一種含內(nèi)參照的高靈敏Epstein-Barr病毒熒光定量PCR試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種利用熒光PCR技術(shù)定量檢測(cè)Epstein-Barr病毒（EBV）核酸的試劑盒。它采用一對(duì)引物擴(kuò)增EBV特異性核酸序列，并通過(guò)熒光探針定量檢測(cè)EBVDNA；同時(shí)用人內(nèi)源性基因特異性引物和熒光探針檢測(cè)內(nèi)參照DNA。本發(fā)明通過(guò)單管雙波長(zhǎng)熒光PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)EBV和內(nèi)參照核酸的存在，能定量檢測(cè)全血、血漿、鼻咽分泌物樣品中EBVDNA，通過(guò)內(nèi)參照核酸的檢測(cè)結(jié)果判斷樣品是否存在PCR抑制劑或檢測(cè)誤操作引起的模板丟失。試劑盒操作簡(jiǎn)便快速、定量結(jié)果靈敏準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于臨床EBV病毒感染的定量檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種含內(nèi)參照的高靈敏Epste i n-Barr病毒熒光定量PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含內(nèi)參照的Epstein-Barr病毒(EBV)單管雙波長(zhǎng)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]Epstein-Barr病毒(EBV)是英國(guó)病毒學(xué)家于1964年從Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系中分離到的病毒，為皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的DNA病毒。它在人群中具有廣泛的傳染性，傳播途徑主要為唾液，也可經(jīng)輸血傳染，大多數(shù)人的初次感染發(fā)生在幼兒時(shí)期，且多數(shù)感染后無(wú)明顯癥狀，或引起輕癥咽炎和上呼吸道感染，但終生攜帶病毒，據(jù)研究95%以上成人有該病毒攜帶。本病毒是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原，尤為重要的是，由于它與在我國(guó)南方發(fā)病率相當(dāng)高的鼻咽癌以及非洲兒童淋巴瘤、的發(fā)生有密切的相關(guān)性，被列為可能致癌的人類(lèi)腫瘤病毒之一。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，潛伏在體內(nèi)淋巴組織中的EBV再度活躍而形成復(fù)發(fā)感染，臨床癥狀以發(fā)熱、咽喉痛、肝脾和淋巴結(jié)腫大、外周血淋巴細(xì)胞增多并出現(xiàn)單核樣異型淋巴細(xì)胞等為其特征。由于其癥狀、體征的多樣化和不典型病例在臨床上逐漸增多，給診斷治療帶來(lái)一定困難。因此，準(zhǔn)確的檢測(cè)EBV感染，以區(qū)別其它感染原因(巨細(xì)胞病毒、腺病毒、肺炎支原體、風(fēng)疹病毒均可有類(lèi)似癥狀)所致疾病，就顯得非常重要。
[0003]目前臨床上檢測(cè)EBV的方法有病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)、抗體檢測(cè)、熒光定量PCR等。對(duì)于EBV急性感染如傳染性單核細(xì)胞增多癥，最早出現(xiàn)于臨床標(biāo)本中的是病原體本身，采用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行檢測(cè)全血、血漿等類(lèi)型標(biāo)本，可以在感染的早期明確病因，相對(duì)其它檢測(cè)方法具有檢測(cè)窗口期短的優(yōu)勢(shì)；對(duì)鼻咽癌患者樣本進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)還能對(duì)病毒核酸進(jìn)行定量分析，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)(Jebbink J et al, J MolDiagn, 2003，5:15-20 ;曹素梅等，癌癥，2002，21:328-329)。 但是目前用于EBV熒光定量檢測(cè)的方法均沒(méi)有使用內(nèi)參照監(jiān)控核酸提取擴(kuò)增中可能的PCR抑制物(Hill CE et al,Am J Clin Pathol，2006，125:665-67 ;劉滌瑕等，現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24:93-95 ;專(zhuān)利CN201110165106、CN201110373390、CN201110177104)，當(dāng)全血、血漿或鼻咽拭子中的 PCR 抑制物帶入擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)時(shí)，容易造成病毒核酸定量結(jié)果不準(zhǔn)備甚至出現(xiàn)“假陰性”現(xiàn)象，影響病毒感染后的藥物治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種單管檢測(cè)Epstein-Barr病毒(EBV)核酸的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒反應(yīng)體系同時(shí)采用一對(duì)EBV特異性引物和熒光探針、一對(duì)內(nèi)參照特異性引物和熒光探針，EBV上下游引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列，EBV熒光探針具有SEQ ID NO:3序列且其5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)；內(nèi)參照上下游引物具有SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5的序列，內(nèi)參照熒光探針具有SEQ ID NO:6序列且其5’端標(biāo)記HEX或JOE或VIC熒光基團(tuán)；上述引物探針序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。本發(fā)明引入的內(nèi)參照可以用于監(jiān)控PCR擴(kuò)增中可能的反應(yīng)抑制物或從提取到或者全過(guò)程的誤操作，可通過(guò)稀釋提取的模板或改進(jìn)樣本處理方法復(fù)檢獲得正確結(jié)果，從而避免檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性的作用，確定樣本是否存在EBV病毒核酸和準(zhǔn)確載量，適合臨床推廣使用。
[0005]技術(shù)方案
通過(guò)對(duì)GenBank中EBV病毒和人內(nèi)源性管家(House-keeping)基因序列查詢(xún),用VectorNTI,Oligo等軟件對(duì)各種來(lái)源的基因序列進(jìn)行比對(duì)設(shè)計(jì)，按照TaqMan熒光PCR設(shè)計(jì)的原則，優(yōu)選了一對(duì)EBV特異性引物和熒光探針擴(kuò)增EBV中高度保守、多拷貝重復(fù)基因(BamH1-W)上的 115bp 片段，一對(duì)人 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因特異性引物和熒光探針擴(kuò)增其保守區(qū)域144bp片段，6條引物和探針核苷酸序列(5’ -> 3’)如下:
EBV 上游引物:CCCATAgACTCCCATgTAAgC，序列記為 SEQ ID NO:1。
[0006]EBV 下游引物=CCCTggACATCTggACAAAg，序列記為 SEQ ID NO:2。
[0007]EBV 熒光探針=CgAgTAggTgCCTCCAgAgCC，序列記為 SEQ ID NO:3，其中探針 5’ 端標(biāo)記 FAM (6-carboxy-fluorescein)突光基團(tuán)、3’端標(biāo)記 TAMRA (5-Carboxy-tetramethyl-rhodamine)或 BHQ-1 (Black hole quencher I)淬滅基團(tuán)。
[0008]內(nèi)參照上游引物=TgCTTTTAACTCTggTAAAgTgg，序列記為SEQ ID NO:4。
[0009]內(nèi)參照下游引物:ATgACAAgCTTCCCgTTCTC，序列記為SEQ ID NO:5。
[0010]內(nèi)參照熒光探針:TTgTTgCCATCAATgACCCCTTCA，序列記為SEQ ID NO:6，其中探針5 ’ 端標(biāo)記 JOE (5-dichloro-dimethoxy-fluorescein)或 HEX (5-hexachloro-fIuorescein)或VIC熒光基團(tuán)、3’端標(biāo)記TAMRA或BHQ-1淬滅基團(tuán)。
[0011]EBV檢測(cè)靶序列選擇病毒基因組中的多拷貝重復(fù)序列基因，有利于提高試劑盒檢測(cè)靈敏度；上述引物探針序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
[0012]所述擴(kuò)增反應(yīng)體系各成分組成如下:10mM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、0.2mMdNTPs、1.5~5 mM MgCl2、各0.1~0.5μΜ EBV和內(nèi)參照引物和熒光探針(SEQ ID NO:1 ~6)、1~5 U Taq DNA聚合酶和0.01~I U UNG酶，提取的模板10 μ 1，總反應(yīng)體積30 μ I。更具體的，擴(kuò)增反應(yīng)液各成分終濃度為:Tris-HCl (pH8.3)10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM、MgCl2 3.5 mM、EBV引物和熒光探針各0.3 μ M、內(nèi)參照引物和熒光探針各 0.15 μ M、Taq DNA 聚合酶 2 U、UNG 酶 0.5 U。
[0013]所述EBV熒光定量PCR試劑盒使用擴(kuò)增程序如下:50°C 2min、94°C 5min后按照94°C 10sec、60°C 45sec循環(huán)擴(kuò)增45次，循環(huán)步驟中60°C時(shí)采集FAM和JOE波長(zhǎng)熒光信號(hào)。
[0014]所述EBV熒光定量PCR試劑盒包括I個(gè)陰性對(duì)照、5個(gè)線(xiàn)性梯度濃度的EBV核酸定量校準(zhǔn)品，5 個(gè)校準(zhǔn)品 EBV 濃度分別為 2.0xlO7 copy/ml、2.0xlO6 copy/ml>2.0xlO5 copy/ml、2.0xlO4 copy/ml,2.0xlO3 copy/ml，校準(zhǔn)品為含有EBV病毒擴(kuò)增片段的人工構(gòu)建培養(yǎng)的假病毒，這5個(gè)呈濃度梯度的校準(zhǔn)品在使用時(shí)用于制備EBV DNA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0015]所述EBV熒光定量PCR試劑盒還包括基于磁珠法核酸梯度的病毒DNA提取試劑，在核酸提取儀上實(shí)現(xiàn)樣本核酸自動(dòng)化提取。
[0016]通過(guò)上述設(shè)計(jì)優(yōu)選獲得的一對(duì)EBV引物和熒光探針、一對(duì)內(nèi)參照引物和熒光探針，本發(fā)明提供了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的試劑盒，優(yōu)化了 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。當(dāng)然本研究領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)熒光PCR的一般要求可以調(diào)整PCR反應(yīng)體系和程序，也同樣能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的目的。
[0017]有益效果
本發(fā)明根據(jù)上述設(shè)計(jì)的引物探針和技術(shù)方案，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件研制成EBV核酸熒光PCR定量檢測(cè)試劑盒，其主要特點(diǎn)如下:
(I)設(shè)計(jì)的EBV引物探針檢測(cè)病毒中的多拷貝重復(fù)序列基因，提高了試劑盒檢測(cè)靈敏度。
[0018](2)引入的內(nèi)參照能監(jiān)控反應(yīng)體系中是否存在因PCR抑制物等引起的假陰性，可以避免檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確造成的誤診。
[0019](3)試劑盒使用了非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)參，EBV和內(nèi)參照基因序列特異、兩種熒光探針采用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記，熒光信號(hào)之間不會(huì)相互干擾，保證了檢測(cè)特異性。
[0020](4)擴(kuò)增體系中的dUTP - UNG酶系統(tǒng)更進(jìn)一步避免了因擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的結(jié)果假陽(yáng)性。
[0021 ] (5)試劑盒采用磁珠法自動(dòng)化提取樣本核酸、單管同時(shí)檢測(cè)EBV和內(nèi)參照，操作簡(jiǎn)便快速，可在2小時(shí)內(nèi)報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。
[0022]試劑盒的上述特點(diǎn)，均為采用特異性設(shè)計(jì)的EBV和內(nèi)參照引物探針并與熒光PCR技術(shù)組合應(yīng)用而直接引起。從原理上說(shuō)，本發(fā)明試劑盒在EBV病原體臨床樣本檢測(cè)中通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增兩個(gè)通道熒光信號(hào)的分析，判斷EBV核酸特異性片段的存在和病毒載量，本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)計(jì)合理，可以廣泛應(yīng)用于臨床EBV病毒感染的定量檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)技術(shù)常識(shí)對(duì)本發(fā)明作各種技術(shù)性改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0024]實(shí)施例1:EBV核酸熒光PCR定量檢測(cè)試劑盒引物探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)的EBV、GAPDH基因序列，采用Vector NT1、01igo等引物設(shè)計(jì)軟件，優(yōu)選獲得的引物探針序列如表1所示，EBV引物擴(kuò)增的是該病毒BamH1-W基因上115bp片段、內(nèi)參照引物擴(kuò)增的是人GAPDH基因上的144bp片段。
[0025]表1設(shè)計(jì)的試劑盒EBV和內(nèi)參照檢測(cè)弓丨物探針
【權(quán)利要求】
1.一種單管檢測(cè)Epstein-Barr病毒(EBV)核酸的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒反應(yīng)體系同時(shí)采用一對(duì)EBV特異性引物和熒光探針、一對(duì)內(nèi)參照特異性引物和熒光探針，EBV上下游引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列，EBV熒光探針具有SEQ ID NO:3序列且其5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)；內(nèi)參照上下游引物具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的序列，內(nèi)參照熒光探針具有SEQ ID NO:6序列且其5’端標(biāo)記JOE或HEX或VIC熒光基團(tuán)；上述引物探針序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的EBV熒光定量PCR試劑盒，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系各成分組成如下:IOmM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、0.2mM dNTPs、1.5~5 mM MgCl2、各 0.I ~0.5 μ M 具有上述SEQ ID NO:1~6序列的EBV和內(nèi)參照引物和熒光探針、I~5 U Taq DNA聚合酶和0.01~I U UNG酶，提取的模板10 μ 1，總反應(yīng)體積30 μ I。
3.如權(quán)利要求1所述的EBV熒光定量PCR試劑盒，更具體地，其擴(kuò)增反應(yīng)液各成分終濃度為:Tris-HCl (pH8.3) 10 mM, KCl 50 mM，dATP、dGTP、dVP、dUTP 各 0.2 mM, MgCl2 3.5mM，EBV引物和熒光探針各0.3 μ M，內(nèi)參照引物和熒光探針各0.15 μ M,Taq DNA聚合酶2U, UNG 酶 0.5 U。
4.如權(quán)利要求1所述的EBV熒光定量PCR試劑盒，使用的擴(kuò)增程序如下:50°C2min、94°C 5min后按照94°C 10sec、60°C 45sec循環(huán)擴(kuò)增45次，循環(huán)步驟中60°C時(shí)采集FAM和JOE波長(zhǎng)熒光信號(hào)。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，包括I個(gè)陰性對(duì)照、5個(gè)濃度梯度的EBV核酸定量校準(zhǔn)品，5 個(gè)校準(zhǔn)品 EBV 濃度分別為 2.0xlO7 copy/ml>2.0xlO6 copy/ml>2.0xlO5 copy/ml、2.0xlO4 copy/ml、2.0xlO3 copy/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，還包括病毒DNA提取試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103642945SQ201310742857
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】吳大治, 夏懿, 吳梅 申請(qǐng)人:上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司