本發(fā)明涉及以氧化石墨烯鉑納米復合材料為探針的谷胱甘肽檢測試劑盒，屬于分析化學及納米技術領域。

背景技術：

谷胱甘肽（?-γ-谷氨酰-?-半胱氨酰甘氨酸，gsh）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽。它是哺乳動物組織中最豐富的非蛋白質巰基生物分子，并參與多種生理過程，如代謝和抗氧化防御。細胞內gsh濃度范圍在1至10mmol/l。在正常生理情況下，谷胱甘肽還原酶可以維持谷胱甘肽的量比它的氧化形式的量高200～800倍。然而，當細胞受到的氧化壓力增加時，更多的谷胱甘肽轉化為其氧化態(tài)，導致細胞內gsh水平下降，引起許多疾病的發(fā)生和發(fā)展。相反，gsh升高通常出現(xiàn)于各種癌細胞，可產(chǎn)生氧化應激抵抗效應。由于gsh廣泛參與各種生物學功能，因此建立有效的方法在生理條件下檢測gsh具有重要的意義。

催化活性納米材料因其性能穩(wěn)定、催化活性可調、催化效率高、成本低廉等優(yōu)點，可作為天然酶的有效替代品，并廣泛應用于生物醫(yī)學和環(huán)境化學等。其中，基于組件特性組合的協(xié)同增強性能的復合納米材料更是受到了廣泛的關注。

本發(fā)明以氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針，基于氧化石墨烯鉑納米復合材料良好的模擬過氧化物酶活性，結合谷胱甘肽對氧化石墨烯鉑納米復合材料催化體系的作用，用于谷胱甘肽的檢測，提供了一種簡便、靈敏的谷胱甘肽檢測試劑盒。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種以氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒。試劑盒中包括提供氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液（a液），3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽過氧化氫溶液（b液）和谷胱甘肽溶液（標準貯備液）。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

本發(fā)明所述的一種基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒，其特征是試劑盒中有氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽過氧化氫溶液和谷胱甘肽溶液，所述的氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液作為a液，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽過氧化氫溶液作為b液，谷胱甘肽溶液為標準貯備液；所述的氧化石墨烯鉑納米復合材料由以下方法制備：往9.225ml濃度為2mg/ml的氧化石墨烯溶液中加入0.575ml濃度為10mg/ml的氯鉑酸水溶液，混勻劇烈攪拌15min后，逐滴加入0.2ml濃度為5mg/ml的硼氫化鈉水溶液，磁力攪拌4小時后即得，將得到的反應產(chǎn)物冷凍干燥得到氧化石墨烯鉑納米復合材料。

所述的基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒，其特征是a液為用雙蒸水配制，濃度為11.5mg/l的氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液；b液為用10mmol/l，ph=5磷酸鹽緩沖溶液配制的含濃度為26.7mmol/l的過氧化氫和濃度為0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液；標準貯備液為濃度為0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液。

所述的基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒，其特征是吸光度測定波長為652nm。

所述的基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒，其特征是谷胱甘肽測定的線性范圍為0.02~20μmol/l，檢測限為4nmol/l。

本發(fā)明所述的一種基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒測定谷胱甘肽的方法，其特征是將谷胱甘肽標準貯備液用雙蒸水稀釋為0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列標準溶液，在200μl雙蒸水和上述系列標準溶液中分別加入50μla液和3.75mlb液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，雙蒸水對照組的吸光度為a0，谷胱甘肽測定組的吸光度為a，以a0/a對谷胱甘肽濃度作圖繪制谷胱甘肽標準曲線或計算回歸方程。

所述的基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒測定谷胱甘肽的方法，其特征是a液為用雙蒸水配制，濃度為11.5mg/l的氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液；b液為用10mmol/l，ph=5磷酸鹽緩沖溶液配制的含濃度為26.7mmol/l的過氧化氫和濃度為0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液。

所述的一種基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒測定谷胱甘肽的方法，其特征是測定谷胱甘肽的線性范圍為0.02~20μmol/l，檢測限為4nmol/l。

本發(fā)明所述的一種基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒測定溶血樣品中谷胱甘肽的方法，其特征是將谷胱甘肽標準貯備液用雙蒸水稀釋為0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列標準溶液，在200μl雙蒸水和上述系列標準溶液中加入50μla液和3.75mlb液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，雙蒸水對照組的吸光度為a0，谷胱甘肽測定組的吸光度為a，以a0/a對谷胱甘肽濃度作圖繪制谷胱甘肽標準曲線或計算回歸方程；取人溶血樣品，13000rpm，4^oc超濾25分鐘，濾液用雙蒸水稀釋5倍，在200μl人溶血樣品稀釋液中加入50μla液和3.75mlb液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，根據(jù)谷胱甘肽標準曲線進行定量，獲得溶血樣品中的谷胱甘肽含量。

所述的基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒測定溶血樣品中谷胱甘肽的方法，其特征是a液為用雙蒸水配制，濃度為11.5mg/l的氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液；b液為用10mmol/l，ph=5磷酸鹽緩沖溶液配制的含濃度為26.7mmol/l的過氧化氫和濃度為0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液。

具體地說，本發(fā)明采用以下技術方案：

（一）氧化石墨烯的制備：稱取325目鱗片石墨，加入到體積比為9:1的濃硫酸和磷酸混合溶液中。充分攪拌后，置于在0℃冰浴中。將高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中進行低溫插層反應。磁力攪拌3小時后，將所得的墨綠色混懸液轉移至35℃溫水浴進行中溫反應，控溫反應1小時。再將得到的混懸液轉移至50℃溫水浴進行高溫深度氧化，控溫12小時。得到的紫黑色混懸液緩慢加入到冰水混合物中，劇烈攪拌1小時。繼而往溶液中逐滴滴加30%過氧化氫溶液，至溶液顏色突變?yōu)榱咙S色。所得溶液經(jīng)g1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過濾，繼而4000轉每分鐘離心30分鐘，分別經(jīng)過水洗一次和酸洗一次后，醇洗至中性，最后用乙醚沖洗后經(jīng)g5砂芯漏斗（孔徑1.5-2.5微米）過濾。濾餅在室溫下過夜晾干，得到氧化石墨。將氧化石墨分散于雙蒸水，常溫下超聲5小時，充分剝離后得到氧化石墨烯水溶液。

（二）氧化石墨烯鉑納米復合材料的制備：往9.225ml濃度為2mg/ml的氧化石墨烯溶液中加入0.575ml濃度為10mg/ml的氯鉑酸水溶液，混勻劇烈攪拌15min后，逐滴加入0.2ml濃度為5mg/ml硼氫化鈉水溶液，磁力攪拌4小時。得到的氧化石墨烯鉑納米復合材料水溶液呈深棕色，冷凍干燥得到氧化石墨烯鉑納米復合材料。以上過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。

（三）谷胱甘肽檢測試劑盒：a液包括上述技術方案（二）制備后用雙蒸水配制，濃度為11.5mg/l的氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液，b液包括用10mmol/l，ph=5磷酸鹽緩沖溶液配制的含濃度為26.7mmol/l的過氧化氫和濃度為0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液，標準貯備液包括濃度為0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液。

（四）谷胱甘肽的檢測方法

將技術方案（三）的標準貯備液用雙蒸水稀釋為0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列標準溶液，在200μl系列標準溶液中加入50μl技術方案（三）的a液和3.75ml技術方案（三）的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，繪制谷胱甘肽標準曲線或計算回歸方程。在200μl樣品溶液中加入50μl技術方案（三）的a液和3.75ml技術方案（三）的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，根據(jù)標準曲線進行定量。

本發(fā)明的優(yōu)點：

（1）本發(fā)明基于谷胱甘肽可還原氧化態(tài)的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，并可清除羥自由基的雙重協(xié)同作用，抑制氧化石墨烯鉑納米復合材料仿生催化體系反應，用于谷胱甘肽的檢測。

（2）本發(fā)明使用的氧化石墨烯鉑納米復合材料其制備過程快速、簡便。

（3）本發(fā)明所構建的試劑盒與檢測方法特異性好、靈敏度高、檢測時間短，谷胱甘肽檢測線性范圍為0.02~20μmol/l，檢測限低至4nmol/l。

附圖說明

圖1為谷胱甘肽與氧化石墨烯鉑納米復合材料催化體系作用后的紫外可見吸收光譜圖。

圖2為谷胱甘肽測定的標準曲線圖。

具體實施方式

實施例1：

稱取325目鱗片石墨1.2g，加入到144ml濃度為18.4mol/l的濃硫酸和16ml濃度為14.7mol/l的磷酸的混合溶液中。充分攪拌后，置于在0℃冰浴中。將7.2g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中進行低溫插層反應。保持0℃冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠色混懸液轉移至35℃溫水浴進行中溫反應，控溫反應1小時。再將得到的混懸液轉移至50℃溫水浴進行高溫深度氧化，控溫12小時。得到的紫黑色混懸液緩慢加入到160ml冰水混合物中，劇烈攪拌1小時。繼而往溶液中逐滴滴加4.8ml30wt%過氧化氫溶液，溶液顏色突變?yōu)榱咙S色。所得溶液經(jīng)g1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過濾，濾液4000轉/分鐘離心30分鐘，棄去上清液；在沉淀中加入80ml雙蒸水充分振蕩洗滌，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入80ml30wt%鹽酸充分振蕩洗滌，經(jīng)g1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過濾去除不溶顆粒，濾液4000轉/分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色繼續(xù)加深；接著多次用無水乙醇將沉淀物洗至ph值為中性，4000轉/分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀呈棕黃色；最后用乙醚沖洗沉淀，經(jīng)g5砂芯漏斗（孔徑1.5-2.5微米）過濾。濾餅在室溫下過夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。取100mg氧化石墨溶解于50ml雙蒸水，常溫下超聲5小時，充分剝離后得到2mg/ml透明澄清的棕黃色氧化石墨烯水溶液。

實施例2：

往9.225ml實施例1制得的濃度為2mg/ml的氧化石墨烯溶液中加入0.575ml濃度為10mg/ml的氯鉑酸水溶液，混勻劇烈攪拌15min后，逐滴加入0.2ml濃度為5mg/ml的硼氫化鈉水溶液，磁力攪拌4小時后即得。將得到的反應產(chǎn)物冷凍干燥得到氧化石墨烯鉑納米復合材料。

實施例3：

一種基于氧化石墨烯鉑納米復合材料作為仿生催化探針的谷胱甘肽檢測試劑盒。試劑盒中包括提供氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液（a液），3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽過氧化氫溶液（b液）和谷胱甘肽溶液（標準貯備液）。a液包括上述實施例2制備后用雙蒸水配制，濃度為11.5mg/l的氧化石墨烯鉑納米復合材料溶液，b液包括用10mmol/l，ph=5磷酸鹽緩沖溶液配制的含濃度為26.7mmol/l的過氧化氫和濃度為0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液，標準貯備液為濃度為0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液。

實施例4：

在200μl雙蒸水中分別加入50μl實施例3的a液和3.75ml實施例3的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，溶液呈明顯藍色，如圖1所示，顯色產(chǎn)物最大吸收波長為652nm。在200μl濃度為0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液的標準貯備液中分別加入50μl實施例3的a液和3.75ml實施例3的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定紫外可見吸收光譜，如圖1所示，在谷胱甘肽存在的情況下，催化顯色體系的吸光度顯著降低。

實施例5：

將實施例3的標準貯備液用雙蒸水稀釋為0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列標準溶液，在200μl雙蒸水和系列標準溶液中加入50μl實施例3的a液和3.75ml實施例3的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，雙蒸水對照組的吸光度為a0，谷胱甘肽測定組的吸光度為a，以a0/a對谷胱甘肽濃度作圖繪制谷胱甘肽標準曲線或計算回歸方程。如圖2所示，測定的線性范圍為0.02~20μmol/l，回歸方程相關系數(shù)為0.996，檢測限為4nmol/l。

實施例6：

將實施例3的標準貯備液用雙蒸水分別稀釋為0.004mmol/l和0.1mmol/l的標準溶液，在200μl雙蒸水和上述系列標準溶液中加入50μl實施例3的a液和3.75ml實施例3的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，每個濃度平行測定6份，測定的標準偏差分別為0.5%和1.8%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

實施例7：

取人溶血樣品，13000rpm，4^oc超濾25分鐘，濾液用雙蒸水稀釋5倍，在200μl人溶血樣品稀釋液中加入50μl實施例3的a液和3.75ml實施例3的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，根據(jù)實施例6標準曲線進行定量，獲得溶血樣品中的谷胱甘肽含量。

實施例8：

取人溶血樣品，13000rpm，4^oc超濾25分鐘，濾液用雙蒸水稀釋2.5倍，在100μl人溶血樣品稀釋液中加入100μl不同濃度的谷胱甘肽標準液，50μl實施例3的a液和3.75ml實施例3的b液，充分混勻后置于30°c水浴反應5分鐘，測定652nm波長處的吸光度值，根據(jù)谷胱甘肽標準曲線計算谷胱甘肽含量并計算回收率。如下表所示，本發(fā)明方法的回收率為95%-112.5%；

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。