用于建立人工多能干細胞的高效方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了iPS細胞的產(chǎn)生方法以及用于改進iPS細胞建立效率的方法，其每一種涉及將 (1) 攜帶核重編程因子的附加型載體和 (2) 不同于附加型載體(1)且攜帶EBNA-1的附加型載體引入體細胞的步驟。還提供：iPS細胞建立效率改進試劑，其包含攜帶編碼EBNA-1的核酸的附加型載體；以及用于產(chǎn)生iPS細胞的試劑盒，其包含攜帶編碼核重編程因子的核酸的附加型載體。
【專利說明】用于建立人工多能干細胞的高效方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及有效建立誘導多能干（以下被稱為iPS)細胞的方法和用于其的試劑 等。更具體地，本發(fā)明涉及iPS細胞的產(chǎn)生方法，其包括將以下引入體細胞的步驟，（1)含 有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體；和（2)不同于（1)的含有編碼EBNA-I的核酸 的附加型載體，和進一步，當期望時，含有編碼P53功能的抑制劑的核酸的附加型載體。本 發(fā)明還涉及用于改進iPS細胞建立效率的試劑，其包含含有編碼EBNA-I的核酸的附加型載 體，等。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，小鼠和人iPS細胞已相繼地建立。Yamanaka等人通過將0ct3/4、Sox2、 Klf4和c-Myc基因轉(zhuǎn)入來自小鼠和人的成纖維細胞內(nèi)而誘導iPS細胞（專利文獻1和非專 利文獻1和2)。另一方面，Thomson等人組使用Nanog和Lin28替代Klf4和c-Myc產(chǎn)生人 iPS細胞（專利文獻2和非專利文獻3)。
[0003] 已經(jīng)進行了各種嘗試來增強iPS細胞建立效率。其中之一是優(yōu)化重編程因子的組 合。本發(fā)明人報道，iPS細胞建立的效率可以通過使用0ct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28 的5種因子的組合作為重編程因子并通過RNAi技術(shù)敲低p53的表達而顯著地改進（專利 文獻3和非專利文獻4)。一些人認為，期望的是，避免抑制癌抑制基因 p53,即使是瞬時的， 特別是考慮將人iPS細胞應(yīng)用于再生醫(yī)學時，因為應(yīng)當盡可能降低腫瘤化風險。另一方面， Maekawa等人報道，與使用OSK的3種因子相比，iPS細胞建立的效率可以通過將Glisl與 0ct3/4、Sox2和Klf4 (OSK) -起引入體細胞而更顯著地改進（專利文獻4和非專利文獻 5)。此外，Maekawa 等人報道，通過使用 0ct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28 和 Gl i s I (OSKULG) 的6種因子建立人iPS細胞的效率是p53 shRNA與0ct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28 (OSKUL)的5種因子的組合的效率的約2倍（美國臨時專利申請?zhí)?1/521，153)。
[0004] 逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等的病毒載體具有相比于非病毒載體高的轉(zhuǎn)基因效率，因此， 是優(yōu)異的載體，因為它們可以容易產(chǎn)生iPS細胞。然而，因為逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒被并入染 色體中，所以考慮到iPS細胞的臨床應(yīng)用，它們具有安全性問題。盡管已經(jīng)報道了通過使用 非病毒載體諸如腺病毒載體、質(zhì)粒等而無需并入染色體的iPS細胞（非專利文獻6-8)，但建 立效率相比于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒低。此外，將重編程因子并入染色體的穩(wěn)定表達株系以 特定頻率獲得，甚至當使用通常被認為對并入有抗性的附加型載體時，這可能是由于在選 擇iPS細胞下所要求的重編程因子的持續(xù)高表達（非專利文獻7和9)。
[0005] 另一方面，使用在染色體外可穩(wěn)定且自主復制的附加型載體的方法顯示上述iPS 細胞建立的低效率，由于藥物選擇中止而導致載體的自發(fā)消失的低頻率，并且需要長時間 (非專利文獻8)。因此，期望在短時間內(nèi)有效去除載體連同改進iPS細胞建立效率的方 法。在這方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了從細胞迅速脫落的早期自消失載體，并且已經(jīng)報道了該載體 (專利文獻3、非專利文獻4和美國臨時專利申請?zhí)?1/521，153)。
[0006] 然而，與使用其它載體的方法相比，使用附加型載體的方法與從特定細胞（例如， 血細胞）的極低iPS細胞建立效率的問題相關(guān)。由于血細胞是非?？捎糜跇?gòu)建iPS細胞庫 的體細胞來源之一，所以能夠有效建立iPS細胞的附加型載體方法，不論細胞種類，一直是 期望的。
[0007] [文獻列表]
[專利文獻] 專利文獻 I: WO 2007/069666 專利文獻 2: WO 2008/118820 專利文獻 3: WO 2011/016588 專利文獻 4: WO 2011/102531 [非專利文獻] 非專利文獻 I: Takahashi, K.和 Yamanaka, S·，Cell, 126: 663-676 (2006) 非專利文獻 2: Takahashi, Κ·等人，Cell, 131: 861-872 (2007) 非專利文獻 3: Yu, J.等人，Science, 318: 1917-1920 (2007) 非專利文獻 4: Okita, Κ·等人，Nature Methods, 8(5)，409-412 (2011) 非專利文獻 5: Maekawa, Μ·等人，Nature, 474: 225-229 (2011) 非專利文獻 6: Stadtfeld, Μ·等人，Science, 322: 945-949 (2008) 非專利文獻 7: Okita, Κ·等人，Science, 322: 949-953 (2008) 非專利文獻 8: Yu, J.等人，Science, 324: 797-801 (2009) 非專利文獻 9: Kaji, Κ·等人，Nature, 458: 771-775 (2009)。
[0008] 發(fā)明概述 本發(fā)明待解決的問題 鑒于上述情況，本發(fā)明旨在有效建立適合于臨床應(yīng)用的安全人iPS細胞。因此，本發(fā)明 的第一個問題是提供改進iPS細胞特別是人iPS細胞的建立效率的工具，和使用該工具有 效產(chǎn)生iPS細胞的方法。本發(fā)明的第二個問題是提供從血細胞有效建立iPS細胞，從而能 夠非侵入性獲得用于應(yīng)用于再生醫(yī)學的體細胞來源的方法。
[0009] 解決問題的方式 本發(fā)明人已經(jīng)進行了深入研究，以試圖解決上述問題，并且首次發(fā)現(xiàn)，iPS細胞建立效 率可以通過在iPS細胞建立步驟中使用含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體連同 含有編碼EBNA-I的核酸的附加型載體（下文也被稱為"額外EBNA-I載體"其不同于上 述載體）而顯著增強。此外，本發(fā)明人已經(jīng)首次發(fā)現(xiàn)，iPS細胞可以通過使用所述方法從血 細胞有效建立，盡管這對于傳統(tǒng)方法極其困難的。本發(fā)明基于已經(jīng)此類發(fā)現(xiàn)得以完成。
[0010] 相應(yīng)地，本發(fā)明包括下述內(nèi)容。
[0011] [1]產(chǎn)生iPS細胞的方法，其包括將以下⑴和⑵引入體細胞的步驟： (1) 含有編碼核重編程因子的核酸的一種或多種附加型載體；和 (2) 不同于（1)的含有編碼EBNA-I的核酸的附加型載體。
[0012] [2] [1]的方法，其進一步包括引入以附加型載體形式的編碼P53功能的抑制劑 的核酸。
[0013] [3] [2]的方法，其中前述P53功能的抑制劑是p53 ShRNA或P53的顯性失活突變 體。
[0014] [4] [3]的方法，其中前述p53的顯性失活突變體是P53DD。
[0015] [5] [1]-[4]中任一項的方法，其中前述核重編程因子是選自O(shè)ct家族、Klf家族、 Sox家族、Myc家族、Lin家族和Glis家族的成員的一種或多種。
[0016] [6][5]的方法，其中前述核重編程因子是0(^3/4、1(1€4、5(?2、1^-]\^(3和1^1128。
[0017] [7] [6]的方法，其中前述核重編程因子是0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28和 Glisl。
[0018] [8] [l]-[7]中任一項的方法，其中將前述編碼核重編程因子的核酸分開并包含 在2或3個附加型載體中。
[0019] [9] [1]的方法，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCEB-hSK-Ο 和 pCEB-hUL-G。
[0020] [10] [1]的方法，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCXLE-h0CT3/4、pCXLE-hSK 和 pCXLE-hUL。
[0021] [11] [2]的方法，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCXLE-h0CT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK 和 pCXLE-hUL。
[0022] [12] [2]的方法，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCE-h0CT3/4-shp53、pCE-hSK 和 pCE-hUL。
[0023] [13] [2]的方法，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型質(zhì)粒載體是 pCE-h0CT3/4、pCE-hSK和pCE-hUL，且前述含有編碼p53功能的抑制劑的核酸的附加型載體 是 pCE_mp53DD。
[0024] [14] [9]-[11]中任一項的方法，其中前述含有編碼EBNA-I的核酸的質(zhì)粒載體是 pCXWB-EBNAl〇
[0025] [15] [12]或[13]的方法，其中前述含有編碼EBNA-I的核酸的質(zhì)粒載體是 pCXB-EBNAl。
[0026] [16] [1]-[15]中任一項的方法，其中前述體細胞選自人成纖維細胞（HDF)和血 細胞。
[0027] [17] [16]的方法，其中前述血細胞是外周血單核細胞（PMNC)。
[0028] [18] [17]的方法，其中前述外周血單核細胞（PMNC)是T細胞。
[0029] [19]改進iPS細胞建立效率的方法，其包括將含有編碼核重編程因子的核酸的 一種或多種附加型載體引入體細胞的步驟，其中將含有編碼EBNA-I的核酸的不同的附加 型載體與所述載體一起引入體細胞。
[0030] [20] [19]的方法，其進一步包括引入以附加型載體形式的編碼p53功能的抑制 劑的核酸。
[0031] [21] [20]的方法，其中前述p53功能的抑制劑是p53 shRNA或p53的顯性失活突 變體。
[0032] [22] [21]的方法，其中前述p53的顯性失活突變體是p53DD。
[0033] [23]用于改進iPS細胞建立效率的試劑，其包含含有編碼EBNA-I的核酸的附加 型載體。
[0034] [24]用于產(chǎn)生iPS細胞的試劑盒，其包含以下⑴和⑵： (1)含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體；和 (2)不同于（1)的含有編碼EBNA-I的核酸的附加型載體。
[0035] [25] [24]的試劑盒，其進一步包含以附加型載體形式的編碼p53功能A的抑制劑 的核酸。
[0036] [26] [25]的試劑盒，其中前述p53功能的抑制劑是p53 shRNA或p53的顯性失活 突變體。
[0037] [27] [26]的試劑盒，其中前述p53的顯性失活突變體是p53DD。
[0038] [28] [24]的試劑盒，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCEB-hSK-Ο 和 pCEB-hUL-G。
[0039] [29] [24]的試劑盒，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCXLE-h0CT3/4、pCXLE-hSK 和 pCXLE-hUL。
[0040] [30] [25]的試劑盒，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCXLE-h0CT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK 和 pCXLE-hUL。
[0041] [31] [25]的試劑盒，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCE-h0CT3/4-shp53、pCE-hSK 和 pCE-hUL。
[0042] [32] [25]的試劑盒，其中前述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型質(zhì)粒載體 是pCE-h0CT3/4、pCE-hSK和pCE-hUL，且前述含有編碼p53功能的抑制劑的核酸的附加型 載體是 pCE-mp53DD。
[0043] [33] [28] - [30]中任一項的試劑盒，其中前述含有編碼EBNA-I的核酸的質(zhì)粒載 體是 pCXWB-EBNAl。
[0044] [34] [31]或[32]的試劑盒，其中前述含有編碼EBNA-I的核酸的質(zhì)粒載體是 pCXB-EBNAl。
[0045] [35]產(chǎn)生體細胞的方法，其包括使通過[1] - [18]中任一項的方法獲得的iPS 細胞進行分化處理，以允許分化為體細胞。
[0046] 發(fā)明效果 在體細胞的核重編程步驟中使用額外的EBNA-I載體顯著增強了 iPS細胞的建立效率， 并且能夠更有效地提供人iPS細胞。此外，使用額外的EBNA-I載體能夠從血細胞有效建立 iPS細胞，這通過常規(guī)方法是極其困難的，這進而能夠以非侵入性形式獲得體細胞來源。因 此，本發(fā)明對于將人iPS細胞用于再生醫(yī)學中是非常有用的。
[0047] 附圖簡述
[圖1]圖IA顯示pCEB-hSK-Ο的結(jié)構(gòu)，且圖IB顯示pCEB-hUL-G的結(jié)構(gòu)。
[0048] [圖 2]圖 2A - E 顯示各種附加型質(zhì)粒（pCE-h0CT3/4、pCE-h0CT3/4-shp53、 pCE-hSK、pCE-hUL 和 pCE-mp53DD)的結(jié)構(gòu)。
[0049] [圖3]圖3A顯示額外EBNA-I載體質(zhì)粒（pCXWB-EBNA-1)的結(jié)構(gòu)。圖3B顯示額 外EBNA-I載體質(zhì)粒（pCXB-EBNA-Ι)的結(jié)構(gòu)。
[0050] [圖4]圖4顯示從人成纖維細胞（HDF1419)建立iPS細胞。iPS細胞通過使用 為質(zhì)粒組合的2種載體（2 vec.) (pCEB-hSK-Ο和pCEB-hUL-G)和其與pCXWB-EBNAl的組合 從人成纖維細胞（HDF1419)建立。作為飼養(yǎng)細胞，使用絲裂霉素 C處理的MEF或絲裂霉素 C處理的SNL。
[0051] [圖5]圖5顯示從人成纖維細胞（HDF1388)建立iPS細胞。iPS細胞通過使用 為質(zhì)粒組合的 Y4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK 和 pCXLE-hUL)和其與 pCXWB-EBNAl 的組合從人成纖維細胞（HDF13889)建立。作為飼養(yǎng)細胞，使用絲裂霉素 C處理的MEF或絲 裂霉素 C處理的SNL。
[0052] [圖6]圖6顯示從人外周血單核細胞（PMNC)建立iPS細胞。（A)顯示使用質(zhì)粒 從PMNC誘導iPS細胞的方案。（B)和（C)是使用質(zhì)粒組合Y4 (pCXLE-h0CT3/4-shp53-F、 pCXLE-hSK和pCXLE-hUL)建立的iPS細胞集落的照片。（D)顯示在TRB基因座的Southern 印跡分析的結(jié)果。V(D) J重組（reknitting)在源自兩個供體（#1和#3)的iPS細胞克隆 (585A1、585B1、604A1和604B1)的TRB基因座中發(fā)現(xiàn)。（E) - (G)顯示來自iPS細胞的畸 胎瘤形成。
[0053] [圖7]圖7顯示額外EBNA-I載體質(zhì)粒的iPS細胞建立促進效果。（A)和（B)顯示 使用質(zhì)粒組合Y4 (pCXLE-h0CT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和 pCXLE-hUL)和其與 pCXWB-EBNAl 的組合從PMNC建立的iPS細胞的結(jié)果。作為培養(yǎng)基，T細胞培養(yǎng)基（A)或非T細胞培養(yǎng)基 (B)。（C)顯示在建立的iPS細胞中保留的附加型載體的拷貝數(shù)。
[0054] [實施方案的描述]
[發(fā)明詳述] 本發(fā)明提供了 iPS細胞的產(chǎn)生方法，其包括將以下引入體細胞的步驟，（1)含有編碼 核重編程因子的核酸的一種或多種附加型載體；和（2)不同于（1)的含有EBNA-I的附加 型載體，和進一步，當期望時，含有編碼P53功能的抑制劑的核酸的附加型載體（在附加型 載體中，編碼P53功能的抑制劑的核酸可以單獨地包含在或與編碼核重編程因子的核酸一 起包含在任何上述（1)的附加型載體中）。本發(fā)明還提供了用于改進iPS細胞建立效率的 試劑，其包含含有編碼EBNA-I的核酸的附加型載體，等。
[0055] (A)體細朐的來源 除了哺乳動物起源（例如人、小鼠、猴、豬、大鼠等）的生殖細胞以外的任何細胞都可以 用作用于產(chǎn)生iPS細胞的起始材料。實例包括角質(zhì)化上皮細胞（例如角質(zhì)化的表皮細胞）、 粘膜上皮細胞（例如舌淺層的上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例如乳腺細胞）、激素分泌 細胞（例如腎上腺髓質(zhì)細胞）、用于代謝或貯存的細胞（例如肝細胞）、構(gòu)成界面的內(nèi)膜上 皮細胞（例如I型肺泡細胞）、閉膜管的內(nèi)膜上皮細胞（例如血管內(nèi)皮細胞）、具有轉(zhuǎn)運能 力的具有纖毛的細胞（例如氣道上皮細胞）、用于細胞外基質(zhì)分泌的細胞（例如成纖維細 胞）、收縮細胞（例如平滑肌細胞）、血液和免疫系統(tǒng)的細胞（例如T淋巴細胞）、感覺相關(guān) 細胞（例如桿狀細胞）、自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元（例如膽堿能神經(jīng)元）、感覺器官和外周神經(jīng) 元的支持細胞（例如衛(wèi)星細胞）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞（例如星形膠質(zhì) 細胞）、色素細胞（例如視網(wǎng)膜色素上皮細胞）、其祖細胞（組織祖細胞）等。不存在關(guān)于 細胞分化程度，從其中收集細胞的動物年齡等的限制；甚至未分化的祖細胞（包括成體干 細胞）和最終分化的成熟細胞可以類似地用作本發(fā)明中的體細胞來源。未分化的祖細胞的 實例包括組織干細胞（成體干細胞）諸如神經(jīng)干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞和牙髓干 細胞。具體地，由于血細胞（外周血單核細胞（包括T細胞和非T細胞（包括CD34陽性細 胞和祖干細胞）），外周血淋巴細胞，臍帶血細胞等）很容易得到，并且不伴隨侵入，所以期 望利用其作為iPS細胞庫的體細胞來源。此外，由于牙髓干細胞可以通過從智齒、由于牙周 疾病拔出的牙齒等分離而制備，所以它們是容易獲得的，并且期望利用其作為iPS細胞庫 的體細胞來源。
[0056] 當外周血單核細胞被用作體細胞時，T細胞受體（TCR)基因座可以含有或可以不 含V(D) J重組。外周血單核細胞的優(yōu)選實例包括，但不限于，T細胞，其中T細胞受體（TCR) 基因座含有V(D)J重組。
[0057] 作為體細胞來源的哺乳動物個體的選擇并無特別限制；然而，當獲得的iPS細胞 待用于人中的再生醫(yī)學時，從預防移植物排斥的觀點來看，從患者或具有與患者的HLA類 型相同或基本上相同的HLA類型的另一個人中收集體細胞是優(yōu)選的。如本文使用的，"基本 上相同的HLA類型"意指，當它們移植到使用免疫抑制劑等的患者時，供體的HLA類型與患 者的HLA類型匹配至移植細胞（其已通過誘導衍生自供體的體細胞的iPS細胞分化獲得） 可以移入的程度。例如，它包括其中主要HLAs (例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的三個主要 基因座，進一步包括HLA-Cw的4個基因座）是等同的（下文將應(yīng)用相同含義）等的HLA類 型。當獲得的iPS細胞不施用于（移植到）人，但用作例如用于篩選評估患者的藥物敏感 性或不良反應(yīng)的細胞來源時，同樣期望從患者或具有與藥物敏感性或不良反應(yīng)關(guān)聯(lián)的相同 遺傳多態(tài)性的另一個人中收集體細胞。
[0058] 當作為體細胞來源的哺乳動物個體是人時，他/她的年齡通常為20歲-60歲，優(yōu) 選地，20歲-40歲，但不限于此。
[0059] 在實施核重編程步驟前，從哺乳動物中分離的體細胞可以根據(jù)細胞的選擇使用 本身已知適合于其培養(yǎng)的培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)。此類培養(yǎng)基的實例包括但不限于，含有約 5 - 20%胎牛血清（FCS)的最小必需培養(yǎng)基（MEM)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM)、 RPMI1640培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基等。例如，當牙髓干細胞用作體細胞時，優(yōu)選使用 用于間質(zhì)干細胞（例如間質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Lonza))等的培養(yǎng)基。當使用血細胞時，可 以將IL-2、抗⑶3抗體和抗⑶28抗體添加至培養(yǎng)基中，因為T細胞在濃縮后使用。類似地， 可以將IL-3、IL-6、G-CSF和GM-CSF添加至培養(yǎng)基中，因為非T細胞在濃縮后使用。細胞可 以在引入上述（1)和（2)的本發(fā)明的附加型載體（有時含有編碼p53功能的抑制劑的核酸 的額外附加型載體；下文也被稱為"本發(fā)明的載體集合"）之前或之后濃縮。當使用本發(fā)明 的載體集合，例如，轉(zhuǎn)移試劑諸如陽離子脂質(zhì)體用于使體細胞與iPS細胞建立效率改進劑 接觸時(如果期望)，有時優(yōu)選培養(yǎng)基已代替為無血清培養(yǎng)基，以防止轉(zhuǎn)移效率降低。
[0060] 為了獲得適合于人臨床應(yīng)用的完全無外來物（xeno-free)人iPS細胞，不含源自 非人動物的組分諸如FCS等的培養(yǎng)基是更期望的。通過將適合于培養(yǎng)體細胞的各種人衍生 的組分（具體地，重組人蛋白諸如生長因子等）、非必需氨基酸、維生素等添加至基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中而獲得的培養(yǎng)基是可商購的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇用于體細胞來源的適 當?shù)臒o外來物的培養(yǎng)基。在無外來物的培養(yǎng)基中預培養(yǎng)的體細胞通過使用合適的無外來物 細胞脫離溶液與培養(yǎng)容器脫離，回收，并使其與本發(fā)明的載體集合接觸。
[0061] (B)核重編程因子（也簡稱為"重編程因子"） 本發(fā)明的"核重編程因子"意指能夠從體細胞誘導iPS細胞的蛋白因子（組）。待用 于本發(fā)明中的核重編程因子可以是任何蛋白因子（組），只要其可以通過將編碼其的核酸 引入體細胞而誘導iPS細胞。例如，它可以是選自O(shè)ct家族、Klf家族、Sox家族、Myc家族、 Lin家族和Glis家族的成員的一種或多種蛋白因子。優(yōu)選地，待用于本發(fā)明中的核重編程 因子至少含有0ct3/4、Klf4和Sox2 (Klf4和/或Sox2可以替代為經(jīng)報道能夠替代其功能 的其它因子），并且當P53功能的抑制劑沒有組合使用時，L-Myc和Lin28或Lin28b優(yōu)選進 一步組合為核重編程因子。待用于本發(fā)明中的核重編程因子特征性地不含Nanog。具體地， 以下組合可以列舉作為核重編程因子。
[15 Oct3/4, Klf4r Sox2? L-Myc (冊:處， Sok2 n| ill Soxlf S0k2, Soxlht Soxl7 -? SoxlS KIfi Klf:, Klf2 ;i c f 5 代m (2) GctJ/4, ?4, Sox2, L-Mycf TERT, SV?人T抗Kl I K A SV40LT) i:3:i Get3/4, Klf4, Sox2f L-Mycf TERT, KPVl6 ￡6 ⑷ Get3/4, Klf4, Sox2, L-Mycf TERT, HPVl6 ￡7 (5) Oct3/4, Klf4 r Sox2, L-Mycf TERT, HE2VlS E6, HFV16 E? ξ 6} Oct-3/4 , Klfi r Sox2, L-Mycr TERT, BmiI (7) Oct3/4, K：f4, Sox2r I-Myc, Lin28 {8} Oct3/4, Kli4f Sox2, L-Mycf Lin28, GXIsl (9} Oct3/4, Klf4, S0x2, L-Myc, Lir.28, SV4CLT Π 0} Get3/4, Kii4, 30x2# L-Myc? Lin23, TERTf SV4 0LT (Il) Oct3/4, Klf4, Sox2? L-Kyc, SV40LT {12) Oct 3/4? Esrrbf Scx2, I*-Myc I Esrrb ?]? 11 Esrrgft W) t::.3} Oct3/4r Klf4, Scx2 114) Oct3/4f Klf4, Sox2, TSRT, SV4CLT 115) Oct3/?( Klf4, Sox2, TERT, HPVl6 E6 (16) Oct：3/4# Klf4, S〇x2, TER?, HPVI6 F7 ill) 0ct3/4, Klf4, Sox2# TERT, HPVI6 E6, HP￥：6 Ξ7 (18} Oct3/4# Kl￡4, Scx2# TERT* Brail (151 Oct3/4, K：￡4f Scx2, Lin28 i:20) Oct3/4, Kl f4, 5〇x2, Lir.23r SV4〇L,T (21) Oct3/4# Klf4, S〇x2f Lin28, TERTf SV40LT
[22} Cct3/4, Kl:4, Sox2r SlMOLT
[23) Oct3/4# Ssrrb, S0x2 (Esrrbwfill Esrrffllll
[0062] 上文中，還可以使用Lin28b代替Lin28。當使用Esrrb或Esrrg (上述（12)和 (23))時，Klf4可以組合使用。
[0063] 不落入上文（1)至（23)中但包含（1)至（22)中任一項的所有組成成分且進一步 包含任選選擇的其它物質(zhì)的任何組合也可以包括在本發(fā)明的"核重編程因子"的范圍中。如 果經(jīng)歷核重編程的體細胞內(nèi)源以足以引起核重編程的水平表達上文（1)至（23)中任一項 的一種或多種組成成分，則不含有所述一種或多種組成成分的僅其余組成成分的組合也可 以包括在本發(fā)明的"核重編程因子"的范圍中。
[0064] 在這些組合中，0ct3/4 (有時縮寫為"0"）、Sox2 (有時縮寫為"S"）、Klf4 (有 時縮寫為"K"）、Lin28 (有時縮寫為"L"）和L-Myc (有時縮寫為"U"）的5種因子以及 0ct3/4、Sox2、Klf4、Lin28、L-Myc和Glisl (有時縮寫為"G"）的6種因子是優(yōu)選的實例。
[0065] 關(guān)于上述核重編程因子的小鼠和人cDNA序列的信息可參考WO 2007/069666中 提及的NCBI登錄號獲得（在該公開中，Nanog描述為ECAT4。關(guān)于Lin28、Lin28b、Esrrb、 Esrrg、L-Myc和Glisl的小鼠和人cDNA序列的信息可以分別通過參考以下NCBI登錄號獲 得）；本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地能夠分離這些cDNA。 墻W名稱 小R 人 Lin28 ^_：45833 ?1^024674 Lxn2Sb NM_0〇1〇31772 KK_001004317 Esrrb 幽」11 §3,1 觀_0044 52 Esrrg 11935 NX_001438 L-Hyc 剛一―0085.06 SM-.....001033032 Glisl 隨-14 7221 XM-M7193
[0066] (c) p38功能的抑制劑 在本發(fā)明中，更優(yōu)選的是，除了上述核重編程因子以外，將P53功能的抑制劑與體細胞 接觸。如本文提及的，"P53功能的抑制劑"可以是任何物質(zhì)，只要它能夠抑制（a)p53蛋白 的功能或（b)p53基因的表達。即，不僅直接作用于p53蛋白以抑制其功能的物質(zhì)和直接作 用于p53基因以抑制其表達的物質(zhì)，而且作用于參與p53信號轉(zhuǎn)導的因子以導致p53蛋白 的功能或P53基因的表達抑制的物質(zhì)，也包括在如本文提及的"p53功能的抑制劑"的范圍 中。
[0067] 抑制p53蛋白功能的物質(zhì)的實例包括，但不限于，p53的化學抑制劑、p53的顯性失 活突變體、抗P53拮抗劑抗體、含有p53應(yīng)答元件的共有序列的誘餌核酸、p53通路抑制劑 等。優(yōu)選的是P53的化學抑制物質(zhì)、p53的顯性失活突變體和p53通路抑制物質(zhì)，并且更優(yōu) 選的是P53的顯性失活突變體。另一方面，作為抑制p53基因表達的優(yōu)選物質(zhì)，可以提及針 對 p53 的 siRNA 和 shRNA。
[0068] p53功能的抑制劑的具體實例、獲得它們的方法、以及使其與體細胞接觸的方法詳 細描述于 WO 2009/157593。
[0069] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將作為p53功能的抑制劑的p53 shRNA或p53的顯性 失活突變體以含有編碼其的核酸的附加型載體的形式引入體細胞以實現(xiàn)與體細胞的接觸。
[0070] 本發(fā)明中特別優(yōu)選的p53的顯性失活突變體是p53DD，其中小鼠 p53的第 14-301(對應(yīng)于人 p53 的第 11-304)氨基酸已經(jīng)缺失（Bowman, T·，Genes Develop·, 10， 826-835 (1996))〇
[0071] 編碼ρ53的顯性失活突變體的核酸可以，例如，通過以下方法獲得。首先，基于 小鼠或人Ρ53 cDNA序列信息合成合適的寡核苷酸作為探針或引物，并且使用雜交方法或 (RT-) PCR方法，從衍生自小鼠或人細胞或組織的mRNA、cDNA或cDNA文庫克隆小鼠或人ρ53 cDNA，并且亞克隆到適當?shù)馁|(zhì)粒內(nèi)。在缺失變體諸如p53DD的情況下，在待缺失的位點之外 上設(shè)計引物，使用所述引物，使用插入有P53 cDNA的質(zhì)粒作為模板進行反向PCR，由此獲得 編碼目標顯性失活突變體的cDNA。
[0072] 將分離的cDNA以與上述編碼核重編程因子的核酸相同的方式插入下述附加型載 體，并且可以將其引入體細胞。
[0073] 根據(jù)例如由 Elbashir 等人ifeK, 75； 188-200 (2001))提出的規(guī)則，針 對p53的siRNA可以基于小鼠或人p53 cDNA序列信息進行設(shè)計。檢查基于上述規(guī)則選擇 的目標序列候選物與除了目標以外的mRNA中連續(xù)16-17個堿基的序列的同源性，其使用同 源性檢索軟件程序諸如BLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，以便證實所選目 標序列的特異性。對于其特異性已被證實的目標序列，由19-21個堿基的有義鏈和與其互 補的反義鏈組成的雙鏈RNA經(jīng)由能夠形成環(huán)結(jié)構(gòu)（例如，約8-25個堿基）的任何接頭序列 連接，由此可以設(shè)計siRNA。
[0074] 具體而言，具有序列 5# - GACTCCAGtTSGi AATCTfiCTGctcqaoCASTAGATTACCaCTGGAGTC-Ii# (SEQ ID M0:1; 下劃線部分是P53的目標序列，大寫字母顯示形成dsRNA的部分）的針對人p53的shRNA 等可以被用作本發(fā)明中特別優(yōu)選的shRNA。
[0075] 對于表達編碼shRNA的DNA的載體，盡管pol II啟動子（例如CMV的立即早期啟 動子）可以用作啟動子，但通常實踐是使用POl III啟動子，以便允許短RNA的準確轉(zhuǎn)錄。 作為pol III啟動子，可以提及小鼠和人U6-snRNA啟動子、人Hl-RNase P RNA啟動子、人 纈氨酸-tRNA啟動子等。作為轉(zhuǎn)錄終止信號，使用連續(xù)4個或更多T殘基的序列。
[0076] 將因此構(gòu)建的shRNA表達盒以與上述編碼核重編程因子的核酸相同的方式插入 下述附加型載體，并且可以將其引入體細胞。
[0077] (D)表達盒 上述編碼核重編程因子的核酸（和編碼P53功能的抑制劑的核酸）可以單獨或以任何 組合構(gòu)成表達盒，并且這些表達盒可以以任何組合包含在附加型載體中。例如，當0ct3/4、 Sox2、Klf4、Lin28和L-Myc用作重編程因子時，編碼這些重編程因子的五種核酸被包含作 為附加型載體中的以下3個表達盒。 (a) 含有編碼0ct3/4的核酸（0)的表達盒； (b) 表達盒，其中編碼Sox2的核酸（S)和編碼Klf4的核酸（K)以該順序（S-K)以5' 至3'方向經(jīng)由使得雙順反子表達的間隔序列（interlying sequence)連接；和 (c) 表達盒，其中編碼L-Myc的核酸⑶和編碼Lin28的核酸（L)以該順序（U-L)以 5'至3'方向經(jīng)由使得雙順反子表達的間隔序列連接。
[0078] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，除了上述5種重編程因子以外，還使用Glisl作為重 編程因子。在這種情況下，在附加型載體中含有編碼6種重編程因子的核酸作為上述3個 表達盒（a) - (c)和 (d) 含有編碼Glisl的核酸（G)的表達盒的4個表達盒。
[0079] 在另一個實施方案中，將0ct3/4、Sox2、Klf4、Lin28和L-Myc的5種重編程因子 與p53 shRNA或p53DD組合。在這種情況下，編碼5種重編程因子和p53 shRNA或p53DD 的6種核酸被包含作為附加型載體中的以下4個表達盒。 (a)含有編碼0ct3/4的核酸（0)的表達盒； (b) 表達盒，其中編碼Sox2的核酸（S)和編碼Klf4的核酸（K)以該順序（S-K)以5' 至3'方向經(jīng)由使得雙順反子表達的間隔序列連接； (c) 表達盒，其中編碼L-Myc的核酸⑶和編碼Lin28的核酸（L)以該順序（U-L)以 5'至3'方向經(jīng)由使得雙順反子表達的間隔序列連接；和 (d'）含有編碼p53 shRNA的核酸的表達盒或（d"）含有編碼p53DD的核酸的表達盒。
[0080] 作為"使得雙順反子表達的間隔序列"，可以使用口蹄疫病毒的2A序列（PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25,1707,2007)、IRES 序列（美國專利號 4, 937, 190)等，優(yōu)選 2A序列。"表達盒"含有重編程因子和/或編碼p53功能的抑制劑的核酸（0、S-K、U-L、G 等），以及與該核酸可操作連接的至少一個啟動子。用于重編程因子或編碼P53的顯性失活 突變體的核酸的啟動子的實例包括EFl α啟動子、CAG啟動子、SRa啟動子、SV40啟動子、 LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒）啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒）啟動子、MoMuLV(莫洛尼小鼠 白血病病毒）LTR、HSV-TK(單純皰疹病毒胸苷激酶）啟動子等，其中優(yōu)選為EFl a啟動子、 CAG啟動子、MoMuLV LTR、CMV啟動子、SR a啟動子等。此外，除了基本啟動子序列以外，表 達盒可以含有用于增強重編程因子的表達的增強子序列（例如，CMV早期立即增強子等）。 在編碼p53 shRNA的核酸的情況下，pol III啟動子諸如U6啟動子等優(yōu)選用作如上所述的 啟動子。
[0081] 優(yōu)選地，除了啟動子以外，本發(fā)明的表達盒含有在編碼重編程因子或P53的顯性 失活突變體的核酸的3'下游的polyA添加信號。在編碼p53 shRNA的核酸的情況下，4個 或更多個連續(xù)T殘基的序列優(yōu)選被包含作為核酸的3'下游的轉(zhuǎn)錄終止信號。而且，在本發(fā) 明的表達盒中，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（WPRE)序列可以被插入在，例如，重編程 因子和顯性失活突變體的編碼區(qū)和PolyA添加信號之間，以試圖改進重編程因子和p53的 顯性失活突變體的mRNA的穩(wěn)定性。
[0082] (E)附加型載體 待用于本發(fā)明中的附加型載體的實例包括包含對于哺乳動物細胞中自主復制必需的 衍生自EBV、SV40等的序列作為載體組分的載體。對于哺乳動物細胞中自主復制必需的載 體組分通過哺乳動物細胞中有功能的復制起點和編碼結(jié)合復制起點以控制復制的蛋白的 基因具體例舉。其實例包括用于EBV的復制起點oriP和EBNA-I基因、和用于SV40的復制 起點ori和SV40大T抗原基因。更優(yōu)選地，使用oriP和EBNA-I基因。
[0083] 當期望時，附加型載體可以進一步含有細菌或酵母的復制起點（例如，pUC ori、 ColEl 〇ri、2y ori等），選擇標記基因（例如，氨芐青霉素抗性基因、營養(yǎng)缺陷型互補基 因）等，以實現(xiàn)細菌和酵母諸如大腸桿菌等中的大量擴增。此外，當期望時，例如，二氫葉酸 還原酶基因、新霉素抗性基因等可以進一步被包含作為哺乳動物細胞中的選擇標記基因。 此外，附加型載體可以含有多克隆位點，以便于插入編碼重編程因子的核酸的表達盒。在一 個實施方案中，上述表達盒中的啟動子、增強子、PolyA添加信號、WPRE序列等被預先包含 在附加型載體上，且附加型載體也可以經(jīng)設(shè)計以通過將編碼重編程因子的核酸插入啟動子 和polyA添加信號（當載體含有WPRE序列時為WPRE序列）之間而構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體。在此 類情況下，附加型載體優(yōu)選含有啟動子和PolyA添加信號（當載體含有WPRE序列時為WPRE 序列）之間的多克隆位點。
[0084] 本發(fā)明的載體集合可以通過在多個（優(yōu)選為2、3或4個）附加型載體中每個中包 括上述表達盒（a) - (c)、或（a) - (d)、（d'）或（d"）中的1或2個而構(gòu)建。在這方面， 本發(fā)明人先前公開了多個表達盒的組合和其在附加型載體上的順序顯著影響iPS細胞建 立效率（美國臨時專利申請?zhí)?1/521，153)。
[0085] 在本發(fā)明中，額外EBNA-I載體的組合使用顯著改進iPS細胞建立效率。因此，本 發(fā)明的載體集合可以以任何組合和任何位置處的任何順序在2、3或4個附加型載體上含有 上述表達盒（a) - (c)、或（a) - (d)、（d'）或（d"）中的1或2個。
[0086] 然而，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的載體集合通過根據(jù)以下規(guī)則（美國臨時 專利申請?zhí)?1/521，153)將上述表達盒（a) - (d)中的兩個置于兩個附加型載體上而構(gòu) 建。
[0087] 當表達盒以5'至3'方向以[表達盒A]-[表達盒B]的順序與編碼蛋白（例如， EBNA-USV40大T抗原等，優(yōu)選EBNA-1)(其結(jié)合哺乳動物細胞中的功能復制起點并調(diào)節(jié)載 體在哺乳動物細胞中的復制）的基因（有義鏈）的3'-側(cè)設(shè)置為起點（此后，附加型載體 上表達盒的位置總是通過使用該起點顯示）時， 1) 上述（a)的表達盒（包括編碼0ct3/4的核酸（0))被布置在表達盒B的位置；優(yōu)選 地， 2) 上述（b)的表達盒(其中編碼Sox2的核酸（S)和編碼Klf4的核酸（K)以該順序 (S-K)以5'至3'方向經(jīng)由使得雙順反子表達的間隔序列連接）被布置在表達盒A的位置。
[0088] 此處，上述表達盒（a)和上述表達盒（b)可以被設(shè)置在（i )相同附加型載體上 (以（b)-(a)的順序被布置在第一附加型載體上），或者被設(shè)置在（ii)不同附加型載體上 (以（c)或（d)-(a)的順序被布置在第一附加型載體上，且以（b)-(d)或（c)的順序被布置 在第二附加型載體上）。上述（i)包括兩種組合：（ia)第一附加型載體：（b)_(a)(重編 程因子SK-O的順序）和第二表達載體：（c) - (d)(重編程因子UL-G的順序）的組合，和 (ib)第一附加型載體：（b)-(a)(重編程因子SK-O的順序）和第二表達載體：（d)-(c) (重編程因子G-UL的順序）的組合。上述（ii)包括兩種組合 ：（iia)第一附加型載體： (c) - (a)(重編程因子UL-O的順序）和第二表達載體：（b)-⑷（重編程因子SK-G的順 序）的組合，和（iib)第一附加型載體：（d)-(a)(重編程因子G-O的順序）和第二表達 載體：（b)-(c)(重編程因子SK-UL的順序）的組合。
[0089] 在這些中，特別優(yōu)選的組合是上述組合（ia)，S卩，第一附加型載體：（b)-(a)(重 編程因子SK-O的順序）和第二表達載體：（C)-(d)(重編程因子UL-G的順序）的組合。更 具體地，可以提及下述實施例和圖1中顯示的pCEB-hSK-Ο和pCEB-hUL-G的組合。
[0090] 在上面提及的表達盒的順序中，每個表達盒的轉(zhuǎn)錄的方向沒有特別限定，且兩個 表達盒可以被插入，從而使得它們以相同方向（頭至尾）轉(zhuǎn)錄，或者可以被插入，從而使得 它們以相反方向（頭至頭或尾至尾）轉(zhuǎn)錄。每個表達盒的轉(zhuǎn)錄方向可以與編碼結(jié)合哺乳動 物細胞中的功能復制起點并調(diào)節(jié)載體在哺乳動物細胞中的復制的蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄方向 相同或相反。在一個優(yōu)選的實施方案中，將所有表達盒置于載體上，從而使得它們以與基因 的方向相同的方向轉(zhuǎn)錄。
[0091] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的載體集合包含分別置于3種附加型載體上 的上述表達盒（a) - (c)。更具體地，3種附加型載體的實例包括如下述實施例和圖2中顯 示的 pCXi￡~hOCT3/4 (AddgeRe*2?〇76}, pCXLK-hSK (Addgene#27078:? _ pCXLE-hij：, t；Addgcne*270S0) Nat. Menhocis, 8 (5) ; 409-412 {2Q11}} , _ p€E-hOCT3/4, pCE-hSK HI pCE-h?I.。
[0092] 當載體集合進一步含有p53功能的抑制劑的表達盒（即，上述（d'）或（d"）的表 達盒）時，該表達盒可以單獨地置于分開的附加型載體上（總共4種附加型載體）。具體實 例包括下述實施例和圖2中顯示的pCE-mp53DD等。
[0093] 或者，p53功能的抑制劑的表達盒可以一起置于含有上述表達盒（a) - (c)的3種 附加型載體中的任一種上。優(yōu)選地，其可以，但不限于，與上述表達盒（a) -起置于附加型載 體上。當將其與編碼重編程因子的核酸一起置于附加型載體上時，其順序沒有特別限定。例 如，它們可以以P53功能的抑制劑的表達盒一重編程因子的表達盒的順序進行設(shè)置。具體實 例包括下述實施例和圖2中顯示的pCXLE-hOCT3 /4-shp53- F《Addgene#27 077】（也 稱為 ''pCXLE-hOCT3/4-Shp53"，參見 Nat · Keth〇cis, 3 ( &) : 4Π 9-4:2 (Hil 1 :.) 和 (也稱為 wpCE-h〇CT3/4-shp53w )。
[0094] 本發(fā)明中的附加型載體可以含有或可以不含對于載體在哺乳動物細胞中的復制 必需的載體組分的5'_側(cè)和3'_側(cè)上的IoxP序列。優(yōu)選地，可以使用具有相同方向的載體 組分的5' -側(cè)和3' -側(cè)上的IoxP序列的附加型載體。由于附加型載體能夠在染色體之外 自主復制，甚至當它沒有被引入基因組中時，也可以提供宿主細胞中的穩(wěn)定表達。一旦建立 iPS細胞，則期望快速去除載體。通過放置由兩個IoxP序列（其允許Cre重組酶在其上發(fā) 揮作用并切割出載體組分）側(cè)接的對于附加型載體在哺乳動物細胞中的復制所需的載體 組分可以使得附加型載體的自主復制能力消失，并且可以使得載體從早期iPS細胞脫落。
[0095] 除了噬菌體Pl衍生的野生型IoxP序列以外，可用于本發(fā)明中的IoxP序列包括， 當以相同方向置于側(cè)接對于附加型載體在哺乳動物細胞中的復制必需的載體組分的位置 時，能夠通過重組缺失IoxP序列側(cè)接的序列的任選選擇的突變體IoxP序列。此類突變體 IoxP序列的實例包括在5'重復中突變的1οχ71、在3'重復中突變的1οχ66、以及在間隔序 列部分中突變的l〇x2272和1 〇Χ511。盡管置于載體組分的5'和3'側(cè)上的兩個IoxP序列 可以是相同或不相同的，但在間隔序列部分中突變的兩個突變體IoxP序列必須是相同的 (例如一對l〇x2272序列、一對1οχ511序列）。優(yōu)選給予在5'重復中突變的突變體IoxP序 列（例如1〇χ71)、和在3'重復中突變的突變體IoxP序列（例如1οχ66)的組合。在這種情 況下，由于重組，在染色體上剩余的IoxP序列具有在5'側(cè)和3'側(cè)上在重復中的雙重突變， 并且因此不太可能由Cre重組酶識別，從而減少由于不需要的重組引起染色體中的缺失突 變的風險。當突變體IoxP序列1〇χ71和1οχ66組合使用時，各自可以置于上述載體組分的 5'和3'側(cè)的任何上，但突變體IoxP序列以這樣的方向插入，從而使得突變位點將位于各 自IoxP序列的外部末端是必需的。盡管本發(fā)明中的優(yōu)選附加型載體是甚至在沒有Cre重 組酶作用的情況下從早期iPS細胞脫落的早期消失載體，但由于對于從細胞脫落可能需要 格外長時間，因此可優(yōu)選設(shè)計IoxP序列來處理由于用Cre重組酶處理導致的不必要重組風 險等。
[0096] 兩個IoxP序列各自以相同方向置于對于附加型載體在哺乳動物細胞中的復制必 需的載體組成成分（即在哺乳動物細胞中有功能的復制起點（例如，EBV oriP、SV40 ori 等，優(yōu)選oriP)或編碼結(jié)合復制起點以控制復制的蛋白的基因序列（例如，EBNA-1、SV40大 T抗原等，優(yōu)選EBNA-I))的5'和3'側(cè)上。IoxP序列側(cè)接的載體組成成分可以是復制起點、 或編碼結(jié)合復制起點以控制復制的蛋白的基因序列、或兩者。
[0097] 本發(fā)明中使用的附加型載體不僅提供附加型載體的固有效果（S卩，當引入體細胞 時，無論IoxP序列是否存在，構(gòu)成載體的外源核酸因子（包括重編程因子或編碼P53功能 的抑制劑的核酸）沒有被引入細胞基因組中，即使是瞬時地），而且提供意料之外的效果 (即，作為附加體存在的載體從早期iPS細胞脫落，甚至在不應(yīng)用Cre重組酶處理的情況 下）。即，本發(fā)明還提供了自消失的附加型載體，其提供足以建立iPS細胞的重編程因子和 P53功能的抑制劑的表達，此后其從早期細胞脫落。如本文中所使用，"脫落"意指通過WO 2011/016588 Al中實施例6或10所述的PCR分析或?qū)嵤├?1中所述的RT-PCR分析沒有 檢測到（低于檢測限值）載體的存在或置于載體上的重編程因子或P53功能的抑制劑的 表達。此類載體的特征在于其在通過引入載體建立的iPS細胞克隆中的50%或更多、優(yōu)選 60%或更多、更優(yōu)選70%或更多中在10代之前從iPS細胞脫落?；蛘?，自消失的附加型載 體的特征在于其在細胞中是不穩(wěn)定的，其程度為，在引入后的一周內(nèi)，每IxlO 4個細胞的拷 貝數(shù)為大約1〇6,而當建立iPS細胞時（例如，從引入載體起約4周），每IxlO 4個細胞的拷 貝數(shù)為100或更少，優(yōu)選50或更少，更優(yōu)選30或更少。
[0098] 具體而言，本發(fā)明的早期自消失載體具有以下（i) - (Vii)中至少一種、優(yōu)選2種 或更多種、更優(yōu)選3種或更多種、特別優(yōu)選4種或更多種結(jié)構(gòu)特征。
[0099] (i)將IoxP序列以相同方向布置在對于附加型載體在哺乳動物細胞中的復制所 需的載體組分（例如，EBNA-I基因、SV40大T抗原基因，優(yōu)選EBNA-I基因）的5' -側(cè)和 3' -側(cè)上。
[0100] (ii)編碼重編程因子的核酸在CAG啟動子的調(diào)控下。
[0101] (iii)編碼重編程因子或P53的顯性失活突變體的核酸在CMV早期立即增強子的 調(diào)控下。
[0102] (iv)編碼重編程因子或p53的顯性失活突變體的核酸在兔β珠蛋白polyA添加 信號的調(diào)控下。
[0103] (V)將WPRE序列包含在編碼重編程因子或ρ53的顯性失活突變體的核酸和polyA 添加信號之間。
[0104] (vi)編碼p53 shRNA的核酸在U6啟動子的調(diào)控下。
[0105] (vii)含有在細菌中有功能的復制起點（例如pUC ori，ColEl ori，優(yōu)選pUC ori) 和能夠在細菌中選擇的標記基因（例如，氨芐青霉素抗性基因）。
[0106] (viii)置于載體上的對于附加型載體在哺乳動物細胞中的復制所需的載體組分 (例如，EBNA-I基因、SV40大T抗原基因，優(yōu)選EBNA-I基因）和編碼各重編程因子或p53 功能的抑制劑的核酸以相同方向轉(zhuǎn)錄。
[0107] 如美國臨時專利申請?zhí)?1/521，153的實施例6中所示，可以建立iPS細胞，甚至 當在一個附加型載體上含有4個表達盒的轉(zhuǎn)基因載體被引入體細胞時。建立效率可以通過 研究也在這種情況下表達盒的順序來進一步改進。
[0108] (F)額外EBNA-I載體質(zhì)粒 EBV(Epstein-Barr病毒）對細胞的潛伏感染中,EBNA-1 (Epstein-Barr病毒核抗原1) 蛋白在其附加體的復制和維持以及病毒基因組的轉(zhuǎn)錄表達中發(fā)揮極端重要的作用，并且已 知當所述蛋白結(jié)合EBV基因組DNA的OriP區(qū)域時，此類功能得以實現(xiàn)（Frappier, L.，和 O'Donnell, M. (1"1) J. Biol. Chem. 266，7819-7826)。本發(fā)明中的額外 EBNA-I 載體 質(zhì)粒利用EBNA-I的此類功能，使得具有OriP區(qū)域的附加型載體能夠自主復制。本發(fā)明中 的額外EBNA-I載體質(zhì)粒攜帶編碼EBNA-I蛋白的基因，并且可以在哺乳動物細胞中瞬時或 組成型表達EBNA-I蛋白。
[0109] 本發(fā)明中的任何額外EBNA-I載體質(zhì)粒也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它是以 下質(zhì)粒，所述質(zhì)粒具有含有在啟動子調(diào)控下的插入的EBNA-I編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)，且具有使得 EBNA-I編碼區(qū)表達的結(jié)構(gòu)。例如，除了啟動子以外，本發(fā)明中的額外EBNA-I載體質(zhì)?？梢?含有，當期望時，增強子、PolyA添加信號、選擇標記基因等。選擇標記基因的實例包括氨芐 青霉素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。作為調(diào)控 EBNA-I編碼區(qū)的啟動子，使用EFla啟動子、CAG啟動子、SRa啟動子、SV40啟動子、LTR啟 動子、CMV(巨細胞病毒）啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒）啟動子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病 病毒）LTR、HSV-TK(單純皰疹病毒胸苷激酶）啟動子等。在這些中，CAG啟動子、CMV啟動子 等是優(yōu)選的。本發(fā)明中的額外EBNA-I載體質(zhì)?？梢裕?，使用pCX-EGFP (FEBS Letters， 407，313-319，1997)和通過以下步驟來產(chǎn)生。 將WPRE序列插入pCX-EGFP的pA序列的5'側(cè)，并且將SV40ori通過用限制性內(nèi)切 酶BamHI處理而進一步去除。 然后，載體的EGFP部分通過EcoRI去除，并且將EBNA-I編碼區(qū)插入代替。
[0110] 因此獲得的額外EBNA-I載體質(zhì)粒在本說明書中也稱為"pCXWB-EBNA-1"。
[0111] 在另一個實施方案中，本發(fā)明中的額外EBNA-I載體質(zhì)?？梢?，例如，使用 pCX-EGFP (FEBS Letters, 407，313-319，1997)和通過以下步驟來產(chǎn)生。 pCX-EGFP用限制性內(nèi)切酶BamHI處理，以允許自連接（pCXB-EGFP)。 然后，載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI處理，并且插入pCXWB-EBNAl的EcoRI片段 (E)BNA-I 編碼區(qū)）。
[0112] 因此獲得的額外EBNA-I載體質(zhì)粒在本說明書中也稱為"pCXB-EBNAl"。
[0113] 作為額外EBNA-I載體質(zhì)粒的用途實施方案，例如，它可以在iPS細胞建立步驟 中與細胞接觸，同時與攜帶核重編程因子的附加型載體接觸。在另一個實施方案中，額外 EBNA-I載體質(zhì)?？梢栽跀y帶核重編程因子的附加型載體與細胞接觸之前或之后與細胞接 觸。前者實施方案更優(yōu)選用于實施本發(fā)明。
[0114] 作為額外EBNA-I載體質(zhì)粒的iPS細胞建立效率改進效果的機制，例如，可以認為 通過常規(guī)的方法的EBNA-I結(jié)合oriP的量是不足的，這進而阻止攜帶核重編程因子的附加 型載體的充分復制，并且引起核重編程因子的表達水平不足；然而，額外EBNA-I載體質(zhì)粒 可以補償不足量的EBNA-1。顯然，本發(fā)明完全不受影響，即使iPS細胞建立效率的確受到一 些其它機制的改進。
[0115] 在以下本說明書中，使用附加型載體建立的iPS細胞有時縮寫為 "印i-iPS細胞"或"印i-iPSCs"。當本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因的組合被縮寫為"Cl, Tli T2, Y3# Y3十EBSm, Y4, Y令彳Y5+.EBMM, + 時，這些組合如下表 1中顯示。
[0116] 表 I

【權(quán)利要求】
1. 產(chǎn)生iPS細胞的方法，其包括將w下（1)和（2)引入體細胞的步驟： (1) 含有編碼核重編程因子的核酸的一種或多種附加型載體；和 (2) 不同于（1)的含有編碼邸NA-1的核酸的附加型載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進一步包括引入W附加型載體形式的編碼p53功能的抑 制劑的核酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述p53功能的抑制劑是p53 shRNA或p53的顯性失 活突變體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述p53的顯性失活突變體是p53孤。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述核重編程因子是選自O(shè)ct家族、Klf家 族、Sox家族、Myc家族、Lin家族和Glis家族的成員的一種或多種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述核重編程因子是0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc和 Lin28。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述核重編程因子是0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28 和 Glisl。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中將所述編碼核重編程因子的核酸分開并包 含在2或3個附加型載體中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pC邸-hSK-0 和 pC邸-h化-G。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK 和 pCXLE-h化。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK 和 pCXLE-h化。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體是 pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSK 和 pCE-h化。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型質(zhì)粒載 體是pCE-hOCT3/4、pCE-hSK和pCE-h化，且所述含有編碼p53功能的抑制劑的核酸的附加 型載體是pCE-mp53孤。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項的方法，其中所述含有編碼邸NA-1的核酸的質(zhì)粒載體 是 pCXWB-邸NA1。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其中所述含有編碼邸NA-1的核酸的質(zhì)粒載體是 pCXB-EBNAlo
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中所述體細胞選自人成纖維細胞（皿巧和 血細胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述血細胞是外周血單核細胞（PMNC)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述外周血單核細胞（PMNC)是T細胞。
19. 改進iPS細胞建立效率的方法，其包括將含有編碼核重編程因子的核酸的一種或 多種附加型載體引入體細胞的步驟，其中將含有編碼邸NA-1的核酸的不同的附加型載體 與所述載體一起引入體細胞。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其進一步包括引入W附加型載體形式的編碼p53功能的 抑制劑的核酸。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述p53功能的抑制劑是p53 shRNA或p53的顯性 失活突變體。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述p53的顯性失活突變體是P53DD。
23. 用于改進iPS細胞建立效率的試劑，其包含含有編碼邸NA-1的核酸的附加型載體。
24. 用于產(chǎn)生iPS細胞的試劑盒，其包含W下（1)和（2): (1) 含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體；和 (2) 不同于（1)的含有編碼邸NA-1的核酸的附加型載體。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其進一步包含W附加型載體形式的編碼p53功能A的 抑制劑的核酸。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述p53功能的抑制劑是p53 shRNA或p53的顯 性失活突變體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述p53的顯性失活突變體是p53孤。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體 是pC邸-hSK-0和pC邸-h化-G。
29. 根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體 是 pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK 和 pCXLE-h化。
30. 根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體 是 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK 和 pCXLE-h化。
31. 根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型載體 是 pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSK 和 pCE-h化。
32. 根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述含有編碼核重編程因子的核酸的附加型質(zhì)粒 載體是pCE-hOCT3/4、pCE-hSK和pCE-h化，且所述含有編碼p53功能的抑制劑的核酸的附 加型載體是pCE-mp53孤。
33. 根據(jù)權(quán)利要求28-30中任一項的試劑盒，其中所述含有編碼邸NA-1的核酸的質(zhì)粒 載體是pCXWB-邸NA1。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31或32的試劑盒，其中所述含有編碼邸NA-1的核酸的質(zhì)粒載體是 pCXB-EBNAlo
35. 產(chǎn)生體細胞的方法，其包括使通過根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的方法獲得的iPS 細胞進行分化處理，W允許分化為體細胞。
【文檔編號】C12N15/113GK104471060SQ201380026797
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月23日
【發(fā)明者】山中伸彌, 沖田圭介 申請人:國立大學法人京都大學