本發(fā)明屬于基因工程和生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種利用食品安全級(jí)的微生物重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的方法。

背景技術(shù)：

四氫嘧啶(ectoine)是一種環(huán)狀的氨基酸衍生物，是許多耐鹽微生物為維持滲透壓平衡而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種相容性溶質(zhì)，對(duì)于細(xì)胞/酶的抗逆性具有重要的作用，可以緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學(xué)試劑對(duì)蛋白、核酸、生物膜及整個(gè)細(xì)胞的毒害作用。因此四氫嘧啶目前已被廣泛地應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、酶制劑領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

目前，四氫嘧啶的生產(chǎn)方法主要通過(guò)嗜鹽微生物特別是鹽單胞菌的高密度發(fā)酵來(lái)獲得。這個(gè)過(guò)程通過(guò)采用被稱為“細(xì)菌擠奶法”的方式進(jìn)行生產(chǎn)，即先在高滲透壓下培養(yǎng)細(xì)胞并在胞內(nèi)積累四氫嘧啶，然后通過(guò)低滲沖擊刺激四氫嘧啶從胞內(nèi)釋放到胞外，然后再重復(fù)進(jìn)行高滲培養(yǎng)、低滲沖擊，以獲得較高濃度的四氫嘧啶。這個(gè)過(guò)程操作繁雜，且需要在高鹽條件下進(jìn)行培養(yǎng)，因此對(duì)設(shè)備要求高，導(dǎo)致其生產(chǎn)價(jià)格十分昂貴。

目前正在開發(fā)的一些工藝采用重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以葡萄糖或者天冬氨酸為底物在低鹽的條件下即可獲得較高濃度的四氫嘧啶，簡(jiǎn)化了四氫嘧啶的生產(chǎn)工藝。然而，大腸桿菌會(huì)分泌內(nèi)毒素，而四氫嘧啶主要應(yīng)用于化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域，因此必須去除內(nèi)毒素，使得整個(gè)分離過(guò)程較為復(fù)雜，增加了生產(chǎn)成本。因此開發(fā)安全高效的重組微生物使其能夠在低鹽的條件下連續(xù)生產(chǎn)四氫嘧啶且不會(huì)分泌內(nèi)毒素，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種生物安全度高、產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)便且成本低廉的利用重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

四氫嘧啶的生物合成途徑如圖1所示。本發(fā)明主要改造方案為：在谷氨酸棒桿菌中過(guò)表達(dá)解除反饋抑制的天冬氨酸激酶基因lysc(序列如seqid1所示)，強(qiáng)化流向天冬氨酸途徑的碳流量，該基因包含定點(diǎn)突變q298g且包含一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子p1；通過(guò)置換二氫嘧啶二羧酸合成酶的啟動(dòng)子(序列如seqid2所示)弱化二氫嘧啶二羧酸合成酶的活性，降低流向賴氨酸的碳流量；過(guò)表達(dá)四氫嘧啶合成途徑相關(guān)基因ectabc(序列如seqid1所示)；將該菌株在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)獲得四氫嘧啶。

本發(fā)明首先提供一種重組谷氨酸棒桿菌，含有突變后的lysc基因及啟動(dòng)子，突變后的dapa基因及啟動(dòng)子和ectabc基因；

所述突變后的lysc基因及啟動(dòng)子的序列如seqidno.1所示；

所述突變后的dapa基因及啟動(dòng)子的序列如seqidno.2所示；

所述ectabc基因的序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明的重組谷氨酸棒桿菌，通過(guò)以下方法制備得到：

(1)將解除反饋抑制的天冬氨酸激酶基因lysc和強(qiáng)啟動(dòng)子片段p1連接到自殺性質(zhì)粒上，獲得的重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌中，得到重組菌c.glutamicumlysc-p1-298；

(2)通過(guò)啟動(dòng)子置換弱化重組菌c.glutamicumlysc-p1-298中的二氫嘧啶二羧酸合成酶基因dapa的表達(dá)，得到重組菌c.glutamicumlysc-dap；

(3)在重組菌c.glutamicumlysc-dap中轉(zhuǎn)入能夠過(guò)表達(dá)四氫嘧啶合成途徑相關(guān)基因ectabc的表達(dá)載體，構(gòu)建得到重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc。

其中，步驟(1)是將lysc1，lysc2，lysc3和強(qiáng)啟動(dòng)子片段p1連接到自殺性質(zhì)粒上，所述lysc1，lysc2，lysc3分別通過(guò)引物對(duì)seqidno.5-6，seqidno.7-8，seqidno.9-10以谷氨酸棒桿菌基因組為模板pcr擴(kuò)增得到。

所述強(qiáng)啟動(dòng)子片段p1，其序列如seqidno.4所示，所述自殺性質(zhì)粒為pk18mobsacb。

步驟(2)是將dap1和dap2片段連接到自殺性質(zhì)粒上，獲得的重組質(zhì)粒；

所述dap1和dap2片段分別通過(guò)引物對(duì)seqidno.11-12，seqidno.13-14以谷氨酸棒桿菌基因組為模板pcr擴(kuò)增得到。

步驟(3)是將ectabc基因連接到表達(dá)載體pxmj19上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pxmj-ectabc，將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入步驟(2)的重組菌c.glutamicumlysc-dap中；所述ectabc基因通過(guò)引物對(duì)seqidno.15-16以halomonaselongatadsm2581(購(gòu)自dsmz)基因組為模板pcr擴(kuò)增得到。

本發(fā)明的重組谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)基中含有氯霉素。具體地，含有5mg/l氯霉素。

本發(fā)明提供了重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc在生產(chǎn)四氫嘧啶中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了利用權(quán)利要求重組谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，以含可發(fā)酵糖的原料為底物，接入重組谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc，發(fā)酵溫度28-40℃，ph值5-8，溶氧值10％進(jìn)行發(fā)酵。

所述含可發(fā)酵糖的原料為糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、玉米漿、木糖、甘露糖或甘油；發(fā)酵溫度為32-35℃，ph值6-7，在發(fā)酵3-5h時(shí)添加終濃度為0.01-1mm的iptg。

發(fā)酵過(guò)程中流加碳源，以及發(fā)酵培養(yǎng)基中含有硫胺素和生物素。

谷氨酸棒桿菌是一種食品安全級(jí)的微生物，廣泛應(yīng)用于氨基酸的生產(chǎn)，比如谷氨酸和賴氨酸的生產(chǎn)。谷氨酸棒桿菌不會(huì)分泌內(nèi)毒素，因此利用谷氨酸棒桿菌來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶解決了生物安全性的問(wèn)題，大大簡(jiǎn)化了后提取工藝。本發(fā)明所構(gòu)建的重組谷氨酸棒桿菌能夠利用葡萄糖等廉價(jià)原料在低鹽的條件下連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶，大大簡(jiǎn)化了四氫嘧啶的發(fā)酵過(guò)程。同時(shí)谷氨酸棒桿菌能夠利用不同的廉價(jià)原料進(jìn)行發(fā)酵，例如利用廢棄糖蜜、蔗糖、淀粉水解液等，同時(shí)還可以使用廉價(jià)的玉米漿作為營(yíng)養(yǎng)成分替代昂貴的酵母粉，因此可以進(jìn)一步降低原料的成本。同時(shí)本發(fā)明的重組谷氨酸棒桿菌解決了生物安全性問(wèn)題，簡(jiǎn)化了后提取工藝，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為四氫嘧啶的生物合成途徑以及本發(fā)明的主要改造位點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1過(guò)表達(dá)解除反饋抑制的天冬氨酸激酶基因lysc

四氫嘧啶的直接合成前體是天冬氨酸，從天冬氨酸到四氫嘧啶合成途徑的第一個(gè)酶天冬氨酸激酶受到賴氨酸和蘇氨酸的反饋抑制。因此，本發(fā)明首先通過(guò)在天冬氨酸激酶基因中引入定點(diǎn)突變q298g來(lái)解除以賴氨酸和蘇氨酸對(duì)該酶的反饋抑制，并在該基因(lysc)前插入一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子p1(序列為5’-ggtgcacaaagcaaaagctgggtacctctatctggtgccctaaacgggggaatattaacgggcccagggtggtcgcaccttggttggtaggagtagcatgggatcc-)(seqidno.4)來(lái)強(qiáng)化該基因的表達(dá)。具體的實(shí)施過(guò)程如下：

以谷氨酸棒桿菌mb001(baumgartmetal，applenvironmicrobiol79:6006-15(2013))的基因組為模板，以引物lysc-1-f(aggaaacagctatgacatgattacgtttcgcccagaaccaagtagcc)和lysc-1-r(cccagcttttgctttgtgcacctttcgatctacgt)為引物進(jìn)行pcr，獲得基因片段lysc1約1.0kb并進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化。以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物lysc-2-f(catgggatccatggccctggtcgtacagaa)和lysc-2-r(gagacgttgcccagaaccatgtcaatgttgatttctgca)為引物進(jìn)行pcr，獲得基因片段lysc2約0.9kb并進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化。以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物lysc-3-f(acatggttctgggcaacgtctcttctgtagaagacg)和lysc-3-r(tgcatgcctgcaggtcgactacataaggtccgacatcgcct)為引物進(jìn)行pcr，獲得基因片段lysc3約1.0kb并進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒pec-yqhd-pducdegh(huangetal.,scientificreports7:42246,2017)為模板，以引物p1-f(ggtgcacaaagcaaaagctgggtacctctatctggt)和p1-r(ccagggccatggatcccatgctactcct)為引物進(jìn)行pcr，獲得基因片段p1約0.1kb并進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化。將谷氨酸棒桿菌自殺性質(zhì)粒pk18mobsacb(journalofbiotechnology104(2003)287-299)用ecori/xbai進(jìn)行雙酶切，利用gibsonassembly試劑盒(neb)將lysc1,lysc2,lysc3和p1片段一步連接到pk18mobsacb上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pk18-lysc。利用電穿孔儀(伯樂(lè))將pk18-lysc通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌mb001中，電擊條件為電壓2.5kv，電阻200ω，電容25μf(電擊杯寬度為2mm)，通過(guò)兩次篩選獲得重組菌。一次重組菌在含25mg/l的卡那霉素lb平板上篩選。該重組菌進(jìn)一步在液體lb培養(yǎng)基里過(guò)夜培養(yǎng)，之后在含有100g/l的蔗糖lb平板上進(jìn)行二次篩選。利用p1-1-f和lysc-3-r為引物進(jìn)行菌落pcr，正確的重組子能克隆出約2kb的片段，該重組菌命名為c.glutamicumlysc-p1-298。該重組菌的關(guān)鍵特征是包括突變后的lysc基因及啟動(dòng)子，序列seqidno.1所示，在該核酸序列的第998-1000位堿基發(fā)生定點(diǎn)突變q298g。該重組菌可以利用80g/l的葡萄糖產(chǎn)18g/l的賴氨酸，而野生菌株mb001不能產(chǎn)賴氨酸，說(shuō)明在本實(shí)施例中，lysc基因修飾是成功的，即葡萄糖能夠流向賴氨酸和四氫嘧啶共同的代謝支路。具體的發(fā)酵過(guò)程見實(shí)施例4。

實(shí)施例2啟動(dòng)子置換弱化二氫嘧啶二羧酸合成酶基因dapa的表達(dá)

由于重組菌c.glutamicumlysc-p1-298的主要發(fā)酵產(chǎn)物是賴氨酸，為了使更多的底物用于四氫嘧啶的合成，進(jìn)一步弱化二氫嘧啶二羧酸合成酶基因dapa的表達(dá)。

以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物dap-1-f(ctatgacatgattacgaattcagatggttttcctgaccagctt)和dap-1-r(gggaagaaggaaaccttgaactctatgagcacagg)為引物進(jìn)行pcr，獲得基因片段dap1約1.0kb并進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化。以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物dap-2-f(ttcaaggtttccttcttccctcatttggggg)和dap-2-r(tgcctgcaggtcgactctagaggcctgtaaaggctcatttcag)為引物進(jìn)行pcr，獲得基因片段dap2約1.0kb并進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化。將谷氨酸棒桿菌自殺性質(zhì)粒pk18mobsacb(journalofbiotechnology104(2003)287-299)用ecori/xbai進(jìn)行雙酶切，利用gibsonassembly試劑盒(neb)將dap1和dap2片段一步連接到pk18mobsacb上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pk18-dap。利用電穿孔儀(伯樂(lè))將pk18-dap通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-p1-298中，電擊條件為電壓2.5kv，電阻200ω，電容25μf(電擊杯寬度為2mm)，通過(guò)兩次篩選獲得重組菌。一次重組菌在含25mg/l的卡那霉素lb平板上篩選。該重組菌進(jìn)一步在液體lb培養(yǎng)基里過(guò)夜培養(yǎng)，之后在含有100g/l的蔗糖lb平板上進(jìn)行二次篩選。利用dap-1-f和dap-2-r為引物進(jìn)行菌落pcr并進(jìn)行測(cè)序，正確的重組菌命名為c.glutamicumlysc-dap。該重組菌的關(guān)鍵特征是包括突變后的dapa基因及啟動(dòng)子，序列seqidno.2所示。該重組菌可以利用80g/l的葡萄糖產(chǎn)6g/l的賴氨酸同時(shí)生產(chǎn)2g/l的甘氨酸。具體的發(fā)酵過(guò)程見實(shí)施例4。

實(shí)施例3過(guò)表達(dá)四氫嘧啶合成途徑相關(guān)基因ectabc

為了強(qiáng)化表達(dá)四氫嘧啶合成途徑的關(guān)鍵基因，人工合成了ectabc基因，序列如seqidno.3所示。將halomonaselongatadsm2581基因組以引物ectabc-f(tgcatgcctgcaggtcgactaggaggcccttcagatgaacg)和ectabc-r(ccgccaaaacagccaagctgttacagcggcttctggtcgt)為引物進(jìn)行pcr，獲得基因片段ectabc約2.5kb并進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化。將谷氨酸棒桿菌表達(dá)質(zhì)粒pxmj19(購(gòu)置addgene)用ecori/xbai進(jìn)行雙酶切，利用gibsonassembly試劑盒(neb)將ectabc基因片段一步連接到pxmj19上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pxmj-ectabc。利用電穿孔儀(伯樂(lè))將pxmj-ectabc通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap中，電擊條件為電壓2.5kv，電阻200ω，電容25μf(電擊杯寬度為2mm)，在含5mg/l的氯霉素lb平板上篩選重組菌，該重組菌命名為c.glutamicumlysc-dap-ectabc。該重組菌的關(guān)鍵特征是包括ectabc基因，序列seqidno.3所示。該重組菌可以利用80g/l的葡萄糖產(chǎn)12g/l的四氫嘧啶，而實(shí)施例1和2中的菌均不能產(chǎn)四氫嘧啶。具體的發(fā)酵過(guò)程見實(shí)施例4。

實(shí)施例4重組谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc的發(fā)酵

將谷氨酸棒桿菌野生菌株mb001以及重組菌株c.glutamicumlysc-p1-298，c.glutamicumlysc-dap，c.glutamicumlysc-dap-ectabc在lb平板上過(guò)夜培養(yǎng)。從該新鮮平板上單菌落接種到含有30ml種子培養(yǎng)基的250ml帶檔板搖瓶中，32℃，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)。

種子培養(yǎng)基的配方包括(g/l)：葡萄糖40，(nh4)2so45.0,k2hpo41.5,mgso41.0,mnso40.005,feso40.005,玉米漿30。c.glutamicumlysc-dap-ectabc培養(yǎng)基中額外添加5mg/l氯霉素。

以10％的接種量將種子液接種到2l發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中，發(fā)酵采用5l的發(fā)酵罐，控制溫度為32℃，通氣量為1vvm，調(diào)整轉(zhuǎn)速使得溶氧水平保持在10％以上，通過(guò)流加氨水控制ph值穩(wěn)定在7.0左右。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方包括(g/l)：葡萄糖80，(nh4)2so430.0,k2hpo42.5,mgso41.0,mnso40.010,feso40.010,玉米漿15，生物素0.0005,鹽酸硫胺素0.005。c.glutamicumlysc-dap-ectabc培養(yǎng)基中額外添加5mg/l氯霉素，并在發(fā)酵3h時(shí)添加1mm的iptg。

發(fā)酵72小時(shí)，通過(guò)液相色譜檢測(cè)產(chǎn)物濃度。野生菌株mb001不產(chǎn)氨基酸及四氫嘧啶，實(shí)施例1得到的重組菌c.glutamicumlysc-p1-298產(chǎn)18g/l的賴氨酸但不產(chǎn)四氫嘧啶。實(shí)施例2得到的重組菌c.glutamicumlysc-dap產(chǎn)6g/l的賴氨酸及2g/l的甘氨酸但不產(chǎn)四氫嘧啶。實(shí)施例3得到的重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc產(chǎn)2g/l的賴氨酸及12g/l的四氫嘧啶。

可見，在本申請(qǐng)實(shí)施例1和2的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建的重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc能夠發(fā)酵底物生產(chǎn)四氫嘧啶，與現(xiàn)有技術(shù)的其他菌相比，生產(chǎn)四氫嘧啶的量在同一個(gè)水平級(jí)上，但由于本發(fā)明的重組菌谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc為食品安全級(jí)，不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，省去了在后續(xù)工程去除毒素分離提純產(chǎn)物的繁瑣步驟，不僅提高了產(chǎn)品的安全性，同時(shí)極大地降低了生產(chǎn)成本。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>清華大學(xué)

<120>一種利用重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的方法

<130>khp171112919.2

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1372

<212>dna

<213>突變后的lysc基因及啟動(dòng)子

<400>1

ggtgcacaaagcaaaagctgggtacctctatctggtgccctaaacgggggaatattaacg60

ggcccagggtggtcgcaccttggttggtaggagtagcatgggatccatggccctggtcgt120

acagaaatatggcggttcctcgcttgagagtgcggaacgcattagaaacgtcgctgaacg180

gatcgttgccaccaagaaggctggaaatgatgtcgtggttgtctgctccgcaatgggaga240

caccacggatgaacttctagaacttgcagcggcagtgaatcccgttccgccagctcgtga300

aatggatatgctcctgactgctggtgagcgtatttctaacgctctcgtcgccatggctat360

tgagtcccttggcgcagaagcccaatctttcacgggctctcaggctggtgtgctcaccac420

cgagcgccacggaaacgcacgcattgttgatgtcactccaggtcgtgtgcgtgaagcact480

cgatgagggcaagatctgcattgttgctggtttccagggtgttaataaagaaacccgcga540

tgtcaccacgttgggtcgtggtggttctgacaccactgcagttgcgttggcagctgcttt600

gaacgctgatgtgtgtgagatttactcggacgttgacggtgtgtataccgctgacccgcg660

catcgttcctaatgcacagaagctggaaaagctcagcttcgaagaaatgctggaacttgc720

tgctgttggctccaagattttggtgctgcgcagtgttgaatacgctcgtgcattcaatgt780

gccacttcgcgtacgctcgtcttatagtaatgatcccggcactttgattgccggctctat840

ggaggatattcctgtggaagaagcagtccttaccggtgtcgcaaccgacaagtccgaagc900

caaagtaaccgttctgggtatttccgataagccaggcgaggctgcgaaggttttccgtgc960

gttggctgatgcagaaatcaacattgacatggttctgggcaacgtctcttctgtagaaga1020

cggcaccaccgacatcaccttcacctgccctcgttccgacggccgccgcgcgatggagat1080

cttgaagaagcttcaggttcagggcaactggaccaatgtgctttacgacgaccaggtcgg1140

caaagtctccctcgtgggtgctggcatgaagtctcacccaggtgttaccgcagagttcat1200

ggaagctctgcgcgatgtcaacgtgaacatcgaattgatttccacctctgagattcgtat1260

ttccgtgctgatccgtgaagatgatctggatgctgctgcacgtgcattgcatgagcagtt1320

ccagctgggcggcgaagacgaagccgtcgtttatgcaggcaccggacgctaa1372

<210>2

<211>1105

<212>dna

<213>突變后的dapa基因及啟動(dòng)子

<400>2

gcaaagctcacacccacgagctaaaaattcatatagttaagacaacatttttggctgtaa60

aagacagccgtaaaaacctcttgctcgtgtcaattgttcttatcggaatgtggcttgggc120

gattgttatgcaaaagttgttaggttttttgcggggttgtttaacccccaaatgagggaa180

gaaggaaaccttgaactctatgagcacaggtttaacagctaagaccggagtagagcactt240

cggcaccgttggagtagcaatggttactccattcacggaatccggagacatcgatatcgc300

tgctggccgcgaagtcgcggcttatttggttgataagggcttggattctttggttctcgc360

gggcaccactggtgaatccccaacgacaaccgccgctgaaaaactagaactgctcaaggc420

cgttcgtgaggaagttggggatcgggcgaagctcatcgccggtgtcggaaccaacaacac480

gcggacatctgtggaacttgcggaagctgctgcttctgctggcgcagacggccttttagt540

tgtaactccttattactccaagccgagccaagagggattgctggcgcacttcggtgcaat600

tgctgcagcaacagaggttccaatttgtctctatgacattcctggtcggtcaggtattcc660

aattgagtctgataccatgagacgcctgagtgaattacctacgattttggcggtcaagga720

cgccaagggtgacctcgttgcagccacgtcattgatcaaagaaacgggacttgcctggta780

ttcaggcgatgacccactaaaccttgtttggcttgctttgggcggatcaggtttcatttc840

cgtaattggacatgcagcccccacagcattacgtgagttgtacacaagcttcgaggaagg900

cgacctcgtccgtgcgcgggaaatcaacgccaaactatcaccgctggtagctgcccaagg960

tcgcttgggtggagtcagcttggcaaaagctgctctgcgtctgcagggcatcaacgtagg1020

agatcctcgacttccaattatggctccaaatgagcaggaacttgaggctctccgagaaga1080

catgaaaaaagctggagttctataa1105

<210>3

<211>2432

<212>dna

<213>ectabc

<400>3

atgaacgcaaccacagagccctttacaccctccgccgacctggccaagcccagcgtggcc60

gatgccgtggtcggccatgaggcctcaccgctcttcatccgcaagccaagccccgatgac120

ggctggggcatctacgagctggtcaagtcctgtccgcctctcgacgtcaattccgcctac180

gcctatctgttgctggccacccagttccgcgatagctgcgccgtggcgaccaacgaagag240

ggcgagatcgtcggcttcgtttccggctacgtgaagagcaacgcccccgatacctatttc300

ctctggcaggttgccgtgggcgagaaggcacgtggcaccggcctggcccgtcgtctggtg360

gaagccgtgatgacacgcccggaaatggccgaggtccaccatctcgagaccactatcacg420

cccgacaaccaggcgtcctggggcttgttccgccgtctcgccgatcgctggcaggcgccg480

ttgaacagccgcgaatacttctccaccgatcaactcggcggtgagcatgacccggaaaac540

ctcgttcgcatcggcccgttccagaccgaccagatctgagccgggacgccgcctggccgg600

cccggtacgggccggcaacccgtcttttcgttttatcactttcccccacaggaggtcgca660

atgcagacccagattctcgaacgcatggagtccgacgttcggacctactcccgctccttc720

ccggtcgtcttcaccaaggcgcgcaatgcccgcctgaccgacgaggaagggcgcgagtac780

atcgacttcctggccggtgccggcaccctgaactacggccacaacaacccgcacctcaag840

caggcgctgctcgactatatcgacagcgacggcatcgtccacggcctggacttctggact900

gcggccaagcgcgactatctggaaaccctggaagaggtgatcctcaagccgcgcggtctc960

gactacaaggtgcatctgcccggaccgactggcaccaacgccgtcgaggcggccattcgc1020

ctggcccgggtcgccaaggggcgccacaatatcgtctccttcaccaacggctttcatggc1080

gtcaccatgggcgcgctggcgaccaccggtaaccgcaagttccgcgaggccaccggtggc1140

gtgccgacccaggctgcttccttcatgccgttcgatggctacctcggcagcagcaccgac1200

accctcgactacttcgagaagctgctcggcgacaagtccggcggcctggacgtgcccgcg1260

gcggtgatcgtcgagacagtgcagggcgagggcggtatcaatgtcgccggcctggagtgg1320

ctcaagcgcctcgagagcatctgccgcgccaatgacatcctgctgatcatcgacgacatc1380

caggcgggctgcggccggaccggcaagttcttcagcttcgagcatgccggcatcacgccg1440

gatatcgtgaccaactccaagtcgctgtccggttacggcctgccgttcgctcacgtcctg1500

atgcgccccgagctcgacaagtggaagcccggtcagtacaacggcaccttccgcggcttc1560

aacctggctttcgccactgctgctgccgccatgcgcaagtactggagcgacgacaccttc1620

gagcgtgacgtgcagcgcaaggctcgcatcgtcgaggaacgcttcggcaagatcgccgcc1680

tggctgagcgagaacggcatcgaggcctccgagcgcggccgcgggctgatgcggggcatc1740

gacgtgggttccggcgatatcgccgacaagatcacccaccaagccttcgagaacgggttg1800

atcatcgaaaccagcggtcaggacggcgaagtggtcaagtgcctgtgcccgctgaccatt1860

cccgacgaagacctggtcgagggactcgacatcctcgagaccagcaccaagcaggccttt1920

agctgatcgcctgaggtgcgccatcgggcctgtccatggcatcctgtatcggtcggccgt1980

gcgcggccggccagtcattgattcactggagaatcgacatgatcgttcgcaatctcgaag2040

aagcgcgccagaccgaccgtctggtcaccgccgaaaacggcaactgggacagcacccgcc2100

tgtcgctggccgaagatggtggcaactgctccttccacatcacccgcatcttcgagggta2160

ccgagacccacatccactataagcatcacttcgaggctgtttattgcatcgaaggcgagg2220

gcgaagtggaaaccctggccgatggcaagatctggcccatcaagccgggtgacatctaca2280

tcctcgaccagcacgacgagcacctgctgcgcgccagcaagaccatgcacctggcctgcg2340

tgttcacgccgggcctgaccggcaacgaagtgcaccgcgaagacggttcctacgcacctg2400

ccgacgaagccgacgaccagaagccgctgtaa2432

<210>4

<211>106

<212>dna

<213>啟動(dòng)子

<400>4

ggtgcacaaagcaaaagctgggtacctctatctggtgccctaaacgggggaatattaacg60

ggcccagggtggtcgcaccttggttggtaggagtagcatgggatcc106

<210>5

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aggaaacagctatgacatgattacgtttcgcccagaaccaagtagcc47

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cccagcttttgctttgtgcacctttcgatctacgt35

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

catgggatccatggccctggtcgtacagaa30

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gagacgttgcccagaaccatgtcaatgttgatttctgca39

<210>9

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

acatggttctgggcaacgtctcttctgtagaagacg36

<210>10

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tgcatgcctgcaggtcgactacataaggtccgacatcgcct41

<210>11

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ctatgacatgattacgaattcagatggttttcctgaccagctt43

<210>12

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gggaagaaggaaaccttgaactctatgagcacagg35

<210>13

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

ttcaaggtttccttcttccctcatttggggg31

<210>14

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

tgcctgcaggtcgactctagaggcctgtaaaggctcatttcag43

<210>15

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tgcatgcctgcaggtcgactaggaggcccttcagatgaacg41

<210>16

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ccgccaaaacagccaagctgttacagcggcttctggtcgt40

<210>17

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ggtgcacaaagcaaaagctgggtacctctatctggt36

<210>18

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

ccagggccatggatcccatgctactcct28