一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法。該方法的技術(shù)要點(diǎn)是利用稻曲病菌薄壁分生孢子在水中生存期長(zhǎng)的生活特性，用純凈的薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態(tài)。該方法的技術(shù)步驟如下：1）培養(yǎng)制備含薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物；2）薄壁分生孢子的純凈處理；3）適合貯存的孢子液的調(diào)配；4）孢子液裝管存貯；5）菌種復(fù)活培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：菌種保存時(shí)長(zhǎng)超過(guò)4年；無(wú)需每年轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的護(hù)理工作；減小菌種變異機(jī)率；盛裝菌種的管具體積小，存放菌種需要空間少，便于管理。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)和生物技術(shù)。具體是一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]稻曲病是我國(guó)水稻生產(chǎn)的一個(gè)重大病害。該病害的科學(xué)有效防治有賴于該病害的基礎(chǔ)研究，而該病害病原菌菌種的有效保存則是許多基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)工作。特別是稻曲病菌的分離技術(shù)難度較大，高效長(zhǎng)期保存菌種的方法將為研究工作提供很大的便利。至今，稻曲病菌菌種的保存往往采用試管斜面培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌絲體形態(tài)存放，這樣的保存方法雖然簡(jiǎn)單有效，但也存在一些弊病，主要是保存時(shí)間較短，要達(dá)到長(zhǎng)期保存菌種的目的，每年需要I?2次的轉(zhuǎn)管培養(yǎng)護(hù)理工作，而反復(fù)的轉(zhuǎn)管培養(yǎng)很容易導(dǎo)致該病菌菌種產(chǎn)生變異；而且在病菌菌株數(shù)量較多時(shí)，護(hù)理工作量大，耗時(shí)費(fèi)力。另外，以這種方式保存的菌絲體，移植恢復(fù)生長(zhǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，一般要耗時(shí)7?10天。
[0003]在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，很容易培養(yǎng)獲得稻曲病菌的薄壁分生孢子。已經(jīng)知道，該薄壁分生孢子在瓊脂類(lèi)培養(yǎng)基平板上很容易萌發(fā)生長(zhǎng)，而發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該孢子在水中一般不萌發(fā)，但這不萌發(fā)的孢子并沒(méi)有失去萌發(fā)活力，當(dāng)將這些在水中存放的孢子轉(zhuǎn)到瓊脂平板上后，孢子能恢復(fù)萌發(fā)，生長(zhǎng)發(fā)育成正常新一代菌體；該孢子可以在水中保持多年仍具有萌發(fā)活力。稻曲病菌薄壁分生孢子的這種生活特性，在菌種保存中有應(yīng)用價(jià)值，但至今還沒(méi)有利用薄壁分生孢子保存稻曲病菌菌種的實(shí)踐應(yīng)用和配套方法。
[0004]本
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的提供一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下:
[0007]—種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法采用較純凈的稻曲病菌薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態(tài)，以下簡(jiǎn)稱稻曲病菌薄壁分生孢子為薄壁分生孢子，長(zhǎng)期保存方法的步驟如下:
[0008]1.培養(yǎng)含薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物:
[0009]采用二期培養(yǎng)方法或三期培養(yǎng)方法，用稻曲病菌菌絲體在液體培養(yǎng)基中通過(guò)振蕩培養(yǎng)方式，培養(yǎng)薄壁分生孢子，具體用如下方法:
[0010]用半量的PSA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g和水1000ml，培養(yǎng)該病菌獲得稻曲病菌菌落；挑取小塊稻曲病菌菌落移入半量的PS培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液成分為:馬鈴薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振蕩培養(yǎng)器內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分和溫度為28°C條件下振蕩培養(yǎng)，7天左右培養(yǎng)液內(nèi)產(chǎn)生大量的薄壁分生孢子；
[0011]2.薄壁分生孢子的純凈處理:
[0012]將上述步驟I)獲得的薄壁分生孢子進(jìn)行純凈化處理，處理方法如下:
[0013]A.去除菌絲體:用2層滅菌紗布將振蕩培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物過(guò)濾，菌絲體將濾集在紗布上，收集過(guò)濾液，能獲得沒(méi)有菌絲體的薄壁分生孢子液；
[0014]B.去除培養(yǎng)基組分和代謝產(chǎn)物:將去除菌絲體的薄壁分生孢子液進(jìn)行離心沉淀處理，在6000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，能將薄壁分生孢子沉淀出來(lái)。離心完成后傾棄上清液，留下沉淀薄壁分生孢子；
[0015]C.進(jìn)一步凈化:取無(wú)菌水將沉淀薄壁分生孢子重新懸浮分散，攪動(dòng)洗滌，然后再離心沉淀一次，傾棄上清液后，可獲得純凈的薄壁分生孢子；
[0016]3.適合貯存的薄壁分生孢子液的調(diào)配:
[0017]薄壁分生孢子濃度的調(diào)配方法如下:
[0018]用適量無(wú)菌水將上述步驟2)獲得純凈的薄壁分生孢子沉淀再懸浮分散成孢子液，用移液器將這薄壁分生孢子液由離心管轉(zhuǎn)移到較大的無(wú)菌容器小三角瓶或小燒杯內(nèi)，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子數(shù)量檢測(cè)，用無(wú)菌水將薄壁分生孢子液調(diào)配至濃度為IO6個(gè)孢子/ml左右；
[0019]4.薄壁分生孢子液裝管存貯:用移液器將調(diào)配好的薄壁分生孢子液分裝到管具5ml冷凍管內(nèi)，回蓋密封后,置于23?25°C下存放；
[0020]5.稻曲病菌菌種復(fù)活培養(yǎng):需要使用菌種時(shí)，取出貯存薄壁分生孢子液的管具，充分振蕩使薄壁分生孢子懸浮并分散均勻，用微量移液器取10?20 μ I薄壁分生孢子液轉(zhuǎn)移到半量的PSA培養(yǎng)基上，在溫度為28°C條件下培養(yǎng)，5天后可長(zhǎng)出新的稻曲病菌菌落。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0022]1.保存時(shí)間長(zhǎng)，菌種存活期超過(guò)4年。
[0023]2.無(wú)需每年轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的護(hù)理工作。
[0024]3.減小菌種變異機(jī)率。`
[0025]4.盛裝菌種的管具體積小，貯存菌種需要空間少，便于管理。
【具體實(shí)施方式】:
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0027]實(shí)施例1
[0028]采用本發(fā)明一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法，以薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態(tài)，保存稻曲病菌菌株Uv-34，按如下步驟實(shí)施操作:
[0029]I)培養(yǎng)含薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物:
[0030]采用二期培養(yǎng)方法，通過(guò)振蕩培養(yǎng)獲得含有大量的薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物，具體如下；用半量的PSA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g和水1000ml，培養(yǎng)該病菌獲得稻曲病菌菌落；挑取小塊稻曲病菌菌落移入半量的PS培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液成分為:馬鈴薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振蕩培養(yǎng)器內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分和溫度為28°C條件下振蕩培養(yǎng)，一般7天左右培養(yǎng)液內(nèi)產(chǎn)生大量的薄壁分生孢子。
[0031]2)薄壁分生孢子的純凈處理:
[0032]進(jìn)行菌種保存用的薄壁分生孢子必須要處于純凈狀態(tài)，需要將上述步驟I)獲得的薄壁分生孢子進(jìn)行純凈化處理，處理方法如下:
[0033]A.去除菌絲體:用2層滅菌紗布將振蕩培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物過(guò)濾，菌絲體將濾集在紗布上，收集過(guò)濾液，能獲得沒(méi)有菌絲體的薄壁分生孢子液。
[0034]B.去除培養(yǎng)基組分和代謝產(chǎn)物:將去除菌絲體的薄壁分生孢子液進(jìn)行離心沉淀處理，在6000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。離心完成后傾棄上清液，留下沉淀薄壁分生孢子，即能達(dá)到去除培養(yǎng)基組分和菌體生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物的目的。
[0035]C.進(jìn)一步凈化:取無(wú)菌水將沉淀薄壁分生孢子重新懸浮分散，攪動(dòng)洗滌，然后再離心沉淀一次，傾棄上清液后，可獲得純凈的薄壁分生孢子。
[0036]3)適合貯存的薄壁分生孢子液的調(diào)配:
[0037]貯存狀態(tài)的薄壁分生孢子，以濃度約為IO6個(gè)孢子/ml的狀態(tài)最適宜。薄壁分生孢子濃度的調(diào)配方法如下:
[0038]用適量無(wú)菌水將上述步驟2)獲得純凈的薄壁分生孢子沉淀再懸浮分散成孢子液，用移液器將這薄壁分生孢子液由離心管轉(zhuǎn)移到較大的無(wú)菌容器，如小三角瓶或小燒杯內(nèi)，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子數(shù)量檢測(cè)，用無(wú)菌水將薄壁分生孢子液調(diào)配至濃度為IO6個(gè)孢子/ml ο
[0039]4)薄壁分生孢子液裝管存貯:
[0040]將上步驟調(diào)配好的孢子液分裝到5ml冷凍管內(nèi)，回蓋密封后，于2008年8月20日開(kāi)始，置于23?25°C條件下貯存；
[0041]5)稻曲病菌菌種復(fù)活培養(yǎng):于2013年6月25日取出貯存了 4年零10個(gè)月后的薄壁分生孢子液，充分振蕩使薄壁分生孢子懸浮并分散均勻，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液轉(zhuǎn)移到半量的PSA培養(yǎng)基上，在溫度為28°C條件下培養(yǎng)，5天后培養(yǎng)基上長(zhǎng)出正常的稻曲病菌小菌落。
[0042]實(shí)施例2.[0043]采用本發(fā)明一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法，以薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態(tài)，保存稻曲病菌菌株Uv-105，按實(shí)施例1的步驟I)至步驟4)操作實(shí)施；于2008年12月9日開(kāi)始，置于23?25°C條件下存放；保存4年零6個(gè)月后，按實(shí)施例1的步驟5)操作實(shí)施，于2013年6月25日取出貯存了 4年零10個(gè)月后的薄壁分生孢子液，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液轉(zhuǎn)移到半量的PSA培養(yǎng)基上，在溫度為28°C條件下培養(yǎng)，5天后培養(yǎng)基上長(zhǎng)出正常的稻曲病菌小菌落。
[0044]實(shí)施例3
[0045]采用本發(fā)明一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法，以薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態(tài)，保存稻曲病菌菌株Uv-110，按實(shí)施例1的步驟I)至步驟4)操作實(shí)施；于2008年12月9日開(kāi)始，置于23?25°C條件下存放；保存4年零6個(gè)月后，按實(shí)施例1的步驟5)操作實(shí)施，于2013年6月25日取出貯存了 4年零10個(gè)月后的薄壁分生孢子液，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液轉(zhuǎn)移到半量的PSA培養(yǎng)基上，在溫度為28°C條件下培養(yǎng)，5天后培養(yǎng)基上長(zhǎng)出正常的稻曲病菌小菌落。
【權(quán)利要求】
1.一種稻曲病菌菌種長(zhǎng)期保存的方法，其特征在于，采用較純凈的稻曲病菌薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態(tài)，以下簡(jiǎn)稱稻曲病菌薄壁分生孢子為薄壁分生孢子，長(zhǎng)期保存方法的步驟如下: 1)培養(yǎng)含薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物: 采用二期培養(yǎng)方法或三期培養(yǎng)方法，用稻曲病菌菌絲體在液體培養(yǎng)基中通過(guò)振蕩培養(yǎng)方式，培養(yǎng)薄壁分生孢子，具體用如下方法: 用半量的PSA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g和水1000ml，培養(yǎng)該病菌獲得稻曲病菌菌落；挑取小塊稻曲病菌菌落移入半量的PS培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液成分為:馬鈴薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振蕩培養(yǎng)器內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分和溫度為28°C條件下振蕩培養(yǎng)，7天左右培養(yǎng)液內(nèi)產(chǎn)生大量的薄壁分生孢子； 2)薄壁分生孢子的純凈處理: 將上述步驟I)獲得的薄壁分生孢子進(jìn)行純凈化處理，處理方法如下: A.去除菌絲體:用2層滅菌紗布將振蕩培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物過(guò)濾，菌絲體將濾集在紗布上，收集過(guò)濾液，能獲得沒(méi)有菌絲體的薄壁分生孢子液； B.去除培養(yǎng)基組分和代謝產(chǎn)物:將去除菌絲體的薄壁分生孢子液進(jìn)行離心沉淀處理，在6000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，能將薄壁分生孢子沉淀出來(lái)。離心完成后傾棄上清液，留下沉淀薄壁分生孢子； C.進(jìn)一步凈化:取無(wú)菌水將沉淀薄壁分生孢子重新懸浮分散，攪動(dòng)洗滌，然后再離心沉淀一次，傾棄上清液后，獲得`純凈的薄壁分生孢子； 3)適合貯存的薄壁分生孢子液的調(diào)配: 薄壁分生孢子濃度的調(diào)配方法如下: 用適量無(wú)菌水將上述步驟2)獲得純凈的薄壁分生孢子沉淀再懸浮分散成孢子液，用移液器將這薄壁分生孢子液由離心管轉(zhuǎn)移到較大的無(wú)菌容器小三角瓶或小燒杯內(nèi)，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子數(shù)量檢測(cè)，用無(wú)菌水將薄壁分生孢子液調(diào)配至濃度為IO6個(gè)孢子/ml左右； 4)薄壁分生孢子液裝管存貯:用移液器將調(diào)配好的薄壁分生孢子液分裝到管具5ml冷凍管內(nèi)，回蓋密封后，置于23?25°C下存放； 5)稻曲病菌菌種復(fù)活培養(yǎng):需要使用菌種時(shí)，取出貯存薄壁分生孢子液的管具，充分振蕩使薄壁分生孢子懸浮并分散均勻，用微量移液器取10?20 μ I薄壁分生孢子液轉(zhuǎn)移到半量的PSA培養(yǎng)基上，在溫度為28°C條件下培養(yǎng)，5天后長(zhǎng)出新的稻曲病菌菌落。
【文檔編號(hào)】C12N1/04GK103436448SQ201310363335
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】張君成, 覃茜 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)