一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生 態(tài)制劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生活水平的提高與營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的增強(qiáng)，兔肉的高蛋白、高磷脂、高消化率、 低脂肪、低膽固醇、低尿胺的"三高兩低"特點(diǎn)越來越被人們所認(rèn)識(shí)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)兔產(chǎn)品的 需求量逐步上升，這給養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展提供了廣闊的市場(chǎng)和良好的前景。但是，在養(yǎng)殖生產(chǎn)過 程中抗生素的濫用一度引起人們對(duì)食品安全的恐慌，因此急需一種能夠替代抗生素的安全 制劑作為飼料添加劑，維護(hù)肉兔的健康生長(zhǎng)的同時(shí)保證肉質(zhì)的綠色安全。從1989年Fuller 提出的益生菌，到1995年Gibson和Roberfroid提出的益生元，再到新近提出的合生元，近 幾十年來，人們對(duì)腸道調(diào)節(jié)微生態(tài)制劑的研宄，正在一步步朝著縱深化、高效多樣化的方向 發(fā)展。隨著研宄的深入，人們發(fā)現(xiàn)一開始通過篩選出的單菌株制備益生菌制劑調(diào)節(jié)腸道微 生態(tài)平衡的效果是有限的，因?yàn)槟c道微生態(tài)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，多菌混居且聯(lián)系緊密，當(dāng)中 有許多菌是無法單獨(dú)培養(yǎng)的，每個(gè)個(gè)體的腸道菌群結(jié)構(gòu)都有特異性，同時(shí)受到遺傳以及飲 食與環(huán)境的影響等，同樣的微生物進(jìn)入不同動(dòng)物體內(nèi)可能產(chǎn)生完全相反的作用效果，因此 根據(jù)不同個(gè)體的菌群特征設(shè)計(jì)出合適的復(fù)合微生態(tài)制劑顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源 的微生態(tài)制劑的制備方法，由兔場(chǎng)健壯肉兔糞樣中的復(fù)合微生物直接發(fā)酵而得，能夠有效 滿足肉兔腸道菌群的特異性，迅速在腸道中定植，達(dá)到顯著的益生效果。
[0004] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題的不足，所采用的技術(shù)方案是：一種與肉兔腸道菌群 結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，包括以下步驟： (1)采集新鮮的肉兔糞樣，轉(zhuǎn)移到預(yù)先制備的無菌蛋白胨水中，并置于4°c溫度下保存， 得到糞便懸浮液，將糞便懸浮液用蛋白胨水調(diào)整至糞樣濃度為20% (w/v)，均質(zhì)并輕微離心 除去大顆粒，得到接種糞樣，備用；所述新鮮的肉兔糞樣為肉兔排便兩小時(shí)內(nèi)的糞便。
[0005] (2)在蒸餾水中加入檸檬酸鈉并預(yù)熱至90°C，然后加入吉蘭糖膠和黃原膠干粉， 攪拌溶解得到聚合物溶液，聚合物溶液中檸檬酸鈉濃度為〇. 2% (w/v)，吉蘭糖膠濃度為 2. 5% (w/v)，黃原膠干粉濃度為0. 25% (w/v)，然后使用滅菌鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121°C， 15min)，并冷卻至43°C，在無菌條件下接種步驟（1)得到的糞樣，接種后的聚合物溶液溶入 疏水相(商業(yè)菜籽油）中，得到油相水滴懸浮液，冷卻后形成凝膠小珠，分離沖洗并在氯化鈣 溶液中浸透，凝膠小珠變硬，通過濕法篩分篩選出直徑為l_2mm的凝膠小珠，備用； (3)將步驟（2)得到的凝膠小珠置于發(fā)酵容器的底部，然后加入發(fā)酵培養(yǎng)基(凝膠小珠 為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的30%)，控制溫度為37°C，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，收集發(fā)酵液，真空冷凍干燥得 到微生態(tài)制劑。
[0006] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：氯化鈉4. 5g/l，氯化鉀4. 5g/l，七水硫酸鎂I. 25g/l，二 水氯化媽0. 15g/l，磷酸氫二鉀0. 5g/l，碳酸氫鈉 I. 5g/l，七水硫酸鐵0. 005g/l，半胱氨酸 〇· 8g/l，膽汁鹽0· 05g/l，粘蛋白4. Og/Ι，吐溫L Og/Ι，氯高鐵血紅素0· Olg/Ι，酵母膏2. 5g/ 1，蛋白胨0. 5g/l，胰蛋白胨0. 5g/l，酪蛋白I. 2g/l，水解乳清蛋白7. 2g/l，可溶性大米淀粉 6. 8g/l，麥芽糊精I(xiàn). 2g/l和乳糖5. Og/1。
[0007] 本發(fā)明微生態(tài)制劑的使用方法為：每公斤飼料添加3_6mg的微生態(tài)制劑，同時(shí)還 可以在飼料中添加 Img的菊粉，有助于提高益生菌的生存能力。
[0008] 有益效果 (1)本發(fā)明制得的微生態(tài)制劑源于同品種兔的腸道菌群，能夠與宿主腸道的菌群結(jié)構(gòu) 相契合，滿足了宿主對(duì)益生菌的特異性要求，更加有效地維護(hù)宿主的腸道健康，其中的雙歧 桿菌、乳酸菌等有益菌含量超過10nCfu/g，并伴隨有一些不可培養(yǎng)的腸道未知菌，協(xié)助有益 菌在腸道中的定植。
[0009] (2)本發(fā)明在厭氧發(fā)酵時(shí)采用腸道模擬發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成與宿主的腸道內(nèi) 容物相似，在富集有益菌生長(zhǎng)的同時(shí)能夠有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，獲得的發(fā)酵液菌體含量 高，且成分穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，包括以下步驟： (1)采集新鮮的肉兔糞樣，轉(zhuǎn)移到預(yù)先制備的無菌蛋白胨水（PH=7,濃度0. 1%)中，并置 于4°C溫度下保存，得到糞便懸浮液，將糞便懸浮液用蛋白胨水調(diào)整至糞樣濃度為20% (w/ v)，均質(zhì)并輕微離心（700轉(zhuǎn)/分鐘)除去大顆粒，得到接種糞樣，備用；所述新鮮的肉兔糞樣 為肉兔排便兩小時(shí)內(nèi)的糞便。
[0011] (2 )在蒸餾水中加入檸檬酸鈉(終濃度0. 2%，w/v )并預(yù)熱至90 °C，然后加入吉蘭糖 膠(終濃度2. 5%，w/v)和黃原膠干粉(終濃度0. 25%，w/v)，攪拌溶解得到聚合物溶液，然后 使用滅菌鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121°C，15min)，并冷卻至43°C，在無菌條件下接種步驟（1) 得到的糞樣，接種后的聚合物溶液溶入疏水相(商業(yè)菜籽油）中，得到油相水滴懸浮液，冷卻 后形成凝膠小珠，分離沖洗并在氯化鈣溶液中浸透，凝膠小珠變硬，通過濕法篩分篩選出直 徑為l-2mm的凝膠小珠，備用； (3)將步驟（2)得到的凝膠小珠置于發(fā)酵容器的底部，然后加入發(fā)酵培養(yǎng)基(凝膠小珠 為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的30%)，控制溫度為37°C，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，收集發(fā)酵液，真空冷凍干燥得 到微生態(tài)制劑。
[0012] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：氯化鈉4. 5g/l，氯化鉀4. 5g/l，七水硫酸鎂I. 25g/l，二 水氯化媽0. 15g/l，磷酸氫二鉀0. 5g/l，碳酸氫鈉 I. 5g/l，七水硫酸鐵0. 005g/l，半胱氨酸 〇· 8g/l，膽汁鹽0· 05g/l，粘蛋白4. Og/Ι，吐溫L Og/Ι，氯高鐵血紅素0· Olg/Ι，酵母膏2. 5g/ 1，蛋白胨0. 5g/l，胰蛋白胨0. 5g/l，酪蛋白I. 2g/l，水解乳清蛋白7. 2g/l，可溶性大米淀粉 6. 8g/l，麥芽糊精I(xiàn). 2g/l和乳糖5. Og/1。
[0013] 平板菌落鑒定和計(jì)數(shù):分別取發(fā)酵前的糞樣和發(fā)酵后的成熟發(fā)酵液涂平板計(jì)數(shù)， 用Beerens培養(yǎng)基計(jì)雙歧桿菌數(shù)，MRS培養(yǎng)基計(jì)乳酸菌數(shù)，麥康凱培養(yǎng)基計(jì)腸桿菌，EC培養(yǎng) 基計(jì)腸球菌。
[0014] ERIC-PCR分析:經(jīng)前處理后的樣品10000 r/min離心3min，收集沉淀，用CTAB 法提取基因組，稀釋為20ng/ μ 1，-20°C保存，可用作PCR反應(yīng)的模板。ERIC-PCR引物序列 ERICl 3' -CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5'，ERIC2 5' -AAGTAAGTACT GGGGTGAGCG-3'，反應(yīng)體 系為，25 μ 1的PCR反應(yīng)液中，DNA模版用量約為80ng。
[0015] 結(jié)果分析:復(fù)合微生態(tài)制劑主要菌群培養(yǎng)基鑒定結(jié)果如下表。并且微生態(tài)制劑的 ERIC-PCR指紋圖譜分析也顯示雙歧桿菌和乳酸菌所對(duì)應(yīng)的條帶范圍明顯增多，與菌落分析 情況相一致。
[0016]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于：包括以下步 驟： (1) 采集新鮮的肉兔糞樣，轉(zhuǎn)移到預(yù)先制備的無菌蛋白胨水中，并置于4°C溫度下保存， 得到糞便懸浮液，將糞便懸浮液用蛋白胨水調(diào)整至糞樣濃度為20% (w/v)，均質(zhì)并輕微離心 除去大顆粒，得到接種糞樣，備用； (2) 在蒸餾水中加入檸檬酸鈉并預(yù)熱至90°C，然后加入吉蘭糖膠和黃原膠干粉，攪拌溶 解得到聚合物溶液，然后使用滅菌鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，并冷卻至43°C，在無菌條件下接種 步驟（1)得到的糞樣，接種后的聚合物溶液溶入疏水相中，得到油相水滴懸浮液，冷卻后形 成凝膠小珠，分離沖洗并在氯化鈣溶液中浸透，凝膠小珠變硬，通過濕法篩分篩選出直徑為 l-2mm的凝膠小珠，備用； (3) 將步驟（2)得到的凝膠小珠置于發(fā)酵容器的底部，然后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溫度 為37°C，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，收集發(fā)酵液，真空冷凍干燥得到微生態(tài)制劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，其特 征在于：所述步驟（1)中新鮮的肉兔糞樣為肉兔排便兩小時(shí)內(nèi)的糞便。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，其特 征在于：所述步驟（2)的聚合物溶液中檸檬酸鈉濃度為0. 2% (w/v)，吉蘭糖膠濃度為2. 5% (w/v)，黃原膠干粉濃度為0. 25% (w/v)。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，其特 征在于：所述步驟（2)中的疏水相為菜籽油。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，其特 征在于：所述步驟（3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：氯化鈉4. 5g/l，氯化鉀4. 5g/l，七水硫酸鎂 I. 25g/l，二水氯化鈣0. 15g/l，磷酸氫二鉀0. 5g/l，碳酸氫鈉I. 5g/l，七水硫酸鐵0. 005g/ 1，半胱氨酸〇? 8g/l，膽汁鹽0? 05g/l，粘蛋白4.Og/1，吐溫I.Og/1，氯高鐵血紅素0? 01g/l， 酵母膏2. 5g/l，蛋白胨0. 5g/l，胰蛋白胨0. 5g/l，酪蛋白I. 2g/l，水解乳清蛋白7. 2g/l，可 溶性大米淀粉6. 8g/l，麥芽糊精I(xiàn). 2g/l和乳糖5.Og/1。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，其特 征在于：所述步驟（3)中凝膠小珠為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的30%。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種與肉兔腸道菌群結(jié)構(gòu)同源的微生態(tài)制劑的制備方法，由兔場(chǎng)健壯肉兔糞樣中的復(fù)合微生物直接發(fā)酵而得，能夠與宿主腸道的菌群結(jié)構(gòu)相契合，滿足了宿主對(duì)益生菌的特異性要求，更加有效地維護(hù)宿主的腸道健康，其中的雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌含量超過1011cfu/g，并伴隨有一些不可培養(yǎng)的腸道未知菌，協(xié)助有益菌在腸道中的定植，達(dá)到顯著的益生效果。
【IPC分類】C12N1-00, A23K1-18, C12N1-20, A23K1-14, A23K1-16, A23K1-00
【公開號(hào)】CN104782879
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510148182
【發(fā)明人】秦翠麗, 李云飛, 侯穎, 李松彪, 孫曉菲, 王忠澤, 王偉潔
【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月1日