專(zhuān)利名稱(chēng)：采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥中間體技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’ -腺苷酸的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)采用有普通微生物發(fā)酵方法，原料利用率低僅有61. 2%，產(chǎn)品的收得率僅為1.05 ；或者，采用化學(xué)合成方法，但是，采用化學(xué)合成方法所用的部分原料屬于有毒有害物質(zhì)如三鹵氧化磷，使得在生產(chǎn)過(guò)程中易對(duì)人體產(chǎn)生傷害，且產(chǎn)品只能用于生化試劑生產(chǎn)，不能應(yīng)用于食品行業(yè)。傳統(tǒng)生產(chǎn)方法生產(chǎn)的5’-腺苷酸產(chǎn)品中葛根素(HPLC)含量為97. 5%左右，紫外含量(UV)為97%左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用芽孢桿菌生產(chǎn) 5’ _腺苷酸的方法，這種方法生產(chǎn)的5’ -腺苷酸的收得率較高。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’ -腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，(3) 當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40 攝氏度，發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95 1 105 1的比例加入酶試劑；8 16小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。具體地，所述的芽孢桿菌培養(yǎng)基包含蛋白胨20g/L、牛肉浸粉5g/L、氯化鈉5g/L。具體地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖20g/L、酵母抽提物4. Og/L、碳酸鈣5g/L、 硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀1. Og/L、七水硫酸亞鐵0. 01g/L、七水硫酸鎂0. 01g/L。具體地，步驟(3)步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑
100 1的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液， 調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。具體地，步驟(3)步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在27 34攝氏度，發(fā)酵21 23小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑
101 1的比例加入酶試劑；(4) 11 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。具體地，步驟(3)步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5% -32%時(shí)，將 500g腺苷投入3L發(fā)酵液中；發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，在 0.4 0.5小時(shí)后將乙酰磷酸作為酶試劑加入發(fā)酵液中，按照腺苷與酶試劑100 1的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。
一種利用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌， 所述的芽孢桿菌培養(yǎng)基包含蛋白胨20g/L、牛肉浸粉5g/L、氯化鈉5g/L ； (2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖20g/L、酵母抽提物4. Og/L、碳酸鈣5g/L、硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀1. Og/L、七水硫酸亞鐵0. 01g/L、七水硫酸鎂0. 01g/L ； (3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40攝氏度， 發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95 1 105 1的比例加入酶試劑；(4) 8 16 小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’-腺苷酸。具體地，步驟(3)步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5%-32%時(shí)，將 500g腺苷投入3L發(fā)酵液中；發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，在 0.4 0.5小時(shí)后將乙酰磷酸作為酶試劑加入發(fā)酵液中，按照腺苷與酶試劑100 1的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。本發(fā)明的有益效果是經(jīng)上述方法得到的5’ -腺苷酸為5’ -腺苷酸粗品，5’ -腺苷酸粗品按照結(jié)晶程序結(jié)晶，得5’-腺苷酸成品。經(jīng)檢驗(yàn)5’-腺苷酸產(chǎn)品的葛根素(HPLC) 含量為99%，紫外含量(UV)含量為98.5%，5’ -腺苷酸產(chǎn)品的收得率為1. 25，比現(xiàn)有技術(shù)中所采用的普通微生物發(fā)酵方法和化學(xué)合成方法所的產(chǎn)品的收得率均高出很多。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40攝氏度，發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑 95 1 105 1的比例加入酶試劑；(4) 8 16小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱， 經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。實(shí)施例二一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，芽孢桿菌培養(yǎng)基包含蛋白胨20g/L、牛肉浸粉5g/L、氯化鈉5g/L，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40攝氏度，發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95 1 105 1的比例加入酶試劑；(4) 8 16小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。實(shí)施例三一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖20g/L、酵母抽提物4. Og/ L、碳酸鈣5g/L、硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、七水硫酸亞鐵0.01g/L、七水硫酸鎂 0. 01g/L，(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40攝氏度，發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95 1 105 1的比例加入酶試劑；(4) 8 16小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ _腺苷酸。實(shí)施例四一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑100 1 的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。實(shí)施例五一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’ -腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在27 34攝氏度，發(fā)酵21 23小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑 101 1的比例加入酶試劑；(4) 11 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。實(shí)施例六一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5% -32%時(shí)，將500g 腺苷投入3L發(fā)酵液中；發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，在0. 4 0.5小時(shí)后將乙酰磷酸作為酶試劑加入發(fā)酵液中，按照腺苷與酶試劑100 1的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸實(shí)施例七一種利用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌， 所述的芽孢桿菌培養(yǎng)基包含蛋白胨20g/L、牛肉浸粉5g/L、氯化鈉5g/L ； (2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖20g/L、酵母抽提物4. Og/L、碳酸鈣5g/L、硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀1. Og/L、七水硫酸亞鐵0. 01g/L、七水硫酸鎂0. 01g/L ； (3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40攝氏度， 發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95 1 105 1的比例加入酶試劑；(4) 8 16 小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’-腺苷酸。實(shí)施例八一種利用芽孢桿菌生產(chǎn)5’_腺苷酸的方法，(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌， 所述的芽孢桿菌培養(yǎng)基包含蛋白胨20g/L、牛肉浸粉5g/L、氯化鈉5g/L ； (2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖20g/L、酵母抽提物4. 0g/L、碳酸鈣5g/L、硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、七水硫酸亞鐵0. 01g/L、七水硫酸鎂0. 01g/L ； (3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5% -32%時(shí)，將500g腺苷投入3L發(fā)酵液中；發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，在0. 4 0. 5小時(shí)后將乙酰磷酸作為酶試劑加入發(fā)酵液中，按照腺苷與酶試劑100 1的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。經(jīng)上述方法得到的5’ -腺苷酸為5’ -腺苷酸粗品，5’ -腺苷酸粗品按照結(jié)晶程序結(jié)晶，得5，-腺苷酸成品625g。經(jīng)檢驗(yàn)5，-腺苷酸產(chǎn)品的葛根素(HPLC)含量為99%，紫外含量(UV)含量為98. 5%，5’_腺苷酸產(chǎn)品的收得率為1. 25，比現(xiàn)有技術(shù)中所采用的普通微生物發(fā)酵方法和化學(xué)合成方法所的產(chǎn)品的收得率均高出很多。使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的 5’ _腺苷酸產(chǎn)品可直接運(yùn)用與食品行業(yè)。
權(quán)利要求
1.一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，其特征在于(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35% 時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40攝氏度，發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95 1 105 1的比例加入酶試劑；(4)8 16小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，其特征在于所述的芽孢桿菌培養(yǎng)基包含蛋白胨20g/L、牛肉浸粉5g/L、氯化鈉5g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖20g/L、酵母抽提物4. Og/L、碳酸鈣5g/L、硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀1. Og/L、七水硫酸亞鐵0. 01g/L、七水硫酸鎂0. 01g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，其特征在于步驟(3) 步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑100 1的比例加入酶試劑； (4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到 5’ -腺苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，其特征在于步驟(3) 步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在27 34攝氏度，發(fā)酵21 23小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑101 1的比例加入酶試劑；(4) 11 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，其特征在于步驟(3) 步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5%-32%時(shí)，將500g腺苷投入3L發(fā)酵液中； 發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，在0. 4 0. 5小時(shí)后將乙酰磷酸作為酶試劑加入發(fā)酵液中，按照腺苷與酶試劑100 1的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液ra值為酸性后得到5’ -腺苷酸。
7.一種利用芽孢桿菌生產(chǎn)5’ -腺苷酸的方法，其特征在于(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，所述的芽孢桿菌培養(yǎng)基包含蛋白胨20g/L、牛肉浸粉5g/L、氯化鈉5g/L ； (2) 用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖20g/L、酵母抽提物4. 0g/L、碳酸鈣5g/L、硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、七水硫酸亞鐵0. 01g/L、七水硫酸鎂0. 01g/L ；(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28% 35%時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25 40攝氏度，發(fā)酵20 25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95 1 105 1的比例加入酶試劑；(4)8 16小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，其特征在于步驟(3) 步驟(4)具體為(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到30. 5% -32%時(shí)，將500g腺苷投入3L發(fā)酵液中；發(fā)酵液溫度控制在28 35攝氏度，發(fā)酵22 24小時(shí)后，在0. 4 0. 5小時(shí)后將乙酰磷酸作為酶試劑加入發(fā)酵液中，按照腺苷與酶試劑100 1的比例加入酶試劑；(4) 12小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液PH值為酸性后得到5’ -腺苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用芽孢桿菌生產(chǎn)5’-腺苷酸的方法，具體為(1)用芽孢桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，(2)用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵液，(3)當(dāng)芽孢桿菌的菌濃達(dá)到28％～35％時(shí)將腺苷投入發(fā)酵液中，發(fā)酵液溫度控制在25～40攝氏度，發(fā)酵20～25小時(shí)后，按照腺苷與酶試劑95∶1～105∶1的比例加入酶試劑；(4)8～16小時(shí)后壓榨發(fā)酵液，將發(fā)酵液上樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得清液，調(diào)節(jié)清液pH值為酸性后得到5’-腺苷酸。經(jīng)上述方法得到5’-腺苷酸產(chǎn)品的收得率較高。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102329836SQ20111027714
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者丁楠, 劉擁軍, 張軍 申請(qǐng)人:南通香地生物有限公司