一株高產l-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構建及其發(fā)酵產l-纈氨酸的方法
【專利摘要】一株高產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構建及其發(fā)酵產L-纈氨酸的方法，屬于食品生物工程【技術領域】。本發(fā)明以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869為出發(fā)菌株，進行基因aceE、alaT和ilvA的敲除組合，獲得ATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA突變菌株，命名為WCC003；在WCC003上進行基因lrp1、brnFE和ilvBNC1的表達組合，獲得表達組合工程菌WCC003/pJYW-4-ilvBNC1-lrp1-brnFE，其已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC?NO：M2014149；并用該表達組合工程菌發(fā)酵生產L-纈氨酸。本發(fā)明基于表達調控蛋白Lrp、轉運蛋白BrnFE及L-纈氨酸合成途徑關鍵基因ilvBNC1的高產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，在谷氨酸棒狀桿菌中Lrp的有利突變Arg39Trp為本發(fā)明首次明確，Lrp和BrnFE用于發(fā)酵生產L-纈氨酸也是本發(fā)明首次報道?；騦rp1、brnFE和ilvBNC1的表達組合的研究也是本發(fā)明首次開創(chuàng)。
【專利說明】一株高產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構建及其發(fā)酵產L-纈氨酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明一株高產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構建及其發(fā)酵產L-纈氨酸的方法，涉及以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869為出發(fā)菌株，進行基因acM、和HvA的敲除組合，獲得ATCC13869 AacM Λ Λ i7 M突變菌株，命名為WCC003 ;在WCC003上進行基因Iiv1、brnFE和ilVBNC1的表達組合，獲得表達組合工程菌WCC003/pJYff-4-17 vBNCrlrprbrnFEr其已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO:M2014149 ;并用該表達組合工程菌發(fā)酵生產L-纈氨酸，屬于食品生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]L-纈氨酸(L-valine)是一種支鏈氨基酸，廣泛運用于食品、飼料、化妝品和醫(yī)藥領域。谷氨酸棒狀桿菌idorynebeicterium glutamicuni)是一種常用的氨基酸工業(yè)生產菌株，優(yōu)點是相對安全、易于培養(yǎng)和改造。L-纈氨酸在谷氨酸棒狀桿菌中的生物合成途徑已經明確(附圖1)。丙酮酸(pyruvate)是L-纟顏氨酸合成的重要前體,通過4步反應合成L-纟顏氨酸，反應的關鍵酶分別為基因編碼的乙酰輕酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS), 基因編碼的乙酸輕酸還原異構酶(acetohydroxyacid isomeroreductase,AHAIR), HvD 基因編碼的二輕酸脫水酶(dihydroxyacid dehydratase, DHAD)和 ilvE 基因編碼的轉氨酶B (transaminase B,TA)。以上4種酶也用于L-異亮氨酸(L-1soleucine)合成，具體是先由丙酮酸和蘇氨酸(threonine)經ilvA基因編碼的蘇氨酸脫水酶(threominedehydratase, TD)催化反應生成2_酮丁酸(2_ketobutyrate),再共用這4種酶催化4步反應生成L-異亮氨酸。 丙酮酸同時還是多種反應的前體，如可以由丙酮酸脫氫酶復合體(其中關鍵酶Elp由acM基因編碼)催化反應生成乙酰輔酶A (acetyl-CoA)進入三羧酸循環(huán)；可以由基因編碼的氨基酸轉氨酶(aminotransferase)催化反應生成L-丙氨酸(L-alanine)。
[0003]代謝工程技術近年來開始用于改造谷氨酸棒狀桿菌以生產L-纈氨酸，一些高效的策略已被報道。其中通過基因的分別敲除可以增加L-纈氨酸合成前體丙酮酸的積累、減少副產物L-丙氨酸和L-異亮氨酸的合成，但尚無這三種基因組合敲除的報道。此外基因簇的過量表達可以促進碳通量更多流向L-纈氨酸合成途徑，從而提高L-纈氨酸產量。
[0004]Zr/?基因編碼的亮氨酸反應調節(jié)蛋白(leucine-responsive regulatory protein,Lrp)是一種細胞全局調控蛋白。基因編碼的BrnFE蛋白是谷氨酸棒狀桿菌支鏈氨基酸的轉運蛋白，其表達水平受到Lrp的調控。已有在大腸桿菌中通過過量表達Lrp生產L-纈氨酸的報道。但在谷氨酸棒狀桿菌中Lrp的調控機制尚未明確，Lrp和BrnFE的利用僅限于L-異亮氨酸，尚無用于發(fā)酵生產L-纈氨酸的報道?；騦rp、brnFE和iIvBNC的表達組合也尚未有研究。
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一株基于表達調控蛋白Lrp、轉運蛋白BrnFE及L-纈氨酸合成途徑關鍵基因HvBNC1,運用新的基因敲除和表達組合策略構建高產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，以及該工程菌發(fā)酵生產L-纈氨酸的方法。
[0006]所述出發(fā)菌株ATCC13869，來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，是一種革蘭氏陰性、好氧型桿菌，主要用于微生物發(fā)酵工程生產谷氨酸。
[0007]所述菌株VWB-1，是一株由ATCC13869隨機誘變得到的L-纈氨酸工業(yè)生產菌。
[0008]一株通過基因敲除提高L-纈氨酸產量并減少副產物L-丙氨酸和L-異亮氨酸合成的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869為出發(fā)菌株，采用(I)基因aceE、alaT和ilvA的敲除組合；(2)基于cre/lox位點特異性重組的敲除方法；獲得
^aceE ^alaTMlvA 突變菌株，命名為 WCC003。
[0009]一株在工程菌WCC003中過量表達調控蛋白Lrp、轉運蛋白BrnFE及L-纈氨酸合成途徑關鍵基因HvBNC1的高產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌表達組合工程菌WCC003/pJYff-4-17 vBNCrlrprbrnFE,其已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO:M2014149，通過(I)基因lrp” brnm琳HvBNC1的表達組合；(2) 編碼的Lrp1蛋白具備有利突變Arg39Trp ； (3)表達載體為pJYW_4。
[0010]用所述的表達組合工程菌CCTCC NO:M2014149發(fā)酵生產L-纈氨酸的方法，將菌株WCCOOS/pJYW-^i/t^VG-h^-^ra/^活化后接種于200mL種子培養(yǎng)基，往復式搖瓶發(fā)酵18h后接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐；氨水控制pH維持在7.2，溫度30°C，溶氧通過轉速和通氣量偶聯(lián)維持在30%，當殘?zhí)呛康陀?0g/L時流加葡萄糖，發(fā)酵時間96h ;最終L-纈氨酸產量達到36.6g/L ；
活化培養(yǎng)基配方為:91g/L山梨醇，18.5g/L腦心浸液，5g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，5g/L葡萄糖,2.5g/L酵母膏,0.4g/L異亮氨酸,30 mg/L卡那霉素，以去離子水配制；
種子培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基適當降低葡萄糖和硫酸銨含量；
發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:120g/L葡萄糖，40g/L硫酸銨，10g/L大豆浸出汁，lg/L磷酸二氫鉀，5g/L乙酸鉀，0.04g/L硫酸亞鐵，0.07g/L硫酸錳，0.1 g/L硫酸鎂，0.7g/L甲硫氨酸，0.4g/L異亮氨酸,0.3mg/L生物素,0.05mg/L VB1, 30 mg/L卡那霉素，以去離子水配制，氫氧化鈉調pH至7.2。
[0011]所述基因敲除組合，包括基因和的共同敲除，相比于出發(fā)菌株顯著提高了 L-纈氨酸的產量，并極大減少了副產物L-丙氨酸和L-異亮氨酸。
[0012]所述基因敲除方法，是一種基于位點特異性重組的、可在谷氨酸棒狀桿菌進行多次的、幾乎無痕的敲除方法(王小元，胡瑾瑜，李顏顏，譚延振，李燁.一種棒狀桿菌基因連續(xù)敲除系統(tǒng)及其構建方法和應用，中國專利，申請?zhí)?01310215508.9)。
[0013]所述基因表達組合，是在出發(fā)表達載體P JYW-4上進行基因IrppbrnFE和il VBNC1的共同過量表達(附圖3)，L-纈氨酸的產量顯著提高。
[0014]所述基因Irp1, brnFE和ilvBNC”來源于L-纈氨酸工業(yè)生產菌VWB-1，其中Irp1編碼的Lrp1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)相比于ATCCl3869有一個有利的點突變Arg39Trp，比野生型Lrp生長抑制作用弱，L-纈氨酸產量更高；BrnFE氨基酸序列(SEQ ID NO: 2) —致'UvBNC1氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)有數(shù)個突變，效果不明。所述菌株VWB-1，是一株由ATCC13869隨機誘變得到的L-纈氨酸工業(yè)生產菌。
[0015]所述載體pJYW-4,是一種用于谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌的穿梭表達載體(王小元，胡瑾瑜，李顏顏，胡曉清，譚延振.一種不依賴抗生素為選擇壓力的棒狀桿菌表達系統(tǒng)，中國專利，申請?zhí)?01410057876.X)。
[0016]所述發(fā)酵方法，是采用特殊配方的發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐水平發(fā)酵96 h，發(fā)酵過程中控制pH和溶氧并且補加葡萄糖。最終L-纈氨酸產量達36.6g/L，且副產物含量極少。
[0017]本發(fā)明的有益效果=ZrjD基因編碼的亮氨酸反應調節(jié)蛋白(leucine-responsiveregulatory protein,Lrp)是一種細胞全局調控蛋白。SraFi?基因編碼的BrnFE蛋白是谷氨酸棒狀桿菌支鏈氨基酸的轉運蛋白，其表達水平受到Lrp的調控。雖已有在大腸桿菌中通過過量表達Lrp生產L-纈氨酸的報道，但在谷氨酸棒狀桿菌中用于發(fā)酵生產L-纈氨酸是本發(fā)明首次報道，Lrp的有利突變Arg39Trp為本發(fā)明首次明確，基因lrp^brnFEM HvBNC1的表達組合的研究也是本發(fā)明首次開創(chuàng)。
[0018]生物材料樣品保藏:谷氨酸棒狀桿菌(^oryiwbeicterium glutamicum) WCC004,(即WC003/p]Y^-A-nvBNCrlrprbrnFBX已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址武漢武漢大學，保藏號CCTCC NO:M2014149，保藏日期2014年4月24日。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1:谷氨酸棒狀桿菌中的L-纈氨酸生物合成途徑及本發(fā)明涉及的代謝改造示意圖
圖2:菌株WCC003構建示意圖 圖3:相關表達載體不意圖。
【具體實施方式】
[0020]實施例1敲除組合菌株WCC003的構建
出發(fā)菌株ATCC13869。對于aceE基因的敲除，先構建帶有aceE基因上下游同源臂和含Λ?#重組酶識別位點的卡那霉素抗性基因篩選標記的敲除載體PDTW301。然后將敲除載體轉入ATCC13869，利用抗性篩選標記(如有可同時利用營養(yǎng)缺陷型)篩選出loxp-kan-loxp與基因組上acM基因上下游同源臂之間的部分進行同源重組的轉化子。接著轉入帶有位點特異性ere重組酶的溫敏質粒PDTW109，利用抗性篩選標記篩選出去除基因組上如/7片段的轉化子。最后改變培養(yǎng)溫度去除PDTW109，通過基因型和表型驗證得到 ATCC13869 Aacei?突變菌株(Jinyu Hu, Yanzhen Tan, Yanyan Li, XiaoqingHu, Daqing Xu, Xiaoyuan Wang, 2013.Construction and application of an efficientmultiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.Plasmid 3:303 -313)。
[0021]基因及的敲除方法和acM的敲除方法類似，需要分別構建帶各自基因上下游同源臂的敲除載體pWCCOOl及pDTW302 (同上Huetal.參考文獻)。在ATCC13869 AaceB 中連續(xù)敲除及得到NaceE NalaTN iIvA 突變菌株，命名為WCC003 (附圖2)。
[0022]實施例2在WCC003中過量表達基因Irp1、brnFE和ilVBNC1首先構建各基因單獨表達載體。將ATCC13869及VWB-1來源的基因Irp及Irp1連接到PJYW-4，構建表達載體PJYW-4-A77及pJYW-4-hT77，發(fā)現(xiàn)表達效果后者生長抑制作用較弱而L-valine產量更高。將VWB-1來源的基因brnFE及UvBNC1分別連接到pJYW_4，得到表達載體 WHbrnFE 及 VmilvBNC10
[0023]然后將vm-brnFE中帶iac啟動子的brnFE基因片段tac-brnFE連接至IjP JYWUrjD7,得到表達載體 P JYWUrjD7-^raFi?;再將 tac—lrp ftac—brnFE 片段連接到pJYW-4-17i^VG，得到最終的表達載體 VmilvBNC1-1rpfbrnFE (附圖 3)。
[0024]最后將pJYW-4_i7成忙廠7巧廠知/?所轉入實施例1中構建的WCC003，得到新的表達組合工程菌WOXMTi / Wmi I vBNCflrp fbrnFE。250mL搖瓶發(fā)酵顯示，相比于WCC003雖然其生長受到一定的限制，但L-纈氨酸的產量顯著增加，達到23.9g/L，糖酸轉化率和產率都有較高水平。
[0025]實施例3 工程菌 WCWYi him-1 IvBNCflrp「brnFE 罐上發(fā)酵
將菌株活化后接種于200mL種子培養(yǎng)基，往復式搖瓶發(fā)酵18h后接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐。氨水控制pH維持在7.2，溫度30°C，溶氧通過轉速和通氣量偶聯(lián)維持在30%，當殘?zhí)呛康陀?0g/L時流加葡萄糖，發(fā)酵時間96h。最終L-纈氨酸產量達到36.6g/L0
[0026]活化培養(yǎng)基配方為:91g/L山梨醇，18.5g/L腦心浸液,5g/L蛋白胨,5g/L氯化鈉，5g/L葡萄糖,2.5g/L酵母膏,0.4g/L異亮氨酸,30 mg/L卡那霉素，以去離子水配制。
[0027]種子培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基適當降低葡萄糖和硫酸銨含量。 [0028]發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:120g/L葡萄糖，40g/L硫酸銨，10g/L大豆浸出汁，lg/L磷酸二氫鉀，5g/L乙酸鉀，0.04g/L硫酸亞鐵，0.07g/L硫酸錳，0.lg/L硫酸鎂，0.7g/L甲硫氨酸，
0.4g/L異亮氨酸,0.3mg/L生物素,0.05mg/L VB1, 30 mg/L卡那霉素，,以去離子水配制,氫氧化鈉調pH至7.2。
【權利要求】
1.一株通過基因敲除提高L-纈氨酸產量并減少副產物L-丙氨酸和L-異亮氨酸合成的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，其特征在于:以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869為出發(fā)菌株，采用Cl)基因aceE、a IaT和ilvA的敲除組合；(2)基于cre/lox位點特異性重組的敲除方法；獲得突變菌株，命名為 WCC003。
2.一株在權利要求1所述的工程菌WCC003中過量表達調控蛋白Lrp、轉運蛋白BrnFE及L-纈氨酸合成途徑關鍵基因HvBNC1的高產L-纈氨酸的谷氨酸棒狀桿菌表達組合工程菌WJmz/WXHiIvBNCflrpfbrnFE,其已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO:M201414 9，其特征在于:(I)基因lrPl、brnFE取HvBNC1的表達組合?人2、Irp1編碼的Lrp1蛋白具備有利突變Arg39Trp ； (3)表達載體為pJYW_4。
3.用權利要求2所述的表達組合工程菌CCTCCNO:M2014149發(fā)酵生產L-纈氨酸的方法，其特征在于:將菌株WCC003/pJYW-4-1hftVG-h777-fo7?/^活化后接種于200mL種子培養(yǎng)基，往復式搖瓶發(fā)酵18h后接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐；氨水控制pH維持在7.2，溫度30°C，溶氧通過轉速和通氣量偶聯(lián)維持在30%，當殘?zhí)呛康陀?0g/L時流加葡萄糖，發(fā)酵時間96h ;最終L-纈氨酸產量達到36.6g/L ； 活化培養(yǎng)基配方為:91g/L山梨醇，18.5g/L腦心浸液，5g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，5g/L葡萄糖,2.5g/L酵母膏,0.4g/L異亮氨酸,30 mg/L卡那霉素，以去離子水配制； 種子培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基適當降低葡萄糖和硫酸銨含量； 發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:120g/L葡萄糖，40g/L硫酸銨，10g/L大豆浸出汁，lg/L磷酸二氫鉀，5g/L乙酸鉀，0.04g/L硫酸亞鐵，0.07g/L硫酸錳，0.1g/L硫酸鎂，0.7g/L甲硫氨酸，.0.4g/L異亮氨酸,0.3mg/L生物素,0.05mg/L VB1, 30 mg/L卡那霉素，以去離子水配制,氫氧化鈉調pH至7.2。
【文檔編號】C12P13/08GK104004678SQ201410183974
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權日:2014年5月5日
【發(fā)明者】王小元, 陳誠, 李顏顏, 胡瑾瑜 申請人:江南大學