diǎn)。

6.質(zhì)譜樣品制備及差異蛋白的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析

將差異蛋白點(diǎn)手動(dòng)切膠，酶解，除鹽點(diǎn)樣后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)定性各組間松質(zhì)骨差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并通過(guò)生物信息學(xué)檢索對(duì)差異表達(dá)蛋白的功能進(jìn)行初步分析。

7.蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及鑒定

使用MASCOT（V3.2，Matrix Science，London，U.K）搜庫(kù)軟件對(duì)每個(gè)差異蛋白樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并鑒定蛋白質(zhì)。

8 蛋白質(zhì)相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索

在Uniprot及NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找質(zhì)譜鑒定得到的已知蛋白的相關(guān)信息，包括蛋白的基因名稱、蛋白家族、氨基酸序列、主要功能等。

實(shí)施例三：

Western Blot和RT-PCR技術(shù)從蛋白及基因水平雙重驗(yàn)證，它包括以下步驟：

1.各組大鼠股骨干松質(zhì)骨相關(guān)蛋白的Western Blot的檢測(cè)

1.1松質(zhì)骨總蛋白的提取

從﹣80℃冰柜中每組隨機(jī)抽取8只大鼠股骨干松質(zhì)骨取出，置于冰上，迅速用咬骨鉗將骨組織剪碎，放入事先預(yù)冷的研磨器中，迅速研磨至粉末狀，研磨過(guò)程中適時(shí)加入液氮冷卻，然后轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，稱取重量；按比例1 g骨組織加1 ml裂解液，微型渦旋器震蕩5 s，而后置于4 ℃冰箱，每隔30 min渦旋震蕩一次，4 h后取出；轉(zhuǎn)入低溫高速離心機(jī)中，設(shè)置程序4 ℃，14000 rpm，離心20 min，吸取上清液。

1.2 BCA法測(cè)定蛋白濃度

（1）配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶品（25 mg/ml）：將0.8 ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入20 mg 牛血清蛋白（BSA）完全溶解后，分裝備用；

（2）稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（0.5 mg/ml）：取適量配置好的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（25 mg/ml），用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將其稀釋至0.5 mg/ml濃度；

（3）配制BCA工作液：根據(jù)所需樣品的數(shù)量，將BCA試劑A液、B液按50:1比例，充分渦旋混勻；

（4）按0，1，2，4，8，12，16，20 μl將標(biāo)準(zhǔn)品（0.5 mg/ml）依次加到96孔板蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，每孔補(bǔ)足PBS緩沖液至20 μl；

（5）加適當(dāng)?shù)鞍讟悠?，用PBS緩沖液稀釋5倍、10倍、20倍，每孔補(bǔ)足至20 μl；

（6）各孔均加入200 μl BCA工作液；

（7）37 ℃孵育30 min；

（8）測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，讀取吸光度（OD）值；

（9）依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

1.3松質(zhì)骨總蛋白變性

取適量蛋白樣品按5:1比例和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（6×）渦旋混勻，置恒溫金屬浴100 ℃ 5 min，變性后迅速置于冰上冷卻，存于-80 ℃冰箱備用。

1.4溶液的配制

（1）裂解液 取適量RIPA裂解液和PMSF（l00 mM）按99:1比例混合均勻，使PMSF的最終濃度為1 mM，冰上保存待用。

（2）電泳液 將5×的電泳液用超純水稀釋5倍，配成1×的電泳液。

（3）10%過(guò)硫酸銨 0.1 g過(guò)硫酸銨加超純水定容至1 ml，完全溶解混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

（4）TBST洗滌液 將50 ml TBS（20×）和1 ml吐溫一起置于燒杯中混勻，用超純水定容至1 L，充分混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（5）BeyoECL Plus工作液 按1:1比例分別取適量BeyoECL Plus A液和B液混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用，操作時(shí)避光。

1.5 SDS-PAGE凝膠配制

按照表6依序加入相應(yīng)體積的凝膠試劑，室溫下凝固約20 min后，置于電泳液中存于4 ℃冰箱備用，一般提前一天配制SDS-PAGE凝膠。

表6 SDS-PAGE凝膠配制所需各成分體積（ml）

1.6上樣 根據(jù)BCA測(cè)定的樣品濃度，按每孔30 ug的加樣量計(jì)算出樣品所需上樣體積，依次將待測(cè)蛋白緩慢勻速加樣，并加入標(biāo)準(zhǔn)品Marker 4 ul。未上樣的邊緣孔加上SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（1×）10 ul。

1.7蛋白電泳 蓋上電極蓋，接通電源，初始以恒壓20 V跑10 min確保孔道中漂浮的蛋白下沉，再以恒壓60 V跑20 min，最后以80 V跑100 min，待溴酚藍(lán)染料到達(dá)膠的底部，停止電泳。

1.8半干轉(zhuǎn) 在恒定電壓25 V下根據(jù)膜面積設(shè)定電流，整塊膠限制電流1.3 A，1條膠時(shí)電流0.7 A。根據(jù)目的蛋白分子量調(diào)整轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)（見(jiàn)表7）；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膠置于考馬斯亮藍(lán)染液染中搖床過(guò)夜，第二天將其脫色至透明，檢查蛋白是否完全轉(zhuǎn)移。

表7目的蛋白轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)

1.9膜的封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用鑷子夾marker處，取出PVDF膜標(biāo)記好正面，用超純水漂洗5 min ×3次，將PVDF膜放入裝有5 ml封閉液的自封袋中，置于室溫，水平搖床孵育2 h。

1.10一抗孵育 根據(jù)說(shuō)明書見(jiàn)表8的一抗稀釋倍數(shù)，用WB一抗稀釋液稀釋一抗，稀釋后總體積約為5 ml，將封閉后的PVDF膜置于含有一抗工作液的自封袋中，在水平搖床上4℃孵育過(guò)夜。

表8 抗體稀釋倍數(shù)

1.11二抗孵育 一抗孵育結(jié)束后，將膜放入裝有TBST的洗膜盒中，在室溫下水平搖床上漂洗5 min×3次；洗膜結(jié)束后，根據(jù)一抗來(lái)源配制相應(yīng)二抗工作液，將膜置于二抗工作液中，在水平搖床上緩慢搖動(dòng)、室溫孵育1 h。

1.12ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 二抗孵育結(jié)束后用TBST漂洗濾膜5 min×3次，洗去未結(jié)合的二抗。避光配制BeyoECL Plus工作液（A液：B液=1：1），充分混勻，在化學(xué)發(fā)光成像儀上將膜覆于顯影墊片上，用濾紙將多余液體吸干，用滾軸去除膜下氣泡，將顯影液均勻滴于膜上，在室溫中待膜與之反應(yīng)1 min后顯影。

1.13定量分析 采用Bio-Rad image lab 3.0軟件分析蛋白條帶，計(jì)算各組目的蛋白與相應(yīng)β-actin蛋白顯色積分的光密度比值，即各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.各組大鼠股骨干松質(zhì)骨相關(guān)蛋白的基因檢測(cè)

2.1骨組織處理 骨組織研磨至粉末狀過(guò)程同蛋白提取，迅速用1.5 ml無(wú)RNA酶Eppendorf管（以下Eppendorf管均為無(wú)RNA酶）沿缽底將骨粉摳出，稱取約100 mg。

2.2用Trizol法提取總RNA

2.3總RNA濃度檢測(cè) 在超微量核酸蛋白測(cè)定儀主畫面點(diǎn)選Nucleic Acid，調(diào)零后，加1 μl待測(cè)樣品于偵測(cè)臺(tái)上，測(cè)定260/280 nm的吸光度比值，得出所提取RNA的濃度。

2.4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Reverse Transcription，RT） 根據(jù)以上所測(cè)得總核糖核酸的濃度，計(jì)算出2 μg 總核糖核酸所需的上樣體積V_RNA，按表9體系配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；于42 ℃下反應(yīng)2 min。設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄步驟：25℃ 10min，50℃下反應(yīng)30min，85℃滅火5min，靜置于4℃下。

表9逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2.5引物的設(shè)計(jì)與合成

本實(shí)驗(yàn)所用目的基因引物、GAPDH RT-PCR引物合成均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成（表10）。

表 10 實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物列表

2.6聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction PCR） 嚴(yán)格按照PCR試劑盒說(shuō)明書操作，將以上反應(yīng)得到的cDNA用來(lái)配制PCR擴(kuò)增體系（表11）。

表11 PCR擴(kuò)增體系

注：2×AceTaqMaster Mix中包含Taq^TMDNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs、反應(yīng)緩沖液

將配制好的反應(yīng)體系混勻離心后放入基因擴(kuò)增儀中，按以下反應(yīng)條件設(shè)置反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，退火30s（各體系退火溫度為所加引物的退火溫度），72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃下保存。

2.7瓊脂糖凝膠電泳 取PCR產(chǎn)物各3 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90 V，15 min；電泳后染色并采用GEL DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)Quantity One 465軟件分析圖像，得到相應(yīng)蛋白表達(dá)的光密度值與對(duì)應(yīng)內(nèi)參照基因（GAPDH）光密度值的比值。

實(shí)施例四：

ELISA測(cè)定相關(guān)蛋白在正常與腎陽(yáng)虛大鼠的血液中含量，包括以下步驟：

1.各組大鼠血清的制備

各組大鼠血清制備，同造模結(jié)束后21 d。見(jiàn)實(shí)施例一2.3.2。

2.各組大鼠血清中相關(guān)蛋白含量的檢測(cè)

2.1.ELISA法主要試劑的配制：按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

2.2.ELISA檢測(cè)方法

（1）加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻；

（2）溫育：用封板膜封板后置溫育箱靜置37 ℃ 40 min；

（3）洗板：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，向?yàn)V紙上印干；

（4）加酶：每孔均加入酶標(biāo)試劑50 μl，除空白孔外；

（5）溫育：方法同（2）；

（6）洗板：方法同（3）；

（7）顯色：每孔均先后加入顯色A、顯色B各50 μl，輕輕震蕩混勻，靜置于溫箱37 ℃ 避光孵育，顯色15 min；

（8）終止：每孔均加入終止液50 μl，此時(shí)顏色轉(zhuǎn)變由藍(lán)轉(zhuǎn)黃，終止反應(yīng)；

（9）測(cè)定：以空白調(diào)零，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm，讀取吸光度值。應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)完成。

實(shí)施例五：

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證，將血清蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果與Western-Blot、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析，選取表達(dá)趨勢(shì)一致且在正常值范圍之外的差異蛋白差異蛋白作為腎陽(yáng)虛證生物標(biāo)志物。

上述試驗(yàn)可得如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.動(dòng)物模型的建立及鑒定結(jié)果

造模結(jié)束后21d內(nèi)，腎陽(yáng)虛組3只大鼠由于體質(zhì)過(guò)于虛弱，采食及飲水量不足等因素，耗竭而亡。所以最后正常組數(shù)量不變，腎陽(yáng)虛組余17只。造模結(jié)束后21d，與正常組大鼠比較，腎陽(yáng)虛組大鼠依舊耳廓爪甲無(wú)血色，喜弓背蜷曲、扎堆，活動(dòng)量少，便溏，體重減輕，體溫降低，血清cAMP含量及cAMP/cGMP比值均下降。以上癥狀、體征和血清cAMP及cAMP/cGMP比值結(jié)果均符合腎陽(yáng)虛證模型的鑒定要求，提示本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模是成功的。

2.差異蛋白篩選結(jié)果

2.1凝膠蛋白點(diǎn)差異的辨識(shí)與分析

2.1.1凝膠蛋白點(diǎn)的檢測(cè) 通過(guò)Bio-Rad公司PDQuest軟件分析，各凝膠蛋白圖譜可辨識(shí)的蛋白點(diǎn)均為560個(gè)。

2.1.2凝膠蛋白點(diǎn)差異的辨識(shí)與分析 通過(guò)對(duì)正常組與腎陽(yáng)虛組骨組織（松質(zhì)骨）蛋白質(zhì)組雙向電泳凝膠圖譜比較分析，檢測(cè)到29個(gè)明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，以正常組為參考，標(biāo)記出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，點(diǎn)3、7均為下調(diào)表達(dá)蛋白（見(jiàn)圖1）。

2.2差異蛋白的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定

將29個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上手工切下，經(jīng)胰蛋白酶酶解消化后進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜信號(hào)強(qiáng)且基線較平穩(wěn)，噪音低，適于進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。以下列舉部分肽段的MS和MS/MS質(zhì)譜圖信息（見(jiàn)圖2，3），使用MASCOT搜庫(kù)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，表12為質(zhì)譜鑒定的部分蛋白點(diǎn)相關(guān)信息，包括蛋白質(zhì)的登記編碼、種類、等電點(diǎn)、分子量、得分。

表12 部分差異蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

2.3差異蛋白相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索

將質(zhì)譜鑒定確立的差異蛋白質(zhì)名稱輸入U(xiǎn)niProt及NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索，結(jié)果詳見(jiàn)表13。借助String數(shù)據(jù)庫(kù)檢索提供的生物學(xué)信息提示，同時(shí)我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合研究結(jié)果，我們推測(cè)腎陽(yáng)虛證癥狀體征的改變可能與GDP解離抑制因子1、Ⅰ型膠原α-1鏈有關(guān)。

表13 部分蛋白質(zhì)相關(guān)功能的生物信息學(xué)檢索結(jié)果

3.正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠股骨松質(zhì)骨中Colla1和Arhgdia蛋白表達(dá)的檢測(cè)

3.1 Western bolt檢測(cè)顯示：與正常組比較，腎陽(yáng)虛組Colla1表達(dá)降低，有顯著性差異（P＜0.05）；與正常組比較，腎陽(yáng)虛組Arhgdia表達(dá)降低，有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表14，圖4。

表14兩組大鼠松質(zhì)骨中Col1a1和Arhgdia蛋白表達(dá)的比較（±S）

注：與正常組比較，a P＜0.05。

3.2 正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠股骨干松質(zhì)骨Col1a1和Arhgdia mRNA表達(dá)的檢測(cè)

兩組均可見(jiàn)Colla1的mRNA的表達(dá)。與正常組比較，腎陽(yáng)虛組大鼠Colla1表達(dá)下降，有顯著性差異(P＜0.05)；與正常組比較，腎陽(yáng)虛大鼠Arhgdia表達(dá)下降，有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表15，圖5、6。

表15 兩組大鼠松質(zhì)骨中Col1a1和Arhgdia mRNA表達(dá)的比較（±S）

注：與正常組比較，a P＜0.05。

3.3 正常組-腎陽(yáng)虛組大鼠血清中Col1a1和Arhgdia含量的檢測(cè)

ELISA方法檢測(cè)正常組及腎陽(yáng)虛組大鼠血清中Colla1含量測(cè)定情況顯示：兩組均可檢測(cè)定出Colla1的表達(dá)。與正常組比較，腎陽(yáng)虛大鼠Colla1表達(dá)下降，有顯著性差異(P＜0.05) ；與正常組比較，腎陽(yáng)虛大鼠Arhgdia表達(dá)下降，有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表16，圖7。

表16 兩組大鼠血液中Col1a1和Arhgdia 蛋白表達(dá)的比較（±S）

注：與正常組比較，a P＜0.05。

3.4 正常組大鼠血清中Col1a1、Arhgdia含量的參考值范圍

根據(jù)正常組中三個(gè)蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果，我們計(jì)算出參考值范圍。見(jiàn)表17。

表17 大鼠血液中Col1a1、Arhgdia的含量的參考值范圍（pmol?mL^-1）

4. 初步篩選確認(rèn)可用作腎陽(yáng)虛證標(biāo)志物的蛋白。

經(jīng)過(guò)Western blot和RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明：在腎陽(yáng)虛及正常組大鼠松質(zhì)骨骨組織中，Colla1、Arhgdia在蛋白及基因水平表達(dá)趨勢(shì)均與前期蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，表現(xiàn)為：腎陽(yáng)虛組中Colla1、Arhgdia呈顯著性低表達(dá)。表明前期研究結(jié)果的準(zhǔn)確性可靠性，可作為腎陽(yáng)虛證在骨組織中的生物標(biāo)志物。

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在外周血中Colla1及Arhgdia與股骨干松質(zhì)骨中蛋白表達(dá)一致，與正常組比較有顯著性差異，含量均低于正常參考值范圍，提示Colla1及Arhgdia下降可能與腎陽(yáng)虛證密切相關(guān)，可以作為腎陽(yáng)虛證診斷的血液潛在標(biāo)志物。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的蛋白篩選及確定，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建中醫(yī)藥大學(xué)

<120> 一種腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型生物標(biāo)志物的篩選及確定方法

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