酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌pcr檢測用引物、探針及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR檢測用引物、探針及應(yīng)用。所涉及的引物和探針是根據(jù)A.acidoterrestris16S?rDNA基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定量檢測待測樣品中A.acidoterrestris的核酸拷貝數(shù)。具體來講，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ?ID?NO.2的核苷酸序列；所述探針具有序列表中SEQ?ID?NO.3的核苷酸序列。所涉及的方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明探針特異性好、檢測速度快、準(zhǔn)確性好和靈敏度高的特點(diǎn)。
【專利說明】酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR檢測用引物、探針及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.acidoterrestris)的突光定量PCR檢測中引物和探針及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus spp.)是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，桿狀、產(chǎn)芽孢、嚴(yán)格需氧，可以在PH2.5~6.0，溫度20~60°C范圍內(nèi)存活和生長。由于其具有耐熱、耐酸的特性，普通的巴氏殺菌難以將其殺滅，且其生長代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚和2，6- 二溴苯酚等物質(zhì)，使果汁口感、風(fēng)味變差，形成白色沉淀或霧狀渾濁，因此，脂環(huán)酸芽孢桿菌成為果汁和飲料加工業(yè)中重 要的質(zhì)量指標(biāo)。因?yàn)樗嵬林h(huán)酸芽孢桿菌(A.acidoterrestris)是果汁污染和腐敗中分離最多的脂環(huán)酸芽孢桿菌類細(xì)菌，所以，A.acidoterrestris已成為果汁飲料加工生產(chǎn)中最重要的監(jiān)測指標(biāo)之一。
[0003]目前，主要采用培養(yǎng)法進(jìn)行A.acidoterrestris的常規(guī)檢測，雖然這種方法簡單、易操作，但耗時(shí)長、檢測滯后于生產(chǎn)。同時(shí)，A.acidoterrestris在飲料及食品中含量非常低，復(fù)雜的食品成分和非目標(biāo)微生物對(duì)目標(biāo)菌體的檢測有非常大的影響，常規(guī)PCR、酶聯(lián)免疫吸附測定法、傅里葉變換紅外光譜和電子鼻等檢測方法需要與菌體培養(yǎng)富集結(jié)合才能到達(dá)檢測目的，因此，尚未應(yīng)用于食品工業(yè)實(shí)際檢測中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供用于A.acidoterrestris實(shí)時(shí)突光PCR檢測的引物及探針序列。
[0005]本發(fā)明通過對(duì)Alicyclobacillus spp.中 A.acidocaldarius, A.acidiphilus, A.contaminans, A.fastidiosus, A.herbarius,A.hesperidum,A.sendaiensis 和A.acidoterrestrislO個(gè)不同種細(xì)菌的16S rDNA序列分析，分別設(shè)計(jì)了引物和突光探針。所述的引物由上游引物和下游引物組成，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示；所述探針的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.3所示,該探針的一端標(biāo)記有報(bào)告突光染料，另一端標(biāo)記有淬滅突光染料。該探針選擇的報(bào)告突光染料為FAM,選擇的淬滅熒光染料為MGB。
[0006]本發(fā)明還提供了一種檢測A.acidoterrestris的方法,該方法以樣品總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ ID N0.1的上游引物和核苷酸序列為SEQ IDN0.2的下游引物以及核苷酸序列為SEQ ID N0.3的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定A.acidoterrestris的存在。
[0007]優(yōu)選的，上述方法中的熒光定量PCR反應(yīng)過程中的退火溫度為60°C。
[0008]具體的,本發(fā)明中對(duì)于A.acidoterrestris的檢測是以樣品總DNA為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是在反應(yīng)體系中加入無菌超純水、2 X PremixEx Taq、上游引物、下游引物、探針和總DNA。[0009]更具體的，本發(fā)明中對(duì)于A.acidoterrestris的檢測，是在25 ii L反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件是加入12.5 u L2 XPremix Ex Taq, 0.5 U LlO U M上游引物,0.5 U LlO ii M下游引物，1.0 u LlO u M探針，2.0 u L總模板和8.5 u L無菌超純水。
[0010]其中，熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為:第一個(gè)循環(huán)為95°C IOmin ;隨后40個(gè)循環(huán)，950C 15s,60°C lmin。
[0011]本發(fā)明還提供了一種用于A.acidoterrestris檢測的試劑盒,該試劑盒含有上述上游引物SEQ ID N0.1、下游引物SEQ ID N0.2和探針SEQ ID N0.3。
[0012]進(jìn)一步，將本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物、熒光探針以及相關(guān)的試劑組裝成試劑盒，以方便使用。
[0013]本發(fā)明對(duì)Alicyclobacillus spp.中10個(gè)不同種的16S rDNA基因序列進(jìn)行比較，并設(shè)計(jì)了基于A.acidoterrestris保守區(qū)域的引物和突光探針。通過軟件評(píng)價(jià)和對(duì)實(shí)際菌株的檢測，說明獲得的引物和探針具有非常好的特異性。本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以簡單快速的判斷樣品中是否含有A.acidoterrestris，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是對(duì)Alicyclobacillus spp.中不同菌株的16S rDNA基因序列分析,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)。其中，一為上游引物FP，一為下游引物RP，==為探針LP ；
[0015]圖2是實(shí)時(shí)熒光PCR 的特異性評(píng)價(jià)結(jié)果示意圖；
[0016]圖3 (a)表示不同濃度菌體的PCR擴(kuò)增曲線；圖3 (b)分別表示不同濃度菌體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不是用來限制本發(fā)明的范圍。
[0018]實(shí)施例1:
[0019]引物及探針的設(shè)計(jì)與合成
[0020]米用Primer Premier5 軟件對(duì) Alicyclobacillus spp.中 10 個(gè)不同種的16SrDNA基因序列進(jìn)行比較,如圖1所示，并采用探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express設(shè)計(jì)了基于A.acidoterrestris保守區(qū)域的引物和突光探針,如表1所示。經(jīng)過大量篩選得到如下序列的引物序列和探針，如表2所不。
[0021]引物的上游引物(FP)序列為SEQ ID N0.1，引物的下游引物(RP)序列為SEQ IDN0.2，具體引物序列的組成如下:
[0022]SEQ ID N0.1:5’ -TGAGT AACAC GTGGG CAATC TG-3’ ；
[0023]SEQ ID N0.2:5’ -CTACC CGTGT ATTAT CCGGC AT-3’。
[0024]熒光探針的核苷酸序列為:5 ’ -CTTTCAGACTGGAATAAC-3 ’，在探針的5 ’端標(biāo)記6-carboxyf luorescein (FAM)突光染料,3’端標(biāo)記 Minor Groove Binder (MGB)突光染料。
[0025]將上述游引物(FP)、下游引物(RP)和熒光探針(LP)分別配制成濃度為IOiimol/L的溶液，備用。
[0026]總DNA的提取[0027]總DNA的提取，采用試劑盒法。試劑盒購買于takara-寶生物工程(大連)有限公司。
[0028]將需要檢測的樣品(5mL)置于離心管中，于4°C、6000rpm條件下冷凍離心lOmin，棄去上清液。加入 20mg/mL of 溶菌酶緩沖液(20mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 2mmol/L EDTAand 1.2%Triton X-100)于37°C水浴中處理30min。按照試劑盒的說明進(jìn)行提取，最后用100 u L洗脫液溶解提取的樣品。采用核酸滴定儀測定提取DNA的濃度及純度，進(jìn)行樣品檢測或者置于_20°C保存、備用。
[0029]實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增
[0030]1、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系建立
[0031]以取制備好的樣品總DNA為模板，同時(shí)，以含有A.acidoterrestris總DNA的樣品為陽性對(duì)照，以無菌超純水為陰性對(duì)照，分別進(jìn)行如下實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng):每個(gè)樣品的PCR反應(yīng)檢測均在無菌八聯(lián)管中進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積25ii L，主要包含:12.5 ii L2 XPremixEx Taq, 8.5 ii L無菌超純水(滅酶)，0.5 ii L上游引物FP (10 ii M)，0.5 ii L下游引物RP (IOuM), LOuL探針LP (10 u M)，然后分別加入2.0 u L的待測樣品DNA,陽性樣品DNA和無菌超純水陰性對(duì)照。其中,Premix Ex Taq購自takara-寶生物工程(大連)有限公司。
[0032]2、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)
[0033]樣品檢測使用的是美國伯樂公司iCycleriQ5熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為:第一個(gè)循環(huán)為95°C IOmin ;隨后40個(gè)循環(huán)，95°C 15s,60°C lmin。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化判斷樣品檢測結(jié)果。樣品檢測的Ct值小于40判定為陽性樣品，Ct值大于40或者沒有擴(kuò)增曲線，則判定為陰性樣品。
[0034]實(shí)施例2:`[0035]特異性實(shí)驗(yàn)
[0036]采用本發(fā)明方法中引物SEQ ID N0.U SEQ ID N0.2和探針SEQ ID N0.3建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系對(duì)如表1所示的菌株進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)本發(fā)明中引物、探針及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系的特異性。
[0037]將表1所示的30個(gè)菌株分別在最佳條件下培養(yǎng)，并用無菌超純水調(diào)整其濃度為104-105CFU/mL。將5mL制備好菌體稀釋液樣品置于離心管中，于4°C、6000rpm條件下冷凍離心 IOmin,棄去上清液。加入 20mg/mL of 溶菌酶緩沖液(20mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 2mmol/L EDTA and 1.2%Triton X-100)于37°C水浴中處理30min。按照試劑盒的說明進(jìn)行提取，最后用IOOy L洗脫液溶解提取的樣品。采用核酸滴定儀測定提取DNA的濃度及純度，按照上述方法進(jìn)行樣品的PCR擴(kuò)增檢測，如圖2所示。
[0038]本發(fā)明方法中引物SEQ ID N0.U SEQ ID N0.2和探針SEQ ID N0.3建立的實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測體系對(duì)于 9 株 A.acidoterrestris (DSM-2498, DSM-3922, DSM-3923,DSM-3924, AAT-12, AAT-13, AAT-96, C_16and C-18)的檢測準(zhǔn)確率為 100% ;對(duì)于 A.acidocaldarius(DSM-446, DSM-448, DSM-449 和 DSM-451), A.acidiphilus(DSM-14558), A.contaminans(DSM-17975, YL-5), A.fastidiosus(DSM-17978), A.pomorum (DSM-14955), A.cycloheptanicus(DSM-4006), A.herbarius(DSM-13609), A.hesperidum(DSM-12489), A.sendaiensis(DSM-17614), B.subtilis(DSM-10, YL-3), B.brevis(DSM-30), B.ginsengihumi (DSM-18134, LC-8, BS-2), B.1icheniformis (DSM-13), B.megaterium(DSM-32)等 21 個(gè)菌株的擴(kuò)增曲線均在臨界值以下，說明檢測中存在引物或者探針不匹配，PCR擴(kuò)增表現(xiàn)為陰性結(jié)果。[0039]說明本發(fā)明中引物SEQ ID N0.USEQ ID N0.2和探針SEQ ID N0.3建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系對(duì)于A.acidoterrestris檢測特異性強(qiáng)。采用本發(fā)明建立的PCR體系可以實(shí)現(xiàn)A.acidoterrestris的快速檢測。[0040]實(shí)施例3:[0041]靈敏度實(shí)驗(yàn)[0042]取IOmL A.acidoterrestris標(biāo)準(zhǔn)菌株的增殖培養(yǎng)液(3X 107CFU/mL),用無菌超純水進(jìn)行 10 倍稀釋,其濃度分別為:3X106CFU/mL、3X105CFU/mL、3X104CFU/mL、3X103CFU/mL、3X 102CFU/mL、3X 1iCfUAiLJX 10°CFU/mL。將5mL制備好菌體稀釋液樣品置于離心管中，于4°C、6000rpm條件下冷凍離心IOmin,棄去上清液。加入20mg/mL of溶菌酶緩沖液(20mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 2mmol/L EDTA and 1.2%Triton X-100)于 37°C 水浴中處理30min。按照試劑盒的說明進(jìn)行提取，最后用100 UL洗脫液溶解提取的樣品。采用核酸滴定儀測定提取DNA的濃度及純度，進(jìn)行按照上述方法進(jìn)行樣品的PCR擴(kuò)增檢測。同時(shí)，根據(jù)樣品濃度與Ct值之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)(R2)，斜率(S)和PCR擴(kuò)增效率(E)0不同濃度菌體的PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖3 (a)和圖3 (b)所示。[0043]本發(fā)明方法對(duì)A.acidoterrestris的最低檢測限是3 X 11CFUAiL ;同時(shí)，根據(jù)樣品濃度與Ct繪制獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.998，斜率S=-3.055，PCR擴(kuò)增效率E=112.5%。[0044]結(jié)果表明:采用本發(fā)明方法中引物SEQ ID N0.USEQ ID N0.2和探針SEQID N0.3建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系對(duì)A.acidoterrestris檢測的具有非常高的靈敏度和擴(kuò)增效率，檢測效果好。
【權(quán)利要求】
1.一種酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌檢測用引物，其特征在于，該引物的上游引物序列SEQ IDN0.1和下游引物序列SEQ ID N0.2如下:
SEQ ID N0.1:5’ -TGAGT AACAC GTGGG CAATC TG-3’ ；
SEQ ID N0.2:5’ -CTACC CGTGT ATTAT CCGGC AT-3’。
2.與權(quán)利要求1所述的引物配合使用的探針，其特征在于，該探針的核苷酸序列為SEQID N0.3:5’ -CTTTCAGACTGGAATAAC-3’，該探針一端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。
3.如權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，所述探針的5’端標(biāo)記有6-carboxyf Iuorescein 突光染料,3’端標(biāo)記有 Minor Groove Binder 突光染料。
4.一種酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測方法，其特征在于，該方法以樣品總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ ID N0.1的上游引物和核苷酸序列為SEQ ID N0.2的下游引物以及核苷酸序列為SEQ ID N0.3的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的存在。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應(yīng)過程中的退火溫度為60。。。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是在反應(yīng)體系中加入無菌超純水、2XPremix Ex Taq、上游引物、下游引物、探針和總DNA。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，反應(yīng)條件是25ii L反應(yīng)體系由12.5 u L2 XPremix Ex Taq，0.5 y LlO y M上游引物，0.5 y LlO y M下游引物，1.0 y LlO y M探針,2.0 ii L總模板和8.5 ii L無菌超純水組成。
8.如權(quán)利要求4-7任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為:第一個(gè)循環(huán)為 950C，IOmin ;之后 40 個(gè)循環(huán)，95°C，15s、60°C，Imin0
9.一種用于檢測酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含了引物SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.2。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括核苷酸序列為SEQIDN0.3的探針。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103614470SQ201310603130
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】岳田利, 王周利, 袁亞宏, 蔡瑞, 牛晨 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)