人工誘導(dǎo)的mle轉(zhuǎn)座子試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人工誘導(dǎo)Mariner-LikeElement(MLE)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的試劑盒及其在植物基因突變中的應(yīng)用。本發(fā)明的MLE轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座酶由可誘導(dǎo)啟動子調(diào)控，人為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座酶表達(dá)，控制轉(zhuǎn)座子跳躍和再跳躍，一方面解決了突變穩(wěn)定性問題，回復(fù)突變也成為可控，可以在植物生長發(fā)育的任何時期，對植物的不同組織器官進(jìn)行有目的的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座突變，真正實(shí)現(xiàn)了對誘變在時空量上的全面調(diào)控。另外，利用綠色熒光蛋白基因來報(bào)告MLE轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座情況，可以簡便、有效的對轉(zhuǎn)座發(fā)生的植株進(jìn)行篩選和轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)進(jìn)行跟蹤。
【專利說明】人工誘導(dǎo)的MLE轉(zhuǎn)座子試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種人工誘導(dǎo)的Mariner-LikeElement (MLE)轉(zhuǎn)座子試劑盒及其在植物基因突變中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著新技術(shù)新方法的不斷發(fā)展，分析鑒定基因功能的方法越來越多，大規(guī)模研究基因功能主要依賴于構(gòu)建突變體庫，但最直接最有效的方法是構(gòu)建飽和的基因突變?nèi)后w，通過突變體分析鑒定基因功能。因此突變?nèi)后w的構(gòu)建是功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)。隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，通過創(chuàng)造大量的T-DNA獨(dú)立轉(zhuǎn)化子來建立T-DNA突變體庫的方法已成為快速構(gòu)建插入突變體庫的主要方法。T-DNA插入突變具有插入穩(wěn)定、操作簡單，但是易產(chǎn)生直接的串聯(lián)，反向重復(fù)和在邊界產(chǎn)生缺失，影響隨后的分子分析。
[0003]轉(zhuǎn)座子是指在基因組上能從同一條染色體的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置或者從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一條染色體上的一段DNA序列，具有分布廣泛、拷貝數(shù)高、插入位點(diǎn)專一、產(chǎn)生突變穩(wěn)定、不受植物種類差異的影響、異源轉(zhuǎn)座率高、組織培養(yǎng)誘導(dǎo)激活等優(yōu)勢?？梢栽诓涣私饣虍a(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(transposontagging)。其原理是利用植物轉(zhuǎn)座子的插入造成基因突變，以轉(zhuǎn)座子序列為基礎(chǔ)，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的克隆，它必定含有與轉(zhuǎn)座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因組中獲得完整的基因。
[0004]以轉(zhuǎn)座子作標(biāo)簽分離基因有以下優(yōu)點(diǎn):(1)轉(zhuǎn)座子插入引起的突變會由于轉(zhuǎn)座子的切離而回復(fù)。(2)由于轉(zhuǎn)座子總是沿其鄰近的位點(diǎn)轉(zhuǎn)座，因此只要轉(zhuǎn)座子在染色體上定位后，就很容易確定與其連鎖的突變基因的相對位置。(3)由于轉(zhuǎn)座子的不斷跳躍，一旦把轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入目標(biāo)植物，通過自交、雜交、回交等手段便可得到一個較大的含不同插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子群體。(4)把轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入異源植物`不受轉(zhuǎn)化條件的限制。目前利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法成功克隆植物基因目前僅限于Ac/Ds和Spm/dSpm這兩類轉(zhuǎn)座子，這兩類轉(zhuǎn)座子均存在著轉(zhuǎn)座活性不高，突變效率不理想和優(yōu)先轉(zhuǎn)座到與之相臨近位置的問題，是目前利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建隨機(jī)飽和突變體群的主要障礙。因此進(jìn)一步研究、挖掘新的轉(zhuǎn)座子，改進(jìn)試劑盒，達(dá)到最佳標(biāo)簽條件，是當(dāng)前轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法研究的主要任務(wù)。
[0005]Mariner-Like 轉(zhuǎn)座子(Mariner-LikeElements, MLE)是 DNA 轉(zhuǎn)座兀件中一個重要家族，最早是在研究毛里塔尼亞果蜆(Dr ο soph i 1 amaur i s t i ana)白眼基因的一個不穩(wěn)定突變時發(fā)現(xiàn)的。此后在其他動物以及植物基因組中也發(fā)現(xiàn)了大量MLE轉(zhuǎn)座子的存在。MLE轉(zhuǎn)座子通過DNA的切除/粘貼機(jī)制來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座。與其它轉(zhuǎn)座子相比較，MLE轉(zhuǎn)座子有以下三個顯著特點(diǎn):(1)結(jié)構(gòu)簡單，由兩端反向重復(fù)序列(TerminallnvertedRepeats, TIRs)和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因組成，反向重復(fù)序列長度一般為10-40bp。轉(zhuǎn)座酶編碼序列長度一般為1000-1500bp,由DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)座催化域組成。既能催化短至200bp，僅包括TIRs及側(cè)翼序列的DNA片段轉(zhuǎn)座，也能催化攜帶有目的基因(如抗性基因)，長至6000bpDNA片段的轉(zhuǎn)座，因此MLE轉(zhuǎn)座子既可以開發(fā)成基因誘變的突變工具，也可以開發(fā)成轉(zhuǎn)運(yùn)基因的轉(zhuǎn)基因工具。(2)MLE轉(zhuǎn)座子在基因組插入位點(diǎn)接近隨機(jī)，靶向序列為TA，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，MLE轉(zhuǎn)座子80%插入位點(diǎn)位于基因5 ‘端UTR的下游和基因編碼序列，這一特點(diǎn)使MLE轉(zhuǎn)座子在應(yīng)用于基因標(biāo)簽上更優(yōu)越于其他類型的轉(zhuǎn)座子。(3)異源轉(zhuǎn)座率高，絕大部分MLE轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座不依賴于宿主因子，只要有活性轉(zhuǎn)座酶和能被轉(zhuǎn)座酶識別的TIRs存在，就能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座，因此從宿主克隆的轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入非宿主基因組后，依然能夠保持轉(zhuǎn)座活性。因此開發(fā)出基于超活性MLE轉(zhuǎn)座子的高效試劑盒，將為大規(guī)模構(gòu)建植物突變體庫和研究基因功能提供新的工具，使植物基因的分離和鑒定更加簡單易行。查詢以往專利，尚未有利用植物MLE轉(zhuǎn)座子構(gòu)建轉(zhuǎn)座子試劑盒的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]目前利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法成功克隆植物基因目前僅限于Ac/Ds和Spm/dSpm這兩類轉(zhuǎn)座子，這兩類轉(zhuǎn)座子均存在著轉(zhuǎn)座活性不高，突變效率不理想和優(yōu)先轉(zhuǎn)座到與之相臨近位置的問 題，是目前利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建隨機(jī)飽和突變體群的主要障礙。因此進(jìn)一步研究、挖掘新的轉(zhuǎn)座子，改進(jìn)試劑盒，達(dá)到最佳標(biāo)簽條件，是當(dāng)前轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法研究的主要任務(wù)。
[0007]本發(fā)明一方面涉及一種MLE轉(zhuǎn)座子試劑盒，其特征在于包括含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體以及含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉(zhuǎn)座酶序列的載體。
[0008]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，其中含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體是將miniPpMLE21轉(zhuǎn)座子構(gòu)建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉(zhuǎn)座子供體載體 pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21。
[0009]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉(zhuǎn)座酶序列的載體是轉(zhuǎn)座酶序列構(gòu)建到PCAMBIA1301載體上。
[0010]本發(fā)明另一方面還涉及上述MLE轉(zhuǎn)座子試劑盒在誘變轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0011]在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的應(yīng)用包括如下步驟:
[0012](1)將miniPpMLE21轉(zhuǎn)座子構(gòu)建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉(zhuǎn)座子供體載體pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21，轉(zhuǎn)化擬南芥，通過卡那霉素篩選陽性植株；
[0013](2)轉(zhuǎn)座酶序列(SEQIDN0.3)構(gòu)建到pCAMBIA1301載體，獲得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pCAMBIA1301-Tp，轉(zhuǎn)化攜帶有PpMLE21轉(zhuǎn)座子的擬南芥，通過卡那霉素和潮霉素共同篩選陽性植株；
[0014](3)通過提高培養(yǎng)環(huán)境的溫度，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶表達(dá)和轉(zhuǎn)座發(fā)生。
[0015]本發(fā)明的MLE轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座酶由可誘導(dǎo)啟動子調(diào)控，人為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座酶表達(dá)，控制轉(zhuǎn)座子跳躍和再跳躍，一方面解決了突變穩(wěn)定性問題，回復(fù)突變也成為可控，可以在植物生長發(fā)育的任何時期，對植物的不同組織器官進(jìn)行有目的的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座突變，真正實(shí)現(xiàn)了對誘變在時空量上的全面調(diào)控。另外，利用綠色熒光蛋白基因來報(bào)告MLE轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座情況，可以簡便、有效的對轉(zhuǎn)座發(fā)生的植株進(jìn)行篩選和轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)進(jìn)行跟蹤。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:綠色熒光指示轉(zhuǎn)座發(fā)生，其中a，b，c為不同轉(zhuǎn)基因株系綠色熒光觀察。WT為野生型?！揪唧w實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施步驟進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非特別指出，下列實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook.等主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述條件，或按照試劑盒陳述的步驟進(jìn)行操作。
[0018]一、毛竹MLE轉(zhuǎn)座子的獲得
[0019]根據(jù)MLE轉(zhuǎn)座子兩端反向重復(fù)序列，利用引物MLE21(引物詳情見表1)，從毛竹基因組擴(kuò)增出轉(zhuǎn)座子PpMLE21的全長序列，序列為SEQIDN0.11。
[0020]二、擬南芥轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
[0021]1.轉(zhuǎn)座子供體載體 pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21 的構(gòu)建
[0022](1)用BseRI (識別的序列為GAGGAG (N) 10 )切除毛竹PpMLE21轉(zhuǎn)座子全長序列中轉(zhuǎn)座酶的大部分序列，再用連接酶將PPMLE21轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的序列重新連上，命名為miniPpMLE21,(序列為 SEQIDN0.2)；
[0023](2) Xbal 酶切 pBINm-gfp5_ER 載體，將 pBINm-gfp5_ER 載體線性化；
[0024](3)通過in-fusion技術(shù)將miniPpMLE21轉(zhuǎn)座子插入到pBINm-gfp5_ER載體(商購可得)的Xbal酶切位點(diǎn)，獲得重組載體pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21。當(dāng)miniPpMLE21轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座離開，后面的綠色熒光蛋白基因可以正常表達(dá)，可通過綠色熒光蛋白基因表達(dá)與否方便分析轉(zhuǎn)座情況。
[0025]2.轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pCAMBIA1301_hspTp的構(gòu)建
[0026](1)將PART7載體上的基因表達(dá)單元通過sacl和PstI從載體切下來；同時利用sad和PstI將pCAMBIA1301載體(商購可得)線性化；通過連接酶將來源于PART7載體的基因表達(dá)單元插入到PCAMBIA1301載體sacl和PstI兩個酶切位點(diǎn)之間獲得重組載體pCAMBIA1301-ex ；
[0027](2)利用引物MLE21-TP-5和MLE21-TP-3通過PCR技術(shù)將PpMLE21轉(zhuǎn)座酶序列(序列為SEQIDN0.3)兩端添加Sma I和BamH I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增后，用Sma I和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物，同時利用Smal和BamHI酶切pCAMBIA1301_ex載體，通過連接酶將PpMLE21轉(zhuǎn)座酶的cDNA序列引入pCAMBIA1301-ex載體Smal和BamHI兩個酶切位點(diǎn)間，獲得重組載體 pCAMBIA1301-Tp ；
[0028](3)通過PCR技術(shù)將大豆熱激啟動子一Gmhspl7.5C啟動子(序列SEQIDN0.4)從大豆的基因組擴(kuò)增出來(引物為Gmhsp-5和Gmhsp-3)，并引入sacl和ΚρηΙ兩個酶切位點(diǎn)，經(jīng)測序驗(yàn)證后，將Gmhspl7.5C啟動子序列和pCAMBIA1301_Tp載體通過sacl和ΚρηΙ雙酶切，用Gmhspl7.5C啟動子替換pCAMBIA1301_Tp載體轉(zhuǎn)座酶前的35S啟動子，獲得重組載體pCAMBIA1301-hspTp。轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)可以通過環(huán)境溫度來調(diào)控。
[0029]三、擬南芥的轉(zhuǎn)化
[0030]擬南芥種子在8%NaC10乙醇溶液中消毒6_8min，用無水乙醇洗滌待播種種子5次以上，用無棉紙吸干無水乙醇，在超凈工作臺上吹干，將種子均勻播撒在1/2MS培養(yǎng)基上，4°C沉積3天，然后放在擬南芥栽培室光下正常培養(yǎng)(栽培室條件:溫度23°C，濕度60-70%，光強(qiáng)150umol.s-1.m_2)。待一周后長出1對真葉，將擬南芥幼苗移至基質(zhì)中培養(yǎng)3周左右抽薹開花，去掉主薹，大約一周后，抽出的蓮座葉側(cè)枝大量開花，剪掉已經(jīng)結(jié)莢的果莢，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。
[0031]取5mL農(nóng)桿菌(EHA105)加入100mL含50 μ g/mL利福平(Rif )+50 μ g/mL卡納青霉素(Kan )液體 YEP (配方:酵母提取物，10g/L ;蛋白胨，10g/L ;NaCl，5g/L)中，28 °C，180rpm,搖菌過夜使其0D600達(dá)到L 0-1.2,4000rpm,離心15min，棄上清，加入lOOmL浸潤法培養(yǎng)基(l/2MS+5%蔗糖)，并加入表面活性劑Silwet-77，使其終濃度達(dá)0.02%。將重懸的農(nóng)桿菌菌液置于培養(yǎng)皿中，將擬南芥花序完全浸沒在溶液中，保持30s-60s。用保鮮膜保濕，向周轉(zhuǎn)柜中加水，暗室培養(yǎng)24h后，光下正常培養(yǎng)。隔5天左右可對已浸染植株再次浸染，提高轉(zhuǎn)化率。種子成熟后適當(dāng)減少澆水次數(shù)，待種莢發(fā)黃開裂時收獲種子，用于下一代的篩選。
[0032]四、轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選和鑒定
[0033]導(dǎo)入轉(zhuǎn)座子供體載體pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21的擬南芥種子播撒到含50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基中篩選，抗性植株通過PCR驗(yàn)證(引物為MLE21)，能擴(kuò)增出1.2kb左右的目的條帶為陽性植株
[0034]以上述陽性擬南芥植株為受體，繼續(xù)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pCAMBIA1301_hspTp，將收獲的擬南芥種子播撒到含50mg/L卡那霉素+50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基中篩選，轉(zhuǎn)基因抗性植株通過PCR驗(yàn)證(引物為MLETP21-5和MLE21TP-3)，能擴(kuò)增出1.5kb左右的目的條帶為陽性植株，該陽性轉(zhuǎn)基因植株命名為雙陽性植株。
[0035]五、轉(zhuǎn)座誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)座事件的鑒定
[0036]( 1)雙陽性植株的轉(zhuǎn)座誘導(dǎo)
[0037]42°C連續(xù)熱激兩次雙陽性植株的幼苗，每次2小時可以誘導(dǎo)最高的轉(zhuǎn)座活性。然后放在21°C恢復(fù)培養(yǎng)，同時增加 培養(yǎng)環(huán)境的濕度，兩天后在突光顯微鏡下觀察突光。
[0038](2)綠色熒光觀察
[0039]取擬南芥新鮮的葉片，手工撕成0.1-1.0mm薄片，將熒光顯微鏡的光源波長調(diào)到477nm處，觀察綠色熒光的位置。有綠色熒光點(diǎn)的細(xì)胞表明有轉(zhuǎn)座發(fā)生。從圖1中可以看出和野生型相比，經(jīng)過高溫誘導(dǎo)后，可看到大量發(fā)生轉(zhuǎn)座的細(xì)胞(綠色熒光的部分)。這說明，構(gòu)建的Mariner-LikeElement (MLE)轉(zhuǎn)座子試劑盒可以在人工誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)座，并保持較高的轉(zhuǎn)座效率。
[0040]表1引物表
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種MLE轉(zhuǎn)座子試劑盒，其特征在于包括含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體以及含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉(zhuǎn)座酶序列的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體是將miniPpMLE21轉(zhuǎn)座子構(gòu)建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉(zhuǎn)座子供體載體pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述的含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉(zhuǎn)座酶序列的載體是轉(zhuǎn)座酶序列構(gòu)建到PCAMBIA1301載體上。
4.上述MLE轉(zhuǎn)座子試劑盒在誘變轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用包括如下步驟:(1)將miniPpMLE21轉(zhuǎn)座子構(gòu)建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉(zhuǎn)座子供體載體pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21，轉(zhuǎn)化擬南芥，通過卡那霉素篩選陽性植株；(2)轉(zhuǎn)座酶序列(SEQIDN0.3)構(gòu)建到pCAMBIA1301載體，獲得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pCAMBIA1301-Tp，轉(zhuǎn)化攜帶有PpMLE21轉(zhuǎn)座子的擬南芥，通過卡那霉素和潮霉素共同篩選陽性植株；(3 )通過提高培養(yǎng)環(huán)境的溫·度，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶表達(dá)和轉(zhuǎn)座發(fā)生。
【文檔編號】C12N15/11GK103710342SQ201310698907
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】周明兵, 湯定欽, 楊萍, 鄭麗娜 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)