專利名稱：羽衣甘藍(lán)DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物基因片段、RNAi載體、RNAi載體的構(gòu)建方法，以及RNAi載體在植物育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
羽衣甘藍(lán)為二年生草本植物，是食用甘藍(lán)(卷心菜、包菜)的園藝變種，其葉色豐富多變，葉形也不盡相同，整個(gè)植株形如牡丹，因此又被形象地稱為“葉牡丹”，是盆栽觀葉的佳品。株型是植物重要的農(nóng)藝性狀。微型化作為觀賞植物株型的重要方面，已顯示出良 好的市場(chǎng)前景。例如，現(xiàn)代月季中的一個(gè)特殊品種——微型月季，因其株型矮小緊湊，葉片、花朵小巧可愛(ài)，不占空間，擺放位置選擇性更大等優(yōu)點(diǎn)，深受人們喜愛(ài)，目前已成為國(guó)際花卉市場(chǎng)上最受歡迎的盆栽花卉之一。因此，培育株型微型化的羽衣甘藍(lán)品種，預(yù)計(jì)在未來(lái)的市場(chǎng)中也可以取得不錯(cuò)的成績(jī)。雖然傳統(tǒng)育種在以往改良植物性狀的過(guò)程中做出了巨大的貢獻(xiàn)，但傳統(tǒng)育種費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來(lái)，隨著基因工程的迅速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日益完善，基因工程育種已成為植物育種領(lǐng)域的一個(gè)重要分支。文獻(xiàn)報(bào)道，番茄品種Micro-Tom的株型微型化，整個(gè)植株與普通番茄品種相比整體等比例縮小，其株型表現(xiàn)主要由兩個(gè)隱性突變基因和
決定，其中基因編碼油菜素內(nèi)酯(調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素)合成途徑中的關(guān)鍵酶BR-6-氧化酶，SELF-PRUNING基因主要控制莖頂端分生組織的發(fā)育潛力，與花序轉(zhuǎn)化有關(guān)。文獻(xiàn)還報(bào)道，赤霉素也是對(duì)植物莖桿伸長(zhǎng)起重要調(diào)控作用的激素，而GA20ox是其合成途徑的關(guān)鍵酶。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于克隆羽衣甘藍(lán)和三基因片段，目的之二在于提供一種羽衣甘藍(lán)洲和GA20ox三基因RNAi載體，目的之三在于提供所述羽衣甘藍(lán)和三基因RNAi載體的構(gòu)建方法，目的之四在于提供含有所述羽衣甘藍(lán)洲和三基因RNAi載體的微生物轉(zhuǎn)化體，目的之五在于提供所述羽衣甘藍(lán)和三基因RNAi載體在羽衣甘藍(lán)植株育種中的應(yīng)用，目的之六在于提供利用所述羽衣甘藍(lán)5P和GA20ox三基因RNAi載體進(jìn)行羽衣甘藍(lán)植株育種的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案1.羽衣甘藍(lán)基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1中第I位至第936位所示。2.羽衣甘藍(lán)5Ρ基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。3.羽衣甘藍(lán)GA20ox基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。4.羽衣甘藍(lán)洲SP和GA20ox三基因RNAi載體，其含有一個(gè)hpRNA表達(dá)盒，所述hpRNA表達(dá)盒包括順序連接的啟動(dòng)子、洲三基因拼接片段的正向片段、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的反向片段和終止子.^DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括基因片段或其互補(bǔ)片段、5P基因片段或其互補(bǔ)片段、以及基因片段或其互補(bǔ)片段，所述例從F基因片段的核苷酸序列 如SEQ ID No.1中第I位至第936位所示，5P基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，GA20ox基因片段的核苷酸序列如SEQID No. 3 所示。進(jìn)一步，所述hpRNA表達(dá)盒包括順序連接的CaMV35S啟動(dòng)子、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的正向片段、PDK內(nèi)含子、洲三基因拼接片段的反向片段和Ocs終止子DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括順序連接的洲基因片段的正向片段、5P基因片段的正向片段、以及基因片段的反向互補(bǔ)片段。進(jìn)一步，所述羽衣甘藍(lán)洲SP和GA20OX三基因RNAi載體是以pBIN19載體為骨架，所述hpRNA表達(dá)盒插入pBIN19載體的多克隆位點(diǎn)中，DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。5.羽衣甘藍(lán)GA20ox三基因RNAi載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟
a.羽衣甘藍(lán)和三基因片段的克隆以羽衣甘藍(lán)幼葉總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以所得cDNA為模板，分別以BoDF-F和BoDF-R、BoSP-F和BoSP-R、BoGA20ox-F和BoGA20ox-R為引物，PCR擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因片段、核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的5P基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的GA20ox基因片段；所述引物BoDF-F和BoDF-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQID No. 6所示，BoSP-F和BoSP-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示，BoGA20ox-F和BoGA20ox-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示；然后，將PCR擴(kuò)增所得的基因片段和5P基因片段分別與pMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18-T 和 SP: :pMD18_T，另將 PCR 擴(kuò)增所得的 GA20ox 基因片段與 pGEM_T Easy 載體連接，獲得重組質(zhì)粒GA20ox: :pGEM-T Easy ；
b.羽衣甘藍(lán)洲5P和GA20ox三基因片段的拼接將重組質(zhì)粒DWARF::pMD18_T用通ol和feoRI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18_T線性片段，另將重組質(zhì)粒SP: :pMD18-T用Sal\和&0RI雙酶切，回收純化5P基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18-T線性片段與5P基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18_T ;然后，將重組質(zhì)粒SP/DF: : ]\ 18-1'用油<31和&oRI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18_T線性片段，另將重組質(zhì)粒GA20ox: :pGEM-T Easy用5^1和&oRI雙酶切，回收純化GA20ox基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18-T線性片段與GA20ox基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒 SP/DF/GA20ox::pMD18_T ；
c.羽衣甘藍(lán)Λ^υ/^和三基因RNAi載體的構(gòu)建以重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox::pMD 18-T為模板，以DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)為引物，PCR擴(kuò)增兩側(cè)帶酶切位點(diǎn)的洲三基因拼接片段；所述引物DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示；將純化的PCR產(chǎn)物用油al和雙酶切，回收純化訓(xùn)三基因拼接片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的pHANNIBAL載體連接，獲得重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox: :pHANNIBAL ;另將純化的PCR產(chǎn)物用Kpnl和&oRI雙酶切，回收純化洲三基因拼接片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox::pHANNIBAL連接，獲得含有hpRNA表達(dá)盒的重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL ;然后，將重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL用5^1和5^1雙酶切，回收純化hpRNA表達(dá)盒，另將植物表達(dá)載體PBIN19用油al和feci雙酶切，回收純化載體pBIN19線性片段，再將純化的載體PBIN19線性片段與hpRNA表達(dá)盒連接，獲得重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1::PBIN19,即羽衣甘藍(lán)GA20ox三基因RNAi載體。6.含有羽衣甘藍(lán)DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體的微生物轉(zhuǎn)化體。進(jìn)一步，所述微生物為農(nóng)桿菌。7.羽衣甘藍(lán)GA20ox三基因RNAi載體在微型化羽衣甘藍(lán)植株育種中的應(yīng)用。8.利用羽衣甘藍(lán)Λ^υ/^和 GA20ox三基因RNAi載體獲得微型化羽衣甘藍(lán)植株的方法，包括以下步驟
a.羽衣甘藍(lán)外植體的制備將羽衣甘藍(lán)種子消毒后，播種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、pH為5. 8的1/2MS固體培養(yǎng)基上，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001χ條件下培養(yǎng)；將生長(zhǎng)7-10天的帯柄子葉切下，接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和lmg/L 2，4_D、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，制得羽衣甘藍(lán)外植體；
b.農(nóng)桿菌工程菌液的制備將含有羽衣甘藍(lán)洲5P和GA20ox三基因RNAi載體的農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 2%的瓊脂、50mg/L利福平(Rif)、500mg/L鏈霉素(Str)和50mg/L卡那霉素(Kan)、pH為7. 2的YEB固體培養(yǎng)基上，28±2°C黑暗條件下活化2-3天至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落,用含有50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/L Kan、pH為
7.2的YEB液體培養(yǎng)基20mL，在28±2°C、200rpm條件下擴(kuò)大培養(yǎng)1. 5天，再將所得菌液按體積比為 1:100 接入含有 50mg/L Rif、500mg/L Str 和 50mg/L Kan、pH 為 7· 2 的 YEB 液體培養(yǎng)基中，在28±2°C、200rpm條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6tltl=L 8-2. 0，然后28 ±2°C離心棄上清，菌體用新鮮的YEB液體培養(yǎng)基洗滌，再用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、pH為5. 8的MS鹽溶液IOOmL重懸，制得農(nóng)桿菌工程菌液；
c.農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化將步驟a制得的羽衣甘藍(lán)外植體置步驟b制得的農(nóng)桿菌工程菌液中浸染15分鐘后，接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4-D、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，25±2°C黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)，再轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、4mg/L 6_BA、2mg/L玉米素(ZT)、5mg/L硝酸銀、500mg/L羧芐青霉素(Carb)和20mg/L Kan、pH為5· 8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001x條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出綠色愈傷組織及抗性芽；將長(zhǎng)2-3cm的抗性芽切下，轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、
O.2mg/L 萘乙酸(NAA)、250mg/L Carb 和 5mg/L Kan、pH 為 5· 8 的 1/2MS 固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001x條件下培養(yǎng)至生根，即得轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株;
d.轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得通過(guò)PCR檢測(cè)羽衣甘藍(lán)洲和三基因RNAi載體中含有的報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)，以及qPCR檢測(cè)和GA20ox三基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)，從步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，即獲得微型化羽衣甘藍(lán)植株。
進(jìn)一步，所述步驟a中羽衣甘藍(lán)品種為京蓮紅I號(hào)。進(jìn)一步，所述羽衣甘藍(lán)洲SP和GA20ox三基因RNAi載體中含有NPTII報(bào)告基因，所述步驟d通過(guò)PCR檢測(cè)NPTII報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)以及qPCR檢測(cè)Λ / 八5Ρ和GA20ox三基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)來(lái)篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；所述PCR檢測(cè)方法是分別取步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株和非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株，提取基因組DNA，再以所得基因組DNA為模板、NPTI1-F和NPTI1-R為引物進(jìn)行PCR，所述引物NPTI1-F和NPTI1-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示；所述qPCR檢測(cè)方法是分別取步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株和非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株，提取總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以所得cDNA為模板，分別以特異性引物qBoDWARF_F和qBoDWARF-R、qBoSP-F 和 qBoSP-R、qBoGA20ox_F 和 qBoGA20ox_R、內(nèi)參引物 qBoactin-F 和qBoactin-R進(jìn)行qPCR，所述引物qBoDWARF_F和qB oDWARF-R的核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 15和SEQ ID No. 16所示，qBoSP-F和qBoSP-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18 所示，qBoGA20ox_F 和 qBoGA20ox_R 的核苷酸序列分別如 SEQ ID No. 19 和SEQ ID No. 20 所示，qBoactin-F 和 qBoactin-R 的核苷酸序列分別如 SEQ ID No. 21 和 SEQID No. 22 所示。本發(fā)明中所述1/2MS培養(yǎng)基為除蔗糖外其他組分濃度減少至原濃度1/2的MS培養(yǎng)基；所述MS鹽溶液為不含有機(jī)物成分的MS液體培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果在于
(I)本發(fā)明首次通過(guò)基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)出株型微型化的植物新品種，通過(guò)植物基因轉(zhuǎn)化，目的明確、高效并可穩(wěn)定遺傳地改變了植物株型，避免了費(fèi)時(shí)費(fèi)力、通過(guò)噴施相應(yīng)植物激素、改變植株耕作時(shí)間及扦插方式來(lái)獲得不可穩(wěn)定遺傳的矮化植物株型的傳統(tǒng)育種方法，為觀賞植物的品種改良作出了積極的探索。(2)本發(fā)明利用物種進(jìn)化同源性，克隆得到羽衣甘藍(lán)例和三基因片段，基于上述三基因片段構(gòu)建了羽衣甘藍(lán)洲5P和GA20ox三基因共沉默的RNAi載體，并將該RNAi載體轉(zhuǎn)入羽衣甘藍(lán)，獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中和GA20ox三基因的表達(dá)均較非轉(zhuǎn)基因植株顯著降低，其株系為微型化表型，從而通過(guò)例和三基因共沉默獲得了微型化羽衣甘藍(lán)新品種。本發(fā)明提供的羽衣甘藍(lán)和GA20ox三基因片段，羽衣甘藍(lán)訓(xùn)⑷^、#和GA20ox三基因RNAi載體及其構(gòu)建方法，羽衣甘藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，利用羽衣甘藍(lán)洲SP和GA20ox三基因RNAi載體獲得微型化羽衣甘藍(lán)植株的方法都具有良好的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)為其他植物的微型化育種提供了參考和借鑒。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。圖1為本發(fā)明流程示意圖。圖2為羽衣甘藍(lán)八5P 二基因擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Maker)，I為基因擴(kuò)增片段，2為SP基因擴(kuò)增片段。圖3為羽衣甘藍(lán)基因擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為Maker，I和2為GA20OX基因擴(kuò)增片段。圖4為重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18_T構(gòu)建示意圖。圖5為重組質(zhì)粒SP: :pMD18-T構(gòu)建示意圖。圖6為重組質(zhì)粒GA20ox: :pGEM_T Easy構(gòu)建示意圖。圖1為重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18-T構(gòu)建示意圖。圖8為重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox: :pMD18_T構(gòu)建示意圖。圖9為重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox: :pHANNIBAL構(gòu)建示意圖。圖10 為重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: : pHANNIBAL 構(gòu)建示意圖。 圖11為重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19構(gòu)建示意圖。圖12為&oRI和油al雙酶切重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中對(duì)照為重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19，l和2為酶切產(chǎn)物，M為Maker。圖13為共培養(yǎng)后的羽衣甘藍(lán)外植體在抗性篩選誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基中長(zhǎng)出綠色愈傷組織。圖14為抗性芽的分化。圖15為轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株。圖16為PCR檢測(cè)NPTII報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)，其中M為Maker, NT為無(wú)模板空白對(duì)照，CK-為陰性對(duì)照，CK+為陽(yáng)性對(duì)照，1-6為轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株。圖17為DWARF、SP和GA20ox三基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株中的沉默效果鑒定，其中I和2為轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株，WT為非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株。圖18為轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株的表型，其中Tl為轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株，WT為非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株。圖19為轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株的生長(zhǎng)過(guò)程表型，其中I和2為轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株，WT為非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實(shí)施例中使用的羽衣甘藍(lán)品種為京蓮紅I號(hào)。pMD18-T載體為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，pGEM-T Easy載體為Promega公司產(chǎn)品，pHANNIBAL載體、pBIN19載體、大腸桿菌DH5a、含有游動(dòng)質(zhì)粒Prk2013的大腸桿菌“協(xié)助”菌(helper)、根癌農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNA提取試劑盒、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O試劑盒、DNA提取試劑盒UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver. 3.0、連接試劑盒 DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (T4 DNA連接酶/Solution〗)、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTARHS DNA聚合酶為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。本發(fā)明的流程示意圖如圖1所示。
一、羽衣甘藍(lán)洲辦八^^和GA20ox三基因片段的克隆
根據(jù)番爺例級(jí)/ /7基因序列(GenBank登錄號(hào)U54770),在TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://compbio.dfc1.harvard.edu/cg1-bin/tgi/Blast/index.cgi)中 BLAST 得到擬南芥和油菜(羽衣甘藍(lán))數(shù)據(jù)庫(kù)中最同源的基因序列，在這兩個(gè)物種的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物BoDF-F和BoDF-R ;根據(jù)番茄5P基因序列(GenBank登錄號(hào)U84140)，在TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST得到擬南芥和油菜(羽衣甘藍(lán))數(shù)據(jù)庫(kù)中最同源的基因序列，在這兩個(gè)物種的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物BoSP-F和BoSP-R ;根據(jù)擬南芥GA20ox基因序列(GenBank登錄號(hào)X83379)，在TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST得到油菜(羽衣甘藍(lán))數(shù)據(jù)庫(kù)中最同源的基因序列，在這兩個(gè)物種的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物BoGA20ox_F和BoGA20ox_R ;引物序列如下
BoDF-F :5’-ATCGCTGCGGTTCACGG-3’ (SEQ ID No. 5)；
BoDF-R :5’-CTCCCATTTGTATCTCGTA-3’ (SEQ ID No. 6)； BoSP-F :5’-CCCAAAGCAGAACTAAAGC-3’ (SEQ ID No. 7)；
BoSP-R :5’-TGATCTCATGTCACCCC-3’ (SEQ ID No. 8)；
BoGA20ox-F :5’-GGTCAATCACGGCATCAG-3’ (SEQ ID No. 9)；
BoGA20ox-R :5’-TCGGTGGCGTCACTACTC-3’ (SEQ ID No. 10)。以羽衣甘藍(lán)(京蓮紅I號(hào))幼葉總RNA為模板，根據(jù)RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O試劑盒說(shuō)明書(shū)，以oligodT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以所得cDNA為模板，分別以BoDF-F和BoDF-R,BoSP-F 和 BoSP-R、BoGA20ox_F 和 BoGA20ox_R 為引物，PCR 擴(kuò)增羽衣甘藍(lán)
和三基因片段。PCR 反應(yīng)體系為ddH20 16. 5μ LUOXPCR Buffer 2· 5 μ L、MgCl2
2· 5 μ L、dNTP (10 μ Μ)1. O μ L、上下游引物各 O. 5 μ L、cDNA 模板1. O μ L、Taq DNA 聚合酶
O.5 μ L，共25 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸I分鐘(以BoSP-F和BoSP-R為引物時(shí)為72°C延伸30秒，以BoGA20ox_F和BoGA20ox-R為引物時(shí)為72°C延伸50秒)，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖2-3)后，采用超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將純化的羽衣甘藍(lán)基因片段和5P基因片段分別與pMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18-T和SP: :pMD18_T(圖4_5);將純化的羽衣甘藍(lán)GA20ox基因片段與pGEM-T Easy載體連接，獲得重組質(zhì)粒GA20ox: :pGEM-T Easy (圖6)。將上述三種重組質(zhì)粒委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，分別獲得974bp的羽衣甘藍(lán)洲基因片段(SEQ ID No. l)、336bp的羽衣甘藍(lán)5P基因片段(SEQ IDNo. 2)和710bp的羽衣甘藍(lán)GA20ox基因片段(SEQ ID No. 3)。二、羽衣甘藍(lán)洲辦八^^和GA20ox三基因片段的拼接
將重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18-T用沿ol和&oRI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒DWARF::PMD18-T線性片段；另將重組質(zhì)粒SP: :pMD18-T用Sal\和&oRI雙酶切，回收純化5P基因片段；再將純化的重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18-T線性片段與5P基因片段在T4 DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18-T(圖7)。然后，將重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18_T用油al和&oRI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18-T線性片段；另將重組質(zhì)粒GA20ox::pGEM-T Easy用分el和&0RI雙酶切，回收純化GA20ox基因片段；再將純化的重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18-T線性片段與GA20ox基因片段在T4 DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox: :pMD18-T(圖 8)。將重組質(zhì)粒 SP/DF/GA20ox: :pMD18_T 委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得1997bp的洲三基因拼接片段(SEQID No. 4)，其中包括順序連接的936bp的羽衣甘藍(lán)基因片段(SEQ ID No.1中第I位至第936位核苷酸)的正向片段、336bp的羽衣甘藍(lán)5Ρ基因片段(SEQ ID No. 2)的正向片段、以及710bp的羽衣甘藍(lán)基因片段(SEQ ID No. 3)的反向互補(bǔ)片段。上述步驟中，酶切體系為ddH20 23 yL、重組質(zhì)粒20yL、限制性內(nèi)切酶各lyL、IOXBuffer 5 μ L，共50 μ L ;連接體系為T(mén)4 DNA連接酶(Solution〗)5 μ L、目標(biāo)基因片段
4.5 μ L、重組質(zhì)粒線性片段0.5 μ L，共10 μ L。三、羽衣甘藍(lán)DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體的構(gòu)建
根據(jù)pHANNIBAL載體的多克隆位點(diǎn)和所得洲三基因拼接片段序列，設(shè) 計(jì)如下引物
DWARF (F+EX) :5’ -CCGGAATTCTCTAGAATCGCTGCGGTTCACGG-3’ (SEQ ID No. 11)，下劃線部分為油al酶切位點(diǎn)，黑體部分為feoRI酶切位點(diǎn)；
GA20OX (F+KB) :5’-CGGGGTACCGGATCCGGTCAATCACGGCATCAG-3’ (SEQ ID No. 12)，下劃線部分為Bamm酶切位點(diǎn)，黑體部分為Kpnl酶切位點(diǎn)。以重組質(zhì)粒 SP/DF/GA20ox: : pMD18_T 為模板，以 DWARF (F+EX)和 GA20ox (F+KB)為引物，PCR擴(kuò)增兩側(cè)帶酶切位點(diǎn)的麗三基因拼接片段。PCR體系為ddH2016 μ LUO XPrimeSTARBuffer (含 MgCl2) 2. 5 μ L、dNTP (2. 5 μ M) 4.0yL、上下游引物各
O.5 μ L、質(zhì)粒模板1. O μ L、PrimeSTARHS DNA 聚合酶 O. 5 μ L，共 25 μ L。PCR 循環(huán)參數(shù)為98°C變性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸2分鐘，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將純化的PCR產(chǎn)物用Xba I和Bamm雙酶切，回收純化DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的pHANNIBAL載體在T4 DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox: : pHANNIBAL (圖9)。另將純化的PCR產(chǎn)物用Kpn I和&oRI雙酶切，回收純化洲三基因拼接片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox: : pHANNIBAL在T4 DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)i pHANNIBAL (圖10)，即將DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段分別正向和反向插入pHANNIBAL載體中TOK內(nèi)含子的兩側(cè)，以形成hpRNA表達(dá)盒“35S pro-fDWARF/SP/GA20ox-pdk-rDWARF/SP/ GA20ox-0cs ter”。然后，將重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL用5^1和5^1雙酶切，回收純化上述hpRNA表達(dá)盒，另將植物表達(dá)載體PBIN19用油a I和feci雙酶切，回收純化載體PBIN19線性片段，再將純化的載體PBIN19線性片段與hpRNA表達(dá)盒在T4 DNA連接酶作用下連接，獲得重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19 (圖11)，即羽衣甘藍(lán)洲^^產(chǎn)和GA20ox三基因RNAi載體。將重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑及Kan篩選陽(yáng)性克隆，用載體引物進(jìn)行單菌落PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，用載體引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，并用^0RI和油al進(jìn)行雙酶切檢測(cè)。酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19 酶切后出現(xiàn) 12491bp、4821bp 和 1383bp 共 3 條電泳條帶，與理論結(jié)果相符合(圖12)。四、羽衣甘藍(lán)DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將根癌農(nóng)桿菌LBA4404在含有1. 2%(w/w)瓊脂、50mg/L Rif和500mg/L Str的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28 ±2 °C黑暗條件下培養(yǎng)2-2. 5天至長(zhǎng)出單菌落；分別將含有重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19的大腸桿菌DH5 α和含有游動(dòng)質(zhì)粒Prk2013的大腸桿菌helper在含有50mg/L Kan的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37±2°C條件下倒置培養(yǎng)14-16小時(shí)至長(zhǎng)出單菌落；將根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落、大腸桿菌helper單菌落和含有重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)i PBIN19的大腸桿菌DH5 α單菌落依次重疊均勻涂在含有1. 2%(w/w)瓊脂的YEB固體培養(yǎng)基(PH7. 2)中央直徑為Icm的圓圈中，28±2°C黑暗條件下倒置共培養(yǎng)24小時(shí)至長(zhǎng)出菌團(tuán)，用接種環(huán)挑取菌團(tuán)適量，在含有1.2%(W/W)瓊脂、50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/LKan的YEB固體培養(yǎng)基(pH7. 2)中劃線，28 ±2°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)2-2. 5天至長(zhǎng)出單菌落，挑取3-4個(gè)單菌落，用含有50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基(pH7. 2)，在28±2°C、黑暗、200rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)1. 5天至菌液均勻且OD6tltl=L 8-2. 0，提取重組質(zhì)粒，用&oRI和油a I進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組子即為(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19農(nóng)桿菌工程菌株，_80°C凍存?zhèn)溆谩?
五、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體轉(zhuǎn)化羽衣甘藍(lán)
將羽衣甘藍(lán)(京蓮紅I號(hào))種子用70%(v/v)乙醇溶液浸泡I分鐘，無(wú)菌水沖洗3次，再用1% (v/v)次氯酸鈉溶液反復(fù)沖洗12-15分鐘，無(wú)菌水沖洗8次，播種于含有3%(w/w)蔗糖和O. 8%(w/w)瓊脂的1/2MS固體培養(yǎng)基(pH5. 8)上，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001x條件下培養(yǎng)；將生長(zhǎng)7-10天完全展開(kāi)(未長(zhǎng)出真葉)的帯柄子葉切下，接入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)瓊脂、lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基，pH5. 8)中，在25±2°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，制得羽衣甘藍(lán)外植體。將(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有1. 2%(w/w)瓊脂、50mg/L Rif、500mg/L Str和50mg/L Kan的YEB固體培養(yǎng)基(ρΗ7· 2)上，28±2°C黑暗條件下活化2-3天至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落,用含有50mg/L Rif >500mg/L Str和50mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基(PH7. 2) 20mL，在28±2°C、200rpm條件下擴(kuò)大培養(yǎng)1. 5天，再取培養(yǎng)菌液lmL，加入含有 50mg/L Rif、500mg/L Str 和 50mg/L Kan 的 YEB 液體培養(yǎng)基(ρΗ7· 2) lOOmL，在28±2°C、200rpm 條件下擴(kuò)大培養(yǎng) 8-10 小時(shí)至 OD6tltl=L 8-2. 0，28°C、4000rpm 離心 10 分鐘，棄上清，菌體用新鮮的YEB液體培養(yǎng)基(pH7. 2)洗滌，再用含有3%(w/w)蔗糖的MS鹽溶液(pH5. 8) IOOmL 重懸，制得(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19 農(nóng)桿菌工程菌液。將前述羽衣甘藍(lán)外植體置(SP/DF/GA20ox)1: :pBIN19農(nóng)桿菌工程菌液中浸染15分鐘，無(wú)菌吸水紙吸去多余菌液后，接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)瓊月旨、lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基，pH5. 8)，25±2°C黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)，用無(wú)菌水清洗后，再轉(zhuǎn)入抗性篩選誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基(含有3%(w/w)蔗糖、O. 8%(w/w)瓊脂、4mg/L 6_BA、2mg/L ZT、5mg/L AgNO3>500mg/L Carb 和 20mg/L Kan 的 MS 固體培養(yǎng)基，pH5. 8)中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001x條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出綠色愈傷組織及抗性芽(圖13-14);將同一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)長(zhǎng)出的長(zhǎng)2-3cm的抗性芽切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(含有 3%(w/w)鹿糖、O. 8%(w/w)瓊脂、O. 2mg/L NAA、250mg/L Carb 和 5mg/L Kan 的 1/2MS固體培養(yǎng)基，pH5. 8)中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000_20001x條件下培養(yǎng)至生根，即得轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株(圖15)。上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體轉(zhuǎn)化羽衣甘藍(lán)的方法為優(yōu)化方法，其具有以下特點(diǎn)①農(nóng)桿菌的濃度影響菌體在植物細(xì)胞上的附著，在一定范圍內(nèi)，菌液濃度越大，附著率越高，轉(zhuǎn)化率越大，但超過(guò)該范圍，由于菌的毒害作用或生長(zhǎng)過(guò)快等，會(huì)使外植體受到農(nóng)桿菌過(guò)度傷害而導(dǎo)致外植體切口褐化腐爛嚴(yán)重，且不利于共培養(yǎng)后去除農(nóng)桿菌，而低于該范圍，較低的菌液濃度會(huì)使T-DNA不能有效地整合進(jìn)植物細(xì)胞基因組中，大大降低轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明對(duì)農(nóng)桿菌工程菌液的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，能夠有效保證八AaSd和此三基因RNAi載體的轉(zhuǎn)化率；②激素是影響再生頻率的主要因素之一，不同的激素組合及激素水平對(duì)誘導(dǎo)不同外植體愈傷和出芽的影響不同，本發(fā)明方法中預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的激素組合優(yōu)選為lmg/L 6-BA和lmg/L 2，4_D，分化的激素組合優(yōu)選為4mg/L 6-BA和2mg/L ZT并加入5mg/L AgN03促分化，生根激素優(yōu)選為O. 2mg/L NAA 由于羽衣甘藍(lán)對(duì)Kan很敏感，Kan濃度過(guò)低，選擇壓不足，易產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因植株，反之則不利于芽分化，本發(fā)明方法中抗性篩選誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基中Kan的濃度優(yōu)選為10-20mg/L ;④采用本發(fā)明所述生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng),生根率可達(dá)10%，陽(yáng)性植株得率可達(dá)3. 6%。六、轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株的篩選1.PCR檢測(cè)NPTII報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá) 根據(jù)載體PBIN19中的NPTII報(bào)告基因序列，設(shè)計(jì)如下特異引物
NPTI1-F :5’-GACAATCGGCTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 13)；
NPTI1-R :5’-AACTCCAGCATGAGATCC-3’ (SEQ ID No. 14)。分別取前述轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株和非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株，提取基因組DNA，再以所得基因組DNA為模板、NPTI1-F和NPTI1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)NPTII報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖16所示，部分轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株的PCR產(chǎn)物在875bp位置出現(xiàn)目標(biāo)DNA條帶。將該DNA條帶回收純化后與PMD18-T載體連接，測(cè)序證明與NPTII報(bào)告基因片段序列一致，證實(shí)這些植株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。2. qPCR檢測(cè)和三基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株中的表達(dá) 根據(jù)羽衣甘藍(lán)例和GA20ox三基因片段序列，設(shè)計(jì)如下特異性qPCR引物及內(nèi)參
基因 BoActin (GenBank 登錄號(hào) AF044573)的 qPCR 引物
qBoDWARF-F :5’-GATGCGAGAACGAAGAGAGTC-3’ (SEQ ID No. 15)；qBoDWARF-R :5’-TGAAGAAGGAAGATAACCGATAC-3’ (SEQ ID No. 16)；qBoSP-F :5’-GACGCCGTTGACTGAAGG-3’ (SEQ ID No. 17)；qBoSP-R :5’-CCAGTCATAAGTATCCCG-3’ (SEQ ID No. 18)；qBoGA20ox-F :5’-TGAACAGCAAGAGCGAGAGG-3’ (SEQ ID No. 19)；qBoGA20ox-R :5’-GTGAACTCAAGCAACATAGACC-3’ (SEQ ID No. 20)；qBoactin-F :5，-GGAACTGGAATGGTGAAGGTG-3，(SEQ ID No. 21)；qBoactin-R :5’-GTCTTTCTGACCCATCCCAAC-3’ (SEQ ID No. 22)。分別取前述轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株和非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株的幼葉，提取總RNA,將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以所得cDNA為模板，分別以qBoDWARF-F和qBoDWARF-R、qBoSP-F 和 qBoSP-R、qBoGA20ox_F 和 qBoGA20ox-R、qBoactin_F 和 qBoactin-R 為引物進(jìn)行qPCR，檢測(cè)和三基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株中的表達(dá)。結(jié)果如圖17所示，轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株中洲5P和GA20ox三基因的表達(dá)都較非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株顯著降低，基因沉默效率高。七、轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株的表型分析
將上述篩選出的轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株和非轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株按常規(guī)方法培育，觀察分析轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株的表型特征，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)陽(yáng)性植株的株系為微型化表型(圖18-19)。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.羽衣甘藍(lán)ΛΚ^/^基因片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No.1中第I位至第936位所示。
2.羽衣甘藍(lán)5P基因片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
3.羽衣甘藍(lán)基因片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 3所示。
4.羽衣甘藍(lán)訓(xùn)⑷ 八5^和GA20ox三基因RNAi載體，其特征在于，含有一個(gè)hpRNA表達(dá)盒，所述hpRNA表達(dá)盒包括順序連接的啟動(dòng)子、洲三基因拼接片段的正向片毀、DWARF/SP/GA20OX三基因拼接片段的反向片段和終止子 ，所迷DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括基因片段或其互補(bǔ)片段、5P基因片段或其互補(bǔ)片段、以及基因片段或其互補(bǔ)片段，所述例從F基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第I位至第936位所示，5P基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羽衣甘藍(lán)DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體，其特征在于，所述hpRNA表達(dá)盒包括順序連接的CaMV35S B動(dòng)予、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的正向片段、PDK內(nèi)含子、DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段的反向片段和Ocs終止子；所述DWARF/SP/GA20ox三基因拼接片段包括順序連接的DWARF基因片段的正向片段、5P基因片段的正向片段、以及GA20OX基因片段的反向互補(bǔ)片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的羽衣甘藍(lán)洲^^產(chǎn)和三基因RNAi載體，其特征在于，以pBIN19載體為骨架，所述hpRNA表達(dá)盒插入pBIN19載體的多克隆位點(diǎn)中，所述SP/GA20ox三基因拼接片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
7.權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述羽衣甘藍(lán)和GA20ox三基因RNAi載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 a.羽衣甘藍(lán)和三基因片段的克隆以羽衣甘藍(lán)幼葉總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以所得cDNA為模板，分別以BoDF-F和BoDF-R、BoSP-F和BoSP-R、BoGA20ox-F和BoGA20ox-R為引物，PCR擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因片段、核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的5P基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的GA20ox基因片段；所述引物BoDF-F和BoDF-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQID No. 6所示，BoSP-F和BoSP-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示，BoGA20ox-F和BoGA20ox-R的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示；然后，將PCR擴(kuò)增所得的基因片段和5P基因片段分別與pMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18-T 和 SP: :pMD18_T，另將 PCR 擴(kuò)增所得的 GA20ox 基因片段與 pGEM_T Easy 載體連接，獲得重組質(zhì)粒GA20ox: :pGEM-T Easy ； b.羽衣甘藍(lán)洲5P和GA20ox三基因片段的拼接將重組質(zhì)粒DWARF::pMD18_T用通ol和feoRI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒DWARF::pMD18-T線性片段，另將重組質(zhì)粒SP: :pMD18-T用Sal\和&0RI雙酶切，回收純化5P基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒DWARF: :pMD18-T線性片段與5P基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18_T ;然后，將重組質(zhì)粒SP/DF: : ]\ 18-1'用油<31和&oRI雙酶切，回收純化重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18_T線性片段，另將重組質(zhì)粒GA20ox: :pGEM-T Easy用5^1和&oRI雙酶切，回收純化GA20ox基因片段，再將純化的重組質(zhì)粒SP/DF: :pMD18-T線性片段與GA20ox基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒 SP/DF/GA20ox::pMD18_T ；C.羽衣甘藍(lán)三基因RNAi載體的構(gòu)建以重組質(zhì)粒SP/DF/GA20OX::pMD 18-T為模板，以DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)為引物，PCR擴(kuò)增兩側(cè)帶酶切位點(diǎn)的洲三基因拼接片段；所述引物DWARF (F+EX)和GA20ox (F+KB)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示；將純化的PCR產(chǎn)物用油al和雙酶切，回收純化訓(xùn)三基因拼接片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的pHANNIBAL載體連接，獲得重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox: :pHANNIBAL ;另將純化的PCR產(chǎn)物用Kpnl和&oRI雙酶切，回收純化洲三基因拼接片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒SP/DF/GA20ox::pHANNIBAL連接，獲得含有hpRNA表達(dá)盒的重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL ;然后，將重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1: :pHANNIBAL用5^1和5^1雙酶切，回收純化hpRNA表達(dá)盒，另將植物表達(dá)載體PBIN19用油al和feci雙酶切，回收純化載體pBIN19線性片段，再將純化的載體PBIN19線性片段與hpRNA表達(dá)盒連接，獲得重組質(zhì)粒(SP/DF/GA20ox)1::PBIN19,即羽衣甘藍(lán)GA20ox三基因RNAi載體。
8.含有權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述羽衣甘藍(lán)洲和GA20ox三基因RNAi載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
9.權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述羽衣甘藍(lán)洲和GA20ox三基因RNAi載體在微型化羽衣甘藍(lán)植株育種中的應(yīng)用。
10.利用權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述羽衣甘藍(lán)八SP和GA20ox三基因RNAi載體獲得微型化羽衣甘藍(lán)植株的方法，其特征在于，包括以下步驟 a.羽衣甘藍(lán)外植體的制備將羽衣甘藍(lán)種子消毒后，播種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、pH為5. 8的1/2MS固體培養(yǎng)基上，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001χ條件下培養(yǎng)；將生長(zhǎng)7-10天的帯柄子葉切下，接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤和lmg/L 2，4_D、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，制得羽衣甘藍(lán)外植體； b.農(nóng)桿菌工程菌液的制備將含有羽衣甘藍(lán)洲5P和GA20ox三基因RNAi載體的農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 2%的瓊脂、50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH為7. 2的YEB固體培養(yǎng)基上，28 ±2 °C黑暗條件下活化2_3天至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH為7. 2的YEB液體培養(yǎng)基20mL，在28±2°C、200rpm條件下擴(kuò)大培養(yǎng)1. 5天，再將所得菌液按體積比為1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素、pH為7. 2的YEB液體培養(yǎng)基中，在28±2°C、200rpm條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6tltl=L 8-2. 0，然后28±2°C離心棄上清，菌體用新鮮的YEB液體培養(yǎng)基洗滌，再用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、pH為5. 8的MS鹽溶液IOOmL重懸，制得農(nóng)桿菌工程菌液； c.農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化將步驟a制得的羽衣甘藍(lán)外植體置步驟b制得的農(nóng)桿菌工程菌液中浸染15分鐘后，接入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤和lmg/L 2，4-D、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，25±2°C黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)，再轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊脂、4mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、2mg/L玉米素、5mg/L硝酸銀、500mg/L羧節(jié)青霉素和20mg/L卡那霉素、pH為5. 8的MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001x條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出愈傷組織及抗性芽；將長(zhǎng)2-3cm的抗性芽切下，轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 8%的瓊月旨、O. 2mg/L萘乙酸、250mg/L羧芐青霉素和5mg/L卡那霉素、pH為5. 8的1/2MS固體培養(yǎng)基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照強(qiáng)度1000-20001x條件下培養(yǎng)至生根，即得轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株； d.轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得 通過(guò)PCR檢測(cè)羽衣甘藍(lán)洲和三基因RNAi載體中含有的報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)，以及qPCR檢測(cè)Λ / 八5P和GA20ox三基因在轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中的表達(dá)，從步驟c獲得的轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍(lán)植株中篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，即獲得微型化羽衣甘藍(lán)植株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了羽衣甘藍(lán)DWARF、SP和GA20ox三基因片段(序列分別如SEQIDNo.1第1-936位核苷酸、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示)和基于上述片段構(gòu)建的羽衣甘藍(lán)DWARF、SP和GA20ox三基因RNAi載體，將該RNAi載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化羽衣甘藍(lán)，所得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中DWARF、SP和GA20ox三基因的表達(dá)均較非轉(zhuǎn)基因植株顯著降低，植株株型為微型化表型，從而通過(guò)DWARF、SP和GA20ox三基因共沉默獲得了微型化羽衣甘藍(lán)新品種，具有良好的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)為其它植物的微型化育種提供了參考和借鑒。
文檔編號(hào)C12N15/54GK103014030SQ20131000873
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者胡宗利, 解巧利, 陳國(guó)平, 涂昀, 劉琴 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)