本發(fā)明屬于動物飼料領(lǐng)域，具體涉及一種復合中草藥飼料添加劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代人們對食品安全高度重視，對肉產(chǎn)品品質(zhì)要求不斷提高，防病促生長的激素及抗生素等易產(chǎn)生抗藥性和藥物殘留的飼料添加劑逐步受到限制甚至被陶汰。在保證飼料添加劑符合國家規(guī)定的基礎(chǔ)上，天然的中草藥飼料添加劑逐漸體現(xiàn)出了自己的優(yōu)勢。銀杏和杜仲均為傳統(tǒng)的中藥，它們除具有一般樹葉的營養(yǎng)外，還富含黃酮類化合物、萜內(nèi)酯、綠原酸、聚戊烯醇等對人和畜禽具有顯著生物活性的化合物。這些活性物質(zhì)能有效增強動物機體的免疫功能，促進機體免疫器官的發(fā)育；能抑制雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌等多種病原微生物；并具有提高動物的繁殖能力和生長性能等作用。近年來的研究表明了以銀杏葉、杜仲葉及其提取物作為家禽、家畜、水產(chǎn)品的飼料添加劑，不僅能預防動物疾病的發(fā)生，調(diào)節(jié)動物免疫功能，減少預防用藥，增加食用安全性，還能提高食用品質(zhì)，增強口感。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有動物飼料添加劑存在的問題，提供一種綠原酸、黃酮類等活性成分含量高的發(fā)酵中草藥添加劑，在補充飼料營養(yǎng)的同時，增強動物機體免疫力，增加食品安全性，改善食用品質(zhì)。

一種復合中草藥飼料添加劑，主要由以下重量組份原料經(jīng)葡萄牙棒孢酵母和黑曲霉發(fā)酵而成：銀杏葉和杜仲葉50-60％，水30-35％，麩皮5-12％，葡萄糖1-2％，氮源1-2％，緩沖劑和無機鹽1-2％；所述銀杏葉：杜仲葉重量比＝0.5-4:1。

進一步地，葡萄牙棒孢酵母的接種量為葡萄牙棒孢酵母干粉占銀杏葉和杜仲葉總干重的0.25-2％，黑曲霉的接種量為黑曲霉孢子占銀杏葉和杜仲葉總干重的0.5-4％。

上述組份中添加了適量的葡萄糖和氮源，可以啟動葡萄牙棒孢酵母加速進入對數(shù)生長期，葡萄牙棒孢酵母在生長過程中會產(chǎn)生碳源和氮源等營養(yǎng)成分。黑曲霉利用葡萄牙棒孢酵母生長產(chǎn)生的營養(yǎng)成份和麩皮提供較易分解的纖維素營養(yǎng)來啟動快速繁殖，進而分解銀杏葉和杜仲葉中的纖維素、半纖維素等物質(zhì)。葡萄牙棒孢酵母和黑曲霉協(xié)同生長、代謝，可以分解、轉(zhuǎn)化中藥中的纖維素、糖類、蛋白質(zhì)等成分，使中藥細胞破壁，使綠原酸、黃酮類物質(zhì)等活性物質(zhì)釋放出來，且微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物可以改變中藥的活性成分，提高產(chǎn)品的功能性，同時提升葉子的可消化吸收性。

進一步地，所述氮源包括(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃等。

進一步地，所述緩沖劑包括KH₂PO₄、K₂HPO₄等。

進一步地，所述無機鹽包括MgSO₄、MgCl₂等。

進一步地，所述發(fā)酵溫度為23-32℃，更優(yōu)選28℃。

進一步地，所述發(fā)酵時間為48-120h，更優(yōu)選96h。

進一步地，所述添加劑喂養(yǎng)動物的添加量為0.5-4g/100g基礎(chǔ)飼料，更優(yōu)選1g/100g。

上述復合中草藥飼料添加劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)發(fā)酵原料的配制：將50-60％的銀杏葉和杜仲葉、5-12％麩皮、1-2％葡萄糖、1-2％氮源、1-2％緩沖劑和無機鹽以及余量水按比例混合均勻，滅菌；

(2)以銀杏葉和杜仲葉總干重計接種葡萄牙棒孢酵母干粉0.25-2％及黑曲霉孢子0.5-4％，進行發(fā)酵。

進一步地，滅菌條件為121℃下滅菌20-30min。

本發(fā)明以銀杏葉與杜仲葉為原料復配培養(yǎng)基，并聯(lián)合葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉復合菌固態(tài)發(fā)酵，制備得到的飼料添加劑，其主要營養(yǎng)成份、以總黃酮和綠原酸為主的活性物質(zhì)含量大大提高，添加到飼料中后使風味和適口性有了較大改善。在補充飼料營養(yǎng)的同時，有效增強動物機體免疫力，增加食品安全性，提高食用品質(zhì)，增強口感。

附圖說明

圖1實施例1銀杏與杜仲葉配比對總黃酮和綠原酸含量的影響；

圖2實施例2黑曲霉接種量對總黃酮和綠原酸含量的影響；

圖3實施例3培養(yǎng)溫度對總黃酮和綠原酸含量的影響；

圖4實施例4培養(yǎng)時間對總黃酮和綠原酸含量的影響。

生物材料樣品保藏信息：

葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年10月20日，保藏編號為CGMCC No.9836；

黑曲霉(Aspergillus.niger)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年10月20日，保藏編號為CGMCC No.9776。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明。

材料準備：

銀杏葉：2014年10月采集于南京林業(yè)大學銀杏園，干制葉；杜仲葉：2014年12月采集于河南理工大學杜仲園，自然落葉收集，自然晾曬后；麩皮：市售。以上試驗材料均60℃烘干、磨成粉，過40目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

總黃酮、綠原酸的提?。悍Q取干燥復合中藥發(fā)酵物5.0g，在超聲波功率500W條件下，固液比1:15、乙醇濃度70％、提取溫度為50℃條件下，提取20min，累計提取兩次，合并提取液。

總黃酮含量的測定：(1)蘆丁對照品溶液制備：精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品20mg，置100ml容量瓶中，加70％乙醇適量，置水浴鍋上微熱(40℃)使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，搖勻，即得0.2mg/ml的蘆丁對照品溶液。(2)可見光度法掃描及標準曲線的制備：分別移取蘆丁對照品溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置25ml的容量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亞硝酸鈉溶液1.0ml，混勻，放置6min，加10％硝酸鋁溶液1.00ml，搖勻，放置6min，加4％氫氧化鈉溶液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min。以0.0ml蘆丁配置溶液為空白，在200～800nm的范圍內(nèi)進行光譜掃描，得505nm處為可見光最大吸收峰。以空白試劑為參比，將6個標準品溶液分別在505nm下測定吸光度，以蘆丁對照品的濃度為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程A₁＝11.1556C₁+0.0061，R＝0.9997。蘆丁濃度在0.0～48.0mg/L范圍線性關(guān)系良好。(3)將提取液離心、抽濾后，全部定容到200ml容量瓶中，分別準確量取2.5ml、5ml到25ml的容量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亞硝酸鈉溶液1.0ml，混勻，放置6min，加10％硝酸鋁溶液1.00ml，搖勻，放置6min，加4％氫氧化鈉溶液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min。在505nm處測量其吸光值，根據(jù)其標準曲線回歸方程計算提取液中總黃酮濃度C₁(mg/L)。

綠原酸含量的測定：(1)綠原酸對照品溶液的制備：精密稱取在120℃干燥至恒重的綠原酸對照品20mg，置100ml容量瓶中，加分析純乙醇適量，置水浴鍋上加熱(60℃)使溶解，放冷，加分析純乙醇至刻度，搖勻，即得0.2mg/ml的綠原酸對照品溶液。(2)可見光度法掃描及標準曲線的繪制：分別移取0.0ml、0.8ml、1.6ml、2.4ml、3.2ml、4ml、4.8ml上述對照品溶液到25ml的容量瓶中，用0.2mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，此為標準系列溶液。以0.0ml蘆丁配置溶液為空白，在200～800nm的范圍內(nèi)進行光譜掃描，得328nm處為可見光最大吸收峰。在328nm處測定吸光值，以綠原酸標準品的濃度為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：C₂＝19.0490A₁-0.0744，R＝0.9984。綠原酸濃度在0.0～38.4mg/L范圍線性關(guān)系良好。(3)將提取液離心、抽濾后，全部定容到200ml容量瓶中，分別準確量取2.5ml、5ml到25ml的容量瓶中，用0.2mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，在328nm處測量其吸光值，根據(jù)其標準曲線回歸方程計算提取液中綠原酸濃度C₂(mg/L)。

實施例1-15均按照以下步驟制備復合中草藥飼料添加劑：

(1)發(fā)酵原料的配制：向54％的銀杏葉和杜仲葉(銀杏葉：杜仲葉重量比＝0.5-4:1)中添加31.5％的水，10％的麩皮、1.5％的葡萄糖、1％的(NH₄)₂SO₄、1％的KH₂PO₄和1％的MgSO₄·7H₂O，混合均勻，121℃下滅菌20-30min；

(2)無菌環(huán)境中接種1％的葡萄牙棒孢酵母干粉及0.5-4％的黑曲霉孢子(以銀杏葉和杜仲葉總干重計)；

(3)23-32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-120h。

實施例1銀杏葉與杜仲葉配比對總黃酮和綠原酸含量的影響

在其它條件(黑曲霉接種量2％，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間96h)確定的情況下，考察銀杏葉與杜仲葉質(zhì)量比例(0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1)對總黃酮和綠原酸含量的影響，結(jié)果如圖1，隨著銀杏葉質(zhì)量比重的增加，總黃酮含量較明顯增加，綠原酸含量有所降低，在比例2:1開始，綠原酸含量降低明顯。分析可能是杜仲葉中杜仲膠較大比例存在時，抑制了菌類的生長。

實施例2黑曲霉接種量對總黃酮和綠原酸含量的影響

在其它條件(銀杏葉與杜仲葉質(zhì)量比例2:1，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間96h)確定的情況下，考察黑曲霉接種量(0.5％、1％、2％、3％、4％)對總黃酮和綠原酸含量的影響，結(jié)果如圖2，隨著黑曲霉接種量的增加，總黃酮和綠原酸的含量均出現(xiàn)明顯提升趨勢，當接種量達到2％時，總黃酮量增勢減緩，對綠原酸的影響較小。

實施例3培養(yǎng)溫度對總黃酮和綠原酸含量的影響

在其它條件(銀杏葉與杜仲葉質(zhì)量比例2:1，黑曲霉接種量2％，發(fā)酵時間96h)確定的情況下，考察培養(yǎng)溫度(23℃、25℃、28℃、30℃、32℃)對對總黃酮和綠原酸含量的影響，結(jié)果如圖3，隨著培養(yǎng)溫度的升高，總黃酮和綠原酸的先升后降。

實施例4培養(yǎng)時間對總黃酮和綠原酸含量的影響

在其它條件(銀杏葉與杜仲葉質(zhì)量比例2:1，黑曲霉接種量2％，發(fā)酵溫度28℃)確定的情況下，考察培養(yǎng)時間(48h、72h、84h、96h、120h)對總黃酮和綠原酸含量的影響，結(jié)果如圖4，隨著培養(yǎng)時間的延長，總黃酮和綠原酸的含量均有明顯提升，而后出現(xiàn)不同程度的下降。

實施例5-15

采用不同的因素參數(shù)組合制備發(fā)酵物，涉及到的參數(shù)如表1所示，各實施例所采用的參數(shù)及總黃酮、綠原酸的測定結(jié)果如表2所示。

表1銀杏-杜仲葉復合中草藥發(fā)酵工藝因素

表2銀杏-杜仲葉復合中草藥發(fā)酵工藝及結(jié)果

從表2中可以看出，實施例10得到的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品總黃酮含量為2.124％，綠原酸的含量為0.421％，均最高，因此發(fā)酵的最佳工藝條件為：銀杏葉：杜仲葉2：1，黑曲霉接種量2％，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間96h。

從上述實施例結(jié)果來看：當杜仲葉比例較高時，微生物的停滯期略長，可能是由于杜仲葉中含有杜仲膠的原因，由此推測可能當杜仲膠含量降低到一定水平的時候?qū)ξ⑸锷L的影響可以忽略。微生物比例超過一定量或者培養(yǎng)時間長到一定時間時，總黃酮和綠原酸含量不升反降，應該是由于微生物生長過程中會部分消耗黃酮類物質(zhì)和綠原酸，而且微生物的不同生長階段消耗黃酮類物質(zhì)和綠原酸的比例也有變化。

將實施例10的產(chǎn)品添加到動物飼料中，以預飼7日的白羽雞為喂養(yǎng)試驗對象，分對照組和試驗組，試驗組的投入量為四個梯度0.5％、1.0％、1.5％、2％(g/g基礎(chǔ)飼料重量)，喂養(yǎng)45日后，通過測量體重、脾臟、胸腺、法氏囊質(zhì)量和小腸長度等，來計算餌料轉(zhuǎn)化率，分析不同劑量復合中草藥發(fā)酵產(chǎn)物對白羽雞在促生長、提升免疫力和抗應激能力等方面的效果及合適的投放量。

從表3的結(jié)果來看，實驗組比對照組的餌料轉(zhuǎn)化率、末重、胸腺指數(shù)和法式囊指數(shù)分別有明顯提高，說明對于白羽雞的中樞免疫器官產(chǎn)生了明顯影響，提升了雞的免疫力。同時，從色澤和肌質(zhì)看雞肉品質(zhì)也有所改善。

表3相對于對照組，不同添加劑量的各種指數(shù)提升比例