乳酸菌發(fā)酵麥胚提取物的制備方法及其抗腫瘤作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了乳酸菌發(fā)酵麥胚提取物的制備方法及其抗腫瘤作用，屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法利用從泡菜中篩選的乳酸菌LactobacillusplantarumDy-1，CGMCC?No.6016，作為發(fā)酵菌株；優(yōu)化發(fā)酵條件，以獲得具有抗腫瘤效果和較高產(chǎn)量的LFWGE；采用該提取物進行了多種人源腫瘤細胞及其荷瘤動物試驗，結(jié)果表明其提取物具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖的功能；并對發(fā)酵提取物的組成進行了分析，其中富含醌類、糖類、蛋白質(zhì)和多肽類等。本發(fā)明對麥胚進行簡單預(yù)處理（非高溫加熱），生產(chǎn)成本低，采用直投式發(fā)酵，方便快捷，安全穩(wěn)定，便于質(zhì)控。
【專利說明】乳酸菌發(fā)酵麥胚提取物的制備方法及其抗腫瘤作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特指以小麥胚芽(簡稱麥胚)為原料，通過乳酸菌發(fā)酵，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，制備具有抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤生長的發(fā)酵麥胚提取物(LFWGE)，該發(fā)明產(chǎn)品可用于功能性食品或藥物的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，中國因惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的人數(shù)占全球的1/4，且數(shù)量仍在不斷攀升。而對于癌癥的治療主要有手術(shù)、化療、放療及祀向療法(免疫療法、基因療法、血管生成抑制劑及定向療法)等方式，其副作用仍會給患者帶來許多痛苦。因此，開發(fā)天然安全、無毒副作用的抗腫瘤活性物質(zhì)及其功能食品是癌癥患者的渴求。
[0003]麥胚是小麥籽粒的生命源泉，占籽粒總重的2%?3%，是小麥制粉加工的副產(chǎn)物之一。其富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素、礦物質(zhì)及其他一些微量生理活性成分，被營養(yǎng)學(xué)家們譽為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”，因而，麥胚的開發(fā)利用一直受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。近年來，在美國、加拿大和日本等國家，麥胚不僅被廣泛地加工成各種健康食品，利用微生物發(fā)酵麥胚獲得具有一定生理功能的提取物已成為新的研究熱點，而國內(nèi)相關(guān)研究則相差甚遠。
[0004]日本專利(200510069392.8)公開了一種抗腫瘤制劑的制備方法。該方法是將麥胚芽、大豆胚芽、米胚芽等以一定的比例混合，將混合物用110°c熱蒸汽加熱，并將蒸汽加熱產(chǎn)物在30°C下用曲類(小麥曲霉)等發(fā)酵48h，所得的發(fā)酵提取物具有抗腫瘤效果，其抑制率在5%?15%，該專利未對發(fā)酵提取物中的抗腫瘤成分進行分析。
[0005]匈牙利專利(99/08694)公開了一種以2，6_ 二甲氧基對苯醌為活性物質(zhì)的檢測方法及其抗腫瘤產(chǎn)品(Avemar)。該方法是將麥胚粉碎，用商用面包酵母發(fā)酵，將上清液進行冷凍干燥或噴霧干燥，以其干燥粉配制成一定濃度的水溶液加入到腫瘤細胞中，能夠抑制腫瘤細胞的代謝和轉(zhuǎn)移。并以氯仿或乙醇提取其中的2，6-二甲氧基對苯醌為標志物，采用HPLC進行定量。此外，未對提取物的其它成分進行分析。
[0006]美國專利(2010/135580A2)采用面包酵母對新鮮麥胚進行發(fā)酵，將其上清液冷凍干燥成粉，干燥粉用乙醇提取并通過分子篩和電泳等方法獲得多肽，相對分子質(zhì)量在5?100KD之間。采用該范圍的多肽進行腫瘤細胞和荷瘤動物試驗，具有減少腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞增殖作用。
[0007]上述日本專利是采用小麥曲霉發(fā)酵多種胚芽獲得的抗腫瘤混合發(fā)酵提取物，匈牙利和美國專利則是采用面包酵母發(fā)酵麥胚獲得的抗腫瘤發(fā)酵提取物，而采用乳酸菌發(fā)酵麥胚獲得抗腫瘤提取物尚未見專利或其他文獻報道。
[0008]本發(fā)明采用自行分離的乳酸菌和商用酵母菌中篩選出優(yōu)良的出發(fā)菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，以獲得具有抗腫瘤效果和較高產(chǎn)量的LFWGE ;采用該提取物進行了多種人源腫瘤細胞及其荷瘤動物試驗，結(jié)果表明其提取物具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖的功能；并對發(fā)酵提取物的組成進行了分析，其中富含醌類、糖類、蛋白質(zhì)和多肽類等。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供的是一種以新鮮麥胚為原料，通過乳酸菌發(fā)酵，從中提取、分離、純化獲得具有抑制腫瘤細胞增殖活性的LFWGE的制備方法及其應(yīng)用技術(shù)。
[0010]采用乳酸菌發(fā)酵麥胚，控制發(fā)酵條件，獲取發(fā)酵提取物，并對其進行分離純化；采用MTT、細胞凋亡和細胞周期法研究其組分的體外抗腫瘤功能；采用荷瘤裸鼠模型(人源腫瘤細胞)研究該提取物體內(nèi)抗腫瘤功能；綜合評價本發(fā)明LFWGE的抗腫瘤特性。
[0011]本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn):
[0012](I)菌種的篩選:從泡菜中篩選出I株乳酸菌(Lactobacillus pi an tarum Dy-1,保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日期:2012年4月18日；保藏編號=CGMCCN0.6016;分類命名:植物乳桿菌Lactobacillus plantarum),選擇其作為發(fā)酵菌株；或者是選擇商業(yè)上已鑒定好的優(yōu)良乳酸菌(植物乳桿菌(lactobacillus plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus case)一種或幾種。
[0013](2)麥胚發(fā)酵:稱取篩分除雜后的新鮮麥胚，粉碎過30?80目篩，置于錐形瓶中，按照重量比1:6?1:15比例，優(yōu)選1:7的比例加入蒸餾水，再加入乳酸菌到麥胚中，其中乳酸菌占新鮮麥胚粉的質(zhì)量為2?8%，混合均勻；將錐形瓶用紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在20?40°C下發(fā)酵12?72h，其中優(yōu)選發(fā)酵溫度30?35°C，發(fā)酵24?48h后，發(fā)酵物在室溫下 8000 ?15000rpm/min 離心 10 ?40min,其中優(yōu)選 10000 ?12000rpm/min 離心 20 ?30min;收集上清液，并將其進行熱風(fēng)干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，優(yōu)選冷凍干燥，從而獲得到 LFWGE。
[0014]或者進一步按照下述步驟進行:
[0015]LFffGE的分離純化與分析:采用高效液相(流動相是甲醇與水的比例按照20%?15%,流速為lmL/min,柱溫為25°C,檢測波長為288nm。)、凝膠過濾層析(SephadexG-50和SurpedexS-200)、SDS-PAGE (5%的濃縮膠，10%?12%的分離膠)等技術(shù)對發(fā)酵麥胚提取物中的抗腫瘤主要組分進行分離純化，并通過體外抗腫瘤試驗，確證LFWGE中抗腫瘤的主要組分(蛋白質(zhì)、多肽)。
[0016]上述具有抗腫瘤活性食品的應(yīng)用
[0017]將本發(fā)明的LFWGE以一定的比例直接加入到發(fā)酵乳制品以及其他酸性飲料中，制成功能性飲料；也可將其加入固體食品的制作中，如面包、面條、香腸以及餅干等。
[0018]將本發(fā)明的LFWGE加入到食品中并無特別的重量要求，加入量一般優(yōu)選1%?15%，優(yōu)選4%?10%。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0020]( I)本發(fā)明以小麥制粉過程中的副產(chǎn)物一麥胚為原料，來源廣、蘊藏量大，通過對其生物轉(zhuǎn)化，將大大提升小麥加工副產(chǎn)物深加工的水平，引導(dǎo)企業(yè)應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)健康、聞值化的廣品。
[0021](2)本發(fā)明對麥胚進行簡單預(yù)處理(非高溫加熱)，生產(chǎn)成本低，采用直投式發(fā)酵，方便快捷，安全穩(wěn)定，便于質(zhì)控。[0022](3)本發(fā)明利用自主分離的乳酸菌，制備具有抗腫瘤功能的發(fā)酵提取物，具有自主知識產(chǎn)權(quán)。
[0023](4)本發(fā)明對從提取物中的兩組蛋白質(zhì)的抗腫瘤功能進行了研究，確定其低分子量組分具有顯著的抗腫瘤功效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1LFWGE對結(jié)腸癌HT-29細胞的生長抑制率，
[0025]圖2細胞凋亡圖譜，
[0026]圖3LFWGE濃度對結(jié)腸癌細胞周期的影響，
[0027]圖4LFWGE水溶性蛋白SDS-PAGE圖譜，
[0028]圖5凝膠過濾層析多肽圖譜，
[0029]圖6LFWGE對荷瘤裸鼠瘤體積的影響，
[0030]圖7LFWGE對荷瘤裸鼠腫瘤的抑制率，
[0031]圖8荷瘤裸鼠血清腫瘤壞死因子_α含量，
[0032]圖9荷瘤裸鼠血清干擾素-Y的含量，
[0033]圖10荷瘤裸鼠血清白細胞介素-4的含量。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述。
[0035]體外抗腫瘤功能:將本發(fā)明的LFWGE以0.125?4mg/mL的濃度加入到人的HT-29結(jié)腸癌細胞中，培養(yǎng)一段時間(如48h)，觀察評價其抗腫瘤效果。其方法如下:
[0036]①細胞增殖試驗:采用MTT法。
[0037]②細胞凋亡與細胞周期試驗:采用流式細胞儀進行分析。
[0038]與未加本發(fā)明發(fā)酵麥胚提取物的情況相比較，腫瘤活細胞數(shù)可降至50%或以下，最優(yōu)的可使活細胞數(shù)降至10%或以下；其腫瘤凋亡率可達50%或以上，最高可達90%或以上。
[0039](5)體內(nèi)抗腫瘤功能:將4?6周齡的BALB/c裸鼠的腹部皮下接種人結(jié)腸癌HT-29細胞(接種量:I X IO6?2 X IO7細胞/裸鼠)，2?15天后肉眼可見裸鼠接種部位有腫瘤長出后開始灌胃；將荷瘤裸鼠隨機分成5組，即陰性對照組、5-FU陽性對照組、LFffGE高劑量組、LFffGE低劑量組和LFWGE高劑量組+5-FU組，每組10?12只裸鼠，連續(xù)灌胃14?50天；每日測定瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，根據(jù)腫瘤重量計算抑瘤率；在試驗?zāi)┢跍y定荷瘤裸鼠血清中干擾素(IFN-Y )、白介素-4 (IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的濃度。
[0040]與陰性對照組相比較，灌胃LFWGE組的抑瘤率可達30%?60%。
[0041]實施例1
[0042]稱取粉碎的新鮮麥胚粉20.0g于500mL錐形瓶中，向其中加入IOOml的蒸餾水，再加入0.4g的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum Dy-1),混合均勻；將錐形瓶用紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中在30°C下發(fā)酵24h后，將其在12000rpm/min下離心20min收集上清液進行冷凍干燥。
[0043]稱取0.5g的凍干粉溶于50ml的去離子水中，過0.22um的濾膜，將濾液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml、4.0mg/ml 分別加入到 HT-29 結(jié)腸癌細胞中，培養(yǎng)細胞24h、48h、72h，并分別通過MTT法測定LFWGE對結(jié)腸癌HT-29細胞的抑制率(圖1)。結(jié)果表明，提取物濃度與腫瘤細胞增殖抑制率呈正相關(guān)，最大抑制率達到94.2%ο
[0044]將1.0mg/mL的LFWGE加入到結(jié)腸癌細胞中，培養(yǎng)細胞48h后，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡(圖2)。結(jié)果表明，早期凋亡是66.5% (圖2，右下角)，晚期凋亡是27.6%(圖2，右上角)。將0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的LFWGE加入到結(jié)腸癌HT-29細胞中，培養(yǎng)細胞48h后，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞周期(圖3)。結(jié)果表明，隨著濃度的增加，G1期也隨之延長，而S期則隨之縮短，說明LFWGE能有效阻滯細胞的G1期。
[0045]實施例2
[0046]取實施例1 中的濾液同樣以 0.125mg/mL、0.25mg/ml、0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml分別加入到HT-29結(jié)腸癌細胞中，培養(yǎng)細胞24h、48h、72h，并分別通過MTT法測定LFWGE對結(jié)腸癌HT-29細胞的抑制率。結(jié)果表明，提取物濃度與腫瘤細胞增殖抑制率呈正相關(guān)，最大抑制率達到89.6%。
[0047]將lmg/ml的LFWGE加入到SGC-7901細胞中，培養(yǎng)細胞48h后，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞的凋亡。早期凋亡是48.5%，晚期凋亡是22.4%。將0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml的LFWGE加入到胃癌細胞中，培養(yǎng)細胞48h后，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞周期。結(jié)果表明，隨著濃度的增加，G1期也隨之延長，而S期則隨之縮短，說明LFWGE能有效阻滯細胞的61期。
[0048]實施例3
[0049]IOOg粉碎的新鮮麥胚加入IL的蒸餾水和4g的植物乳桿菌混合均勻，混合物在250rpm的轉(zhuǎn)速下，30°C發(fā)酵48h。所得發(fā)酵產(chǎn)物進行IOOOOrpm離心15min，上清液被收集并進行冷凍干燥，獲得LFWGE凍干粉。利用SDS-PAGE檢測LFWGE中水溶性蛋白的分布(圖4)。為了分離LFWGE中蛋白成分，采用(NH4) 2S04沉淀法將LFWGE水溶液中的蛋白沉淀析出，沉淀溶解在PBS中，并將所得的溶液通過S印hadexG-50和SurpedexS-200凝膠過濾層析，分別收集到峰I和峰2組分(圖5)，并將其冷凍干燥。采用MTT法分別測定了峰I和峰2組分對HT-29細胞的抑制率。結(jié)果表明，峰I對HT-29細胞具有顯著的抑制率，最大可達到 88.6% (表 I)
[0050]實施例4
[0051]將上述制備的LFWGE溶解于生理鹽水中，制備成濃度為0.2g/ml和0.lg/ml水溶液，并且通過無菌膜處理備用。人HT-29結(jié)腸癌細胞接種到4-6周齡的BALB/c裸鼠腹部皮下，2 天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p, 7 天)劑量的 LFWGE 給荷瘤裸鼠灌胃，連續(xù)灌胃30天，同時與灌胃相同劑量的生理鹽水組和腹腔注射(25mg/kg/d, 1.p，7天)的5-FU組進行比較，通過測定瘤體積的變化和最后的抑瘤率來確定LFWGE的抗腫瘤效果(圖2，3)。結(jié)果表明，2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU LFWGE劑量組的抑瘤率分別達到 49.37%、40.7%, 47.8%。
[0052]用酶聯(lián)免疫試劑盒測定荷瘤裸鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α )，干擾素(IFN-Y )，白細胞介素-4 (IL-4)的含量。結(jié)果表明，LFWGE可以同時增加IFN-Y、IL-4以及TNF-α的含量(圖8，9，10)。從而提高了裸鼠對ΗΤ-29細胞的抑制作用。[0053]表1LFWGE中蛋白分離的各組分對HT-29細胞增殖抑制率
[0054]
【權(quán)利要求】
1.乳酸菌發(fā)酵麥胚提取物的制備方法，其特征在于按照下述步驟進行: (1)菌種的篩選:從泡菜中篩選出I株乳酸菌(Lactobacillusplantarum Dy-1,CGMCCN0.6016)，鑒定其功能特性，選擇其作為發(fā)酵菌株；或者是選擇商業(yè)上已鑒定好的優(yōu)良乳酸菌(植物乳桿菌ilactobacillus 短乳桿菌{Lactobacillus嗜酸乳Vi^iLactobacillus 干酪乳桿菌case) 一種或幾種； (2)麥胚發(fā)酵:稱取篩分除雜后的新鮮麥胚，粉碎過30~80目篩，置于錐形瓶中，按照重量比1:6~1:15比例，優(yōu)選1:7的比例加入蒸餾水，再加入乳酸菌到麥胚中，其中乳酸菌占新鮮麥胚粉的質(zhì)量為2~8%，混合均勻；將錐形瓶用紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在20~40°C下發(fā)酵12~72h，其中優(yōu)選發(fā)酵溫度30~35°C，發(fā)酵24~48 h后，發(fā)酵物在室溫下 8000 ~15000rpm/min 離心 10 ~40min,其中優(yōu)選 10000 ~12000rpm/min 離心 20 ~30min ;收集上清液，并將其進行熱風(fēng)干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，優(yōu)選冷凍干燥，從而獲得到 LFWGE。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸菌發(fā)酵麥胚提取物的制備方法，其特征在于進一步按照下述步驟進行: LFffGE的分離純化與分析:采用高效液相，其中流動相是甲醇與水的按照體積比例20%~15%，流速為lmL/min，柱溫為25 °C，檢測波長為288nm ;柱子為S印hadexG-50和SurpedexS-200的凝膠過濾層析；質(zhì)量含量為5%的濃縮膠，質(zhì)量含量為10%~12%的分離膠SDS-PAGE，對發(fā)酵麥胚提取物中的抗腫瘤主要組分進行分離純化得到LFWGE中抗腫瘤的主要組分為蛋白質(zhì)或多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸菌發(fā)酵麥胚提取物的應(yīng)用，將LFWGE以一定的比例直接加入到發(fā)酵乳制品以及其他酸性飲料中，制成功能性飲料；或者將其加入固體食品的制作中，加入量以質(zhì)量百分比為1%~15 %。
【文檔編號】A23L1/172GK103461858SQ201310259726
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】董英, 張家艷, 徐斌, 周興華, 肖香 申請人:江蘇大學(xué)