一種利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法
【專利摘要】一種利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，利用從牛瘤胃中篩選的產琥珀酸放線桿菌菌株Actinobacillus?succinogenes?CCTCC?M2011399，在含CO2或N2的厭氧條件下，加水調節(jié)甘蔗汁的總糖濃度在50-100g/L，分批或分批補料發(fā)酵產丁二酸，發(fā)酵30-60h，丁二酸濃度可達30-75g/L，糖的利用率為85%-92%，生產強度達到0.73-1.46g/(L·h)，本發(fā)明的突出優(yōu)點是利用甘蔗汁原料替代昂貴的葡萄糖作為碳源發(fā)酵生產丁二酸，利用可再生生物質資源，對環(huán)境友好，可緩解化學合成丁二酸的石化資源緊張問題。
【專利說明】一種利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術領域】，具體涉及一種利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，同時涉及產琥拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)在以甘鹿汁為原料制備丁二酸的方法的應用。
【背景技術】
[0002]丁二酸,又稱琥拍酸(succsinic acid),是一種常見的天然有機酸,廣泛存在于動、植物和微生物體內，是生物進行TCA循環(huán)的中間產物之一。丁二酸是一種重要的有機合成中間體，被美國FDA認定為GRAS，一般認為安全，主要應用于食品、醫(yī)藥、生物降解塑料、表面活性劑、洗滌劑、和綠色溶劑等領域。此外，丁二酸還可以用作動物飼料添加劑和植物生長刺激劑等方面。
[0003]目前，丁二酸生產主要是利用化學合成的方法，從丁烷通過順式丁烯二酐生產琥珀酸，主要由石蠟氧化法、輕油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氫等方法。以化學方法生產丁二酸，需要消耗大量不可再生的石化原料，生產成本高，環(huán)境污染嚴重，從而限制了琥珀酸的廣泛應用。因此，人們開始將目標轉向通過生物發(fā)酵法來生產琥珀酸。與傳統(tǒng)的化學合成法相比，發(fā)酵法具有成本低、環(huán)境效益好等優(yōu)點，而且開辟了溫室氣體二氧化碳應用的新途徑。目前，通過發(fā)酵法生產得到的琥珀酸，其價格大約為0.55~1.1 $ /kg ο另外，據Bio-amber公司稱，琥珀酸具有25億歐元的市場，且生物法生產琥珀酸能夠與石化的方法相競爭，并計劃于2011前利用植物作為原料進行工業(yè)生產琥珀酸。
[0004]丁二酸是許多嚴格厭氧菌和兼性厭氧菌代謝的重要中間產物。目前人們已經發(fā)現(xiàn)多種微生物可以通過發(fā)酵來生產琥珀酸，其中研究主要集中在大腸桿菌(E.coli)，曼海姆產玻拍酸菌(Mannheimia su`cciniciproducens),產玻拍酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)和產玻拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)。此外，一些乳酸菌、丙酸產生菌及真菌等也可以產生少量丁二酸。在眾多的產琥珀酸微生物中，瘤胃微生物產琥珀酸放線桿菌能夠利用多種糖類進行發(fā)酵，并且可以耐受葡萄糖和琥珀酸的濃度分別高達158g/L和104g/L;同時，該菌以其高產量、高耐受性等優(yōu)勢，成為最具發(fā)展前景的琥拍酸產生菌之一。
[0005]目前，有關發(fā)酵法產丁二酸的培養(yǎng)基所用的碳源除葡萄糖外，主要為糧食原料，如美國Argorme實驗室進行了玉米牛.產丁二酸研究(www.1pd.anl.gov/biotech/index.html,2002),日本味之素和三菱化學公司共同聯(lián)合開展以玉米淀粉為原料發(fā)酵生產丁二酸的石開究(http: //www.biol68.com, 2005X
[0006]但由于近幾年糧食原料的生物工業(yè)的蓬勃發(fā)展，糧食出現(xiàn)短缺，價格上漲趨勢明顯，此外過度依賴糧食也會影響國家的糧食安全，所以使用價格低廉的非糧原料進行丁二酸發(fā)酵是降低丁二酸生產成本及產業(yè)化的關鍵。
[0007]有關非糧原料生產丁二酸研究國內外有一些報道，韓國Lee PC報道了以Manheimia succiniciprducens MBEL55E發(fā)酵乳清原料產丁二酸，日本科學家Inui等利用纖維素水解液生產丁二酸，江南大學孫志浩等人以糖蜜、芭蕉芋等原料進行了發(fā)酵丁二酸研究，南京工業(yè)大學姜岷及合肥工業(yè)大學姜紹通課題組對纖維素原料產丁二酸進行報道，廣西科學院黃日波課題組以木薯為原料產丁二酸進行了研究。目前，以甘蔗汁為原料生產丁二酸研究還未見報道。
[0008]甘鹿是甘鹿屬(Saccharum)的總稱,屬C4植物,它具有很高的光合速率,是傳統(tǒng)的非糧作物、含糖高、產量高。甘蔗汁即為甘蔗壓榨之后產生的汁液，含糖量一般15-20%，此外還含有天門冬酸、天門冬氨酸、丙氨酸、檸檬酸、維生素A、維生素C、尼克酸、核黃素及鐵、鈣、磷、錳、鋅等營養(yǎng)物質。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術存在的問題，提供一種利用甘蔗汁原料發(fā)酵生產丁二酸的方法，同時提供甘蔗汁在制備丁二酸中的應用及產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succingenes)在以甘鹿汁為原料制備丁二酸的方法中的應用。
[0010]本發(fā)明通過以下技術方案達到上述目的:一種利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，包括以下步驟:
[0011]1、一種利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0012]I)將甘蔗莖桿榨汁得到甘蔗汁，將新鮮的甘蔗汁直接用于配置培養(yǎng)基或置于-20°c冰箱備用；
[0013]2)將新鮮或解凍后的甘蔗汁加水調整糖至50-100g/L，加入氮源、無機鹽、pH緩沖 劑配置成丁二酸發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0014]3)將平板上的的產琥拍放線桿菌(Actinobacillus succinogenes) GXAS137接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-20h。
[0015]所述的產琥拍放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)GXAS137,為本實驗從肉牛瘤胃中篩選獲得，于2011年11月18日保藏于中國武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保存編號為CCTCC M2011399，中國專利CN102851224A已公開。
[0016]所述的種子培養(yǎng)基的成分及其濃度為:糖類10_20g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-10g/L, NaHC035-10g/L, NaH2P049.6g/L, K2HPO4L 55g/L。
[0017]4)將培養(yǎng)好的產琥珀酸放線桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5-10% (V/V)，在充滿N2或CO2的環(huán)境中發(fā)酵，pH緩沖劑調節(jié)pH在6.0-7.0,并在30_38°C發(fā)酵30_60h，即可得到丁二酸。
[0018]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其濃度為:總糖40_100g/L，氮源10_40g/L，K2HP04l-5g/L, CaCl20.5-lg/L, NaCl0.5_2g/L，(NH4)2SO40.5_2g/L，MgCl20.5-lg/L。
[0019]所述的pH緩沖劑是碳酸鹽、氨水、NaOH，所述的碳酸鹽為堿式碳酸鎂或碳酸鈉，所述的發(fā)酵條件為有氧或通入N2或C02。優(yōu)選方案為堿式碳酸鎂調節(jié)發(fā)酵pH，通入CO2 ;如采用氨水、NaOH等堿性調節(jié),必須通入CO2。
[0020]所述的氮源包括有機氮源和無機氮源；所述的有機氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米漿、豆餅粉，所述的無機氮源包括尿素、硫酸銨。
[0021]所述的發(fā)酵方式可采用分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。
[0022]分析方法:[0023]樣品處理:發(fā)酵液在室溫下12000r/min，離心lOmin，取上清，然后用孔徑為0.22 μ m的無菌濾膜過濾，用高效液相色譜(HPLC)檢測發(fā)酵液丁二酸及殘還原糖濃度。
[0024]有機酸測定:HPLC法，戴安Utimat3000，自動進樣器，色譜柱:AminexHPX-87H300X7.8mm，流動相 5mmol/L H2SO4, ρΗ2.5，柱溫 45°C，進樣量 IOuL,流速
0.6mL/min,紫外檢測器波長210nm。
[0025]殘還原糖測定:3，5- 二硝基水楊酸法(DNS)，測定時以葡萄糖為標準物質。
[0026]殘總糖測定:采用酸水解后測定還原糖含量，測定時以葡萄糖為標準物質。
[0027]生物量測定:米用分光光度計(DU800UV/VISSpectrophotometer, Beckman, USA)在660nm進行測定，樣品先用0.2M HCl進行處理，溶解所含的MgCO3,12000r/min離心lOmin，再用蒸餾水洗三次，以除去所含的色素及雜質。
[0028]丁二酸產率(％)定義為每消耗Ig葡萄糖所產生丁二酸的克數。
[0029]本發(fā)明的突出優(yōu)點和有益效果:
[0030]1、以甘蔗汁為原料發(fā)酵生產丁二酸，丁二酸濃度可達30_75g/L，糖的利用率為85%-92%，生產強度達到 0.73-1.46g/ (L.h);
[0031]2、利用廉價的甘蔗汁原料替代昂貴的葡萄糖或糧食作物為碳源發(fā)酵生產丁二酸，一方面能節(jié)約大量糧食，保障我國的糧食安全，同時可減少發(fā)酵中氮源使用量，降低丁二酸生產成本；另一方面可以調節(jié)糖價，保障農民權益。
[0032]3、利用可再生生物質資源生產丁二酸，還可緩解化學合成丁二酸的石化資源緊張問題，而且對環(huán)境友好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1是本發(fā)明采用1.3L發(fā)酵罐分批發(fā)酵甘蔗汁產丁二酸的發(fā)酵結果圖。
【具體實施方式】
[0034]以下是本發(fā)明所述的利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法的具體實施例，但對本發(fā)明沒有限制。
[0035]實施例1
[0036]不同初始總糖濃度對甘蔗汁發(fā)酵產丁二酸的影響
[0037]將產琥珀放線桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱或普通培養(yǎng)箱中30-38°C靜止培養(yǎng)18-20h，按8%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，裝液量為1501^，堿式碳酸鎂調節(jié)？!1在6.0-7.0，置于厭氧培養(yǎng)箱中371:發(fā)酵48-6011。厭氧箱培養(yǎng)條件:厭氧箱(Don Whitley Scientific DG250anaerobic workstation),混合氣N2:C02:H2=8.5:1.0:0.5，溫度37°C。實驗結果如表1。
[0038]表1不同甘蔗汁初始總糖濃度對丁二酸產量的影響
[0039]
【權利要求】
1.一種利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將甘蔗莖桿榨汁得到甘蔗汁，將新鮮的甘蔗汁直接用于配置培養(yǎng)基或置于-20°C冰禮備用; 2)將新鮮或解凍后的甘蔗汁加水調整糖至50-100g/L，加入氮源、無機鹽、pH緩沖劑配置成丁二酸發(fā)酵培養(yǎng)基； 3)將平板上的產琥拍放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)接入種子培養(yǎng)基中，在厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-20h， 所述的種子培養(yǎng)基的成分及其濃度為:糖類10_20g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-10g/L, NaHC035-10g/L, NaH2P049.6g/L, K2HPO4L 55g/L, 4)將培養(yǎng)好的產琥珀酸放線桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5-10V/V%，在充滿N2或CO2的環(huán)境中發(fā)酵，pH緩沖劑調節(jié)pH在6.0-7.0,并在30_38°C發(fā)酵30_60h，即可得到丁二酸， 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其濃度為:總糖40-100g/L，氮源10-40g/L，K2HP04l-5g/L，CaCl20.5-lg/L, NaCl0.5_2g/L，(NH4)2SO40.5_2g/L，MgCl20.5-lg/L。
2.根據權利要求1所述的利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于，所述的pH緩沖劑是碳酸鹽、氨水、NaOH，所述的碳酸鹽為堿式碳酸鎂或碳酸鈉。
3.根據權利要求1所述的利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于，所述的氮源包括有機氮源和無機氮 源；所述的有機氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米漿、豆餅粉，所述的無機氮源包括尿素、硫酸銨。
4.根據權利要求1所述的利用甘蔗汁發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵方式采用分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。
【文檔編號】C12P7/46GK103695481SQ201310733205
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權日:2013年12月26日
【發(fā)明者】申乃坤, 王青艷, 黃日波, 秦艷, 廖思明, 朱婧, 朱綺霞, 米慧芝, 劉海余 申請人:廣西科學院