本發(fā)明涉及飼料添加劑制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種保護(hù)豬肝臟的微生物飼料添加劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

肝臟是豬體內(nèi)最大的腺體，肝細(xì)胞產(chǎn)生的許多物質(zhì)可以直接釋放入血液中，影響和調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝和生理活動。另外肝臟還有導(dǎo)管系統(tǒng)，生成的膽汁能經(jīng)膽管排入十二指腸。因此肝臟具有內(nèi)分泌腺和外分泌腺的性質(zhì)。肝臟豐富的血液供應(yīng)和獨(dú)特的生態(tài)結(jié)構(gòu)使其代謝極為活躍，不僅在糖、脂、蛋白質(zhì)、維生素和激素等代謝方面與各個組織器官密切相關(guān)，而且具有分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化等重要功能。

然而，隨著規(guī)模養(yǎng)豬業(yè)的飛速發(fā)展，豬群受不良的養(yǎng)殖觀念影響和危害極其嚴(yán)重。霉變飼料的飼喂，長期大量、超量抗生素的使用，養(yǎng)殖密度大造成的空氣質(zhì)量惡劣等因素，直接或間接造成豬的肝臟、腎臟嚴(yán)重?fù)p傷，從而導(dǎo)致豬群的免疫力下降甚至免疫抑制，使豬長期處于亞健康狀態(tài)（“底色病”），為各種疫病的入侵提供了可乘之機(jī)，風(fēng)吹草動一下，豬即發(fā)病。此外，環(huán)境變化應(yīng)激和疾病造成的生理病理負(fù)擔(dān)也對肝臟造成很大壓力。在各種壓力之下，肝臟疲于應(yīng)付，正常功能受到影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提出一種促進(jìn)肉豬肝臟抗氧化能力的微生物飼料添加劑及其制備方法，為實(shí)現(xiàn)該技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種保護(hù)豬肝臟的微生物飼料添加劑的制備方法，其特征在于，采用菌種復(fù)合培養(yǎng)方法，使菌種在同一培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)，其制備步驟為：

第一步：菌種篩選和生產(chǎn)制種

a. 菌株篩選：菌種來源健康豬小腸，采用乳酸菌培養(yǎng)基MRS進(jìn)行乳酸菌分離，篩選植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌；在啤酒發(fā)酵液中用麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基分離釀酒酵母菌在實(shí)驗(yàn)室中作菌株保存；

b. 將分離的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，同時添加0.1-1％比例的亞硒酸鈉，在28－35℃溫度下培養(yǎng)20－25小時，然后將釀酒酵母菌接種于麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基、枯草芽孢桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，植物乳桿菌接種于步驟a中的乳酸菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選出生長快、菌體特征明顯的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，在實(shí)驗(yàn)室中保存；

c. 生產(chǎn)制種：將步驟b的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別轉(zhuǎn)接入裝有PDA和MRS營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，在28－35℃溫度下培養(yǎng)40－50小時，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出，然后放入2－6℃的冰箱中進(jìn)行保存；

第二步：復(fù)合菌劑制作

a. 按以下重量配比稱取茄子瓶中各生產(chǎn)菌種：植物乳桿菌5－10％、釀酒酵母菌70－85％、枯草芽孢桿菌10－20％；

b. 將生產(chǎn)菌種混合，將混合后的菌種按復(fù)合菌劑重量比例的4－6％添加在由糖蜜2-6%、蛋白胨0.5-1%、葡萄糖2-4%、氯化鈉0-1%、酵母膏2-6％、硫酸鎂0-1%、水81-93.5％組成的復(fù)合菌劑培養(yǎng)基中， 調(diào)節(jié)ph值至6－8，放入容器中加溫至110－130℃進(jìn)行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發(fā)酵罐中發(fā)酵6-8小時，通氣量10-50L/小時，攪拌速度180-250rpm；

第三步：復(fù)合菌劑擴(kuò)大和馴化培養(yǎng)

a. 將復(fù)合菌劑按以下重量配比與炭源、氮源、無機(jī)鹽及誘導(dǎo)劑混合：復(fù)合菌劑5-15%、碳源2-15%、氮源 2-10%、無機(jī)鹽 0.5－1%、 亞硒酸鈉 0.1-1%、水58－90.4％混合置入密閉罐中，110－130℃進(jìn)行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發(fā)酵罐中發(fā)酵20-30小時，通氣量10-50L/小時，攪拌速度180-250rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補(bǔ)料，30-60L/小時，直至發(fā)酵結(jié)束；

B. 發(fā)酵過程中取樣三次，測定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4；

第四步：粉碎過篩

a. 將發(fā)酵液加入2%的硅藻土在100-125℃下噴霧干燥干燥2-3S，，干燥后的產(chǎn)品過80目篩，篩出的粗料再進(jìn)行粉碎和過篩，

b. 過篩后裝入包裝袋中，轉(zhuǎn)入成品庫有序堆放，通知品管部門取樣檢測，主要參數(shù)：水份≤12.0%、活菌數(shù)≥100億/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性狀：淡黃色粉末狀固體。

所述的復(fù)合菌劑由植物乳桿菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌組成，其重量百分配比為：植物乳桿菌5－10％、釀酒酵母菌70－85％、枯草芽孢桿菌10－20％。

所述的碳源為糖蜜、葡萄糖之一或它們的混合物；所述的氮源為豆餅粉、菜粕粉、酵母粉、玉米漿之一或它們的混合物；所述的無機(jī)鹽為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀之一或它們的混合物。

另一方面，本發(fā)明還提供通過上述方法制備得到的保護(hù)豬肝臟的微生物飼料添加劑。

本發(fā)明采用在健康豬小腸中取食糜為菌源中篩選出的菌種與有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)

混合，通過微生物發(fā)酵技術(shù)制成，它含有多種活性酶、小肽、游離氨基酸、單體

蛋白、抗氧化物質(zhì)、維生素及抗菌物質(zhì)，有益菌活菌數(shù)的數(shù)量達(dá)到了100億/克；

在健康豬的腸道中存活著多種細(xì)胞構(gòu)成的菌群，當(dāng)本發(fā)明產(chǎn)品的有益微生物進(jìn)入豬道后，結(jié)合原有的有益菌，迅速形成優(yōu)勢微生物菌群，抑制了腸道有害菌的生長，其中的有益微生物在腸道壁周圍通過磷壁酸與腸粘膜上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成菌膜屏障，阻止有害菌的定植；復(fù)合微生物還可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、乳糖菌素、桿菌肽等，抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌在腸道內(nèi)的繁殖、定植和吸附、中和毒性產(chǎn)物，抑制氨和胺的合成，促進(jìn)腸道相關(guān)淋巴組織的高度反應(yīng)能力。

本發(fā)明產(chǎn)品中所含的谷胱甘肽其所含有的巰基可以充分與體內(nèi)自由基結(jié)合而使自由基還原且促進(jìn)超氧化物歧化酶合成而提高自由基清除率，同時還原性谷胱甘肽可以通過激活多種酶類等途徑促進(jìn)糖類、脂肪及蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)代謝且對藥物、生物毒性損傷所致腎功能損害起到解毒、穩(wěn)定細(xì)胞膜、保持其完整性和促進(jìn)藥物及細(xì)胞代謝等多種功效。作為一種非肽類內(nèi)皮素拮抗劑可以有效拮抗內(nèi)皮素、調(diào)節(jié)血管舒縮、保護(hù)肝臟血管內(nèi)皮，因此對改善肝功能、保護(hù)肝臟具有十分重要的價值。

本發(fā)明產(chǎn)品中所含的活性微生物利于營養(yǎng)物的吸收提高飼料的利用率及能量，降低料重比；可減少外加無機(jī)酸鹽，減少糞便磷的排放，減輕對環(huán)境的污染，而且還可以提高被結(jié)合的蛋白質(zhì)、礦物元素的利用，提高消化率。

本發(fā)明產(chǎn)品采用碳源、氮源、無機(jī)鹽及亞硒酸鈉作為菌種培養(yǎng)原料，它們是微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶的重要組成部分，還可維持酶的活性，能促進(jìn)微生物生長繁殖，刺激活性酶及小肽的生成。

本發(fā)明從生態(tài)綠色養(yǎng)殖的目的入手，選育自然界中分離的益生素菌種，以農(nóng)業(yè)廢料原料為培養(yǎng)基，通過多級的富集發(fā)酵，產(chǎn)生高濃度的有益于對飼料中多種成分消化和吸收的有益菌群，同時生產(chǎn)谷胱甘肽及小肽等物質(zhì)的添加劑，在飼料中直接添加，可以提高豬肝臟抗氧化活性，可通過促進(jìn)垂體GH的分泌,GH可能通過上調(diào)肝臟GHR基因轉(zhuǎn)錄水平和GHR水平,增強(qiáng)肝臟、半腱肌IGF-1基因轉(zhuǎn)錄,降低脂肪細(xì)胞IGF-1基因轉(zhuǎn)錄,使血清IGF-1水平提高,進(jìn)而促進(jìn)蛋白合成、提高養(yǎng)分利用率,最終促進(jìn)豬的生長。肝臟能凈化被動物吸收的霉菌毒素，此凈化過程基于谷胱甘肽的氧化還原反應(yīng)，可以減輕毒素侵害。本發(fā)明是一種安全、高效的綠色飼料添加劑。

綜上所述，本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的的優(yōu)點(diǎn)是：

1.采用獨(dú)創(chuàng)的復(fù)合培養(yǎng)及馴化相結(jié)合的發(fā)酵技術(shù)，避免了各菌種的拮抗機(jī)制，使發(fā)酵產(chǎn)物得到最優(yōu)化；

2.整個生產(chǎn)工藝最大程度上得到有益微生物最大化，發(fā)酵最主要產(chǎn)物谷胱甘肽胞內(nèi)胞外全部回收；

3.產(chǎn)品中含有促進(jìn)飼料采食量的乳酸，還有發(fā)酵中產(chǎn)生的纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶等多種活性酶，與有益菌群共同作用，使飼料中的營養(yǎng)充分吸收利用。

4.本發(fā)明中最主要原料是農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物糖蜜，再加上采用糧食作物和常用飼料載體作為主要培養(yǎng)基原料，生產(chǎn)成本低，易于在養(yǎng)殖中推廣。

5.本發(fā)明的產(chǎn)品采用飼料工業(yè)中2045（2013年）公告的菌種進(jìn)行發(fā)酵，在保證改善豬自身免疫系統(tǒng)和生長發(fā)育，還能加快抗生素、重金屬和毒素代謝，符合生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求，為人民提供安全綠色產(chǎn)品提供保障。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種保護(hù)豬肝臟的微生物飼料添加劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟a. 菌株篩選：菌種來源健康豬小腸，采用乳酸菌培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌分離，篩選植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌；在啤酒發(fā)酵液中用麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基分離釀酒酵母菌；

步驟b. 將分離的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，同時添加0.1-1％比例的亞硒酸鈉，在28－35℃溫度下培養(yǎng)20－25小時，然后將釀酒酵母菌接種于麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基，枯草芽孢桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，植物乳桿菌接種于乳酸菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選出生長快、菌體特征明顯的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，保存；

步驟c. 生產(chǎn)制種：將步驟b中獲得的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別轉(zhuǎn)接入裝有PDA和MRS營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在28－35℃溫度下培養(yǎng)40－50小時，待培養(yǎng)瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出，然后放入2－6℃的冰箱中進(jìn)行保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟d. 按重量配比稱取步驟c中培養(yǎng)瓶中保存?zhèn)溆玫母魃a(chǎn)菌種，然后將三者混合；

步驟e. 將混合后的生產(chǎn)菌種按復(fù)合菌劑重量比例的4－6％添加在復(fù)合菌劑培養(yǎng)基中， 調(diào)節(jié)ph值至6－8，放入容器中加溫至110－130℃進(jìn)行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發(fā)酵罐中發(fā)酵6-8小時，獲得復(fù)合菌劑；

步驟f. 將步驟e獲得的復(fù)合菌劑與炭源、氮源、無機(jī)鹽、誘導(dǎo)劑及水混合，110－130℃進(jìn)行滅菌15－20分鐘，冷卻至28－35℃后在發(fā)酵罐中發(fā)酵20-30小時，通氣量10-50L/小時，攪拌速度180-250rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補(bǔ)料，30-60L/小時，直至發(fā)酵結(jié)束；

步驟g. 將發(fā)酵液加入2%的硅藻土在100-125℃下噴霧干燥干燥2-3S，干燥后的產(chǎn)品過80目篩，篩出的粗料再進(jìn)行粉碎和過篩，獲得保護(hù)豬肝臟的微生物飼料添加劑。

下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。

實(shí)施例1

第一步：菌種篩選和生產(chǎn)制種

a. 菌株篩選：在健康鵝小腸中取食糜為菌源，采用由MRS培養(yǎng)基的乳酸菌培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌分離、篩選植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌；在啤酒發(fā)酵液中用PDA瓊脂培養(yǎng)基分離釀酒酵母菌在實(shí)驗(yàn)室中作菌株保存，本發(fā)明使用如下菌種：植物乳桿菌Lactobacillus plantarum（ATCC8014）、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae（IFO0203）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis （ACCC10623）；

b. 將分離的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，同時添加0.5％比例的亞硒酸鈉，在30℃溫度下培養(yǎng)24小時，然后將釀酒酵母菌接種于由葡萄糖1g、氯化鉀1.8g、酵母浸膏2。5g、醋酸鈉8.2g、瓊脂15－20g、蒸餾水1000ml組成的麥?zhǔn)希∕eclary）瓊脂培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌接種于由牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15－20g、水1000ml、pH7.0-7.2組成的營養(yǎng)瓊脂（LB培養(yǎng)基），植物乳桿菌接種于步驟a中的乳酸菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選出生長快、菌體特征明顯的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，在實(shí)驗(yàn)室中保存；

c. 生產(chǎn)制種：將步驟b的釀酒酵母、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別轉(zhuǎn)接入裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，在30℃溫度下培養(yǎng)45小時，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出;然后放入4℃的冰箱中進(jìn)行保存;

以上分離培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室操作手冊中均可查到。

第二步：復(fù)合菌劑制作

a. 按以下重量配比稱取茄子瓶中各生產(chǎn)菌種：植物乳桿菌10％、釀酒酵母菌80％、枯草芽孢桿菌10％。

b. 將生產(chǎn)菌種混合，按培養(yǎng)基重量的4％比例添加在由糖蜜4%、蛋白胨0.8%、葡萄糖3%、氯化鈉0.5%、酵母膏2％、硫酸鎂0.05%、水89.65%組成的復(fù)合菌劑培養(yǎng)基中，ph值調(diào)節(jié)至7.0，放入容器中加溫至120℃進(jìn)行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后發(fā)酵罐中發(fā)酵8小時，通氣量20L/小時，攪拌速度200rpm；

第三步：復(fù)合菌劑擴(kuò)大和馴化培養(yǎng)

a.將復(fù)合菌劑按重量配比與炭源、氮源、無機(jī)鹽及誘導(dǎo)劑混合：復(fù)合菌劑

10％轉(zhuǎn)接入含有糖蜜4％（碳源）、豆餅粉2％（氮源）、磷酸氫二鉀0.4，磷酸二氫鉀0.2％（無機(jī)鹽）、亞硒酸鈉0.5％、水92.9％混合置入密閉罐中，加溫至120℃進(jìn)行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后在發(fā)酵罐中發(fā)酵24小時，通氣量40L/小時，攪拌速度200rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補(bǔ)料，36L/小時，直至發(fā)酵結(jié)束；

b. 發(fā)酵過程中取樣三次，測定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4。

第四步：粉碎過篩

a. 將發(fā)酵液加入2%的硅藻土在115℃下噴霧干燥干燥2.5S，，干燥后的產(chǎn)品過80目篩，篩出的粗料再進(jìn)行粉碎和過篩，

b.過篩后裝入包裝袋中，轉(zhuǎn)入成品庫有序堆放，通知品管部門取樣檢測，主要參數(shù)：水份≤12.0%、活菌數(shù)≥100億/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性狀：淡黃色粉末狀固體。

實(shí)施例2

第一步:菌種篩選和生產(chǎn)制種同實(shí)施例1相同；

第二步：復(fù)合菌劑制作

a. 按以下重量配比稱取茄子瓶中各生產(chǎn)菌種：植物乳桿菌8％、釀酒酵母菌80％、枯草芽孢桿菌12％。

b. 將生產(chǎn)菌種混合，按培養(yǎng)基重量的4％比例添加在由糖蜜5%、蛋白胨0.6%、葡萄糖3%、氯化鈉0.8%、酵母膏2.5％、硫酸鎂0.08%、水88.02%組成的復(fù)合菌劑培養(yǎng)基中，ph值調(diào)節(jié)至7.0，放入容器中加溫至121℃進(jìn)行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后發(fā)酵罐中發(fā)酵8小時，通氣量25L/小時，攪拌速度180rpm；

第三步：復(fù)合菌劑擴(kuò)大和馴化培養(yǎng)

a.將復(fù)合菌劑按重量配比與炭源、氮源、無機(jī)鹽及誘導(dǎo)劑混合：復(fù)合菌劑

15％轉(zhuǎn)接入含有糖蜜5％（碳源）、豆餅粉2.5％（氮源）、磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.25％（無機(jī)鹽）、亞硒酸鈉0.8％、水90.95％混合置入密閉罐中，加溫至121℃進(jìn)行滅菌15分鐘，冷卻至30℃后在發(fā)酵罐中發(fā)酵26小時，通氣量30L/小時，攪拌速度220rpm，4小時后用50%滅菌過的糖蜜補(bǔ)料，30L/小時，直至發(fā)酵結(jié)束；

b. 發(fā)酵過程中取樣三次，測定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4。

第四步：粉碎過篩

a. 將發(fā)酵液加入2%的硅藻土在118℃下噴霧干燥干燥2.5S，，干燥后的產(chǎn)品過80目篩，篩出的粗料再進(jìn)行粉碎和過篩，

b.過篩后裝入包裝袋中，轉(zhuǎn)入成品庫有序堆放，通知品管部門取樣檢測，主要參數(shù)：水份≤12.0%、活菌數(shù)≥100億/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性狀：淡黃色粉末狀固體。

將實(shí)施例1和2中獲得添加劑使用時按200-400ppm比例添加到豬飼料中并攪拌均勻，然后測定相關(guān)指標(biāo)。本產(chǎn)品使用在飼料中每日豬攝食量將明顯增加，測試血清中是SOD含量比對照提高了20%，MDA下降了10%以上，在上海農(nóng)科院飼料研究開發(fā)中心進(jìn)行的對比試驗(yàn)中，添加200ppm本發(fā)明制備的產(chǎn)品，育肥豬日增重分別提高11.67%；飼料轉(zhuǎn)化率提高8.9%；胴體瘦肉率提高5.80%?？梢?育肥豬日糧中添加本產(chǎn)品在促生長、提高瘦肉率、節(jié)約飼料等方面效果顯。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。