專利名稱：對(duì)癌發(fā)生具有抑制作用的可可豆和可可豆殼的提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)癌發(fā)生具有抑制作用的可可豆和可可豆殼的提取物，且更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及可抑制屬于包括肝癌在內(nèi)的各種類型癌癥發(fā)展過(guò)程中的病理現(xiàn)象GJIC(缺口連接細(xì)胞通訊)抑制以及癌細(xì)胞DNA的合成的可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分，由此抑制癌細(xì)胞的增殖。
背景技術(shù)：
巧克力和可可的活性組分可可(可可)表示不可思議的上帝的食品的含義?？雌饋?lái)可可的原始來(lái)源出現(xiàn)在中美洲到南美洲北部范圍內(nèi)的區(qū)域。在中美洲的幾個(gè)國(guó)家已經(jīng)將可可與玉米一起看作是有價(jià)值的食品之一，這種情況從史前時(shí)代已經(jīng)有很長(zhǎng)的栽培歷史且目前已經(jīng)被世界上絕大多數(shù)人所廣泛鐘愛(ài)、無(wú)論是種族、年齡和性別。
巧克力的活性組分可可豆通常含有大量酚類植化成分和可可堿以及食物纖維，不過(guò)，其組成隨栽培地不同而改變。在生產(chǎn)巧克力的過(guò)程中，將剝?nèi)テさ目煽啥沟亩谷獠糠钟米髑煽肆蚩煽傻脑希S后將產(chǎn)生的其殼的大部分(約可可豆總重的15wt％)作為副產(chǎn)品丟棄。例如，目前世界范圍內(nèi)的可可豆的產(chǎn)量約為250萬(wàn)噸，它們中約有400,000噸可可豆殼被丟棄。根據(jù)1990年韓國(guó)海關(guān)管理局(Office ofCustoms Administration of Korea)公布的年度貿(mào)易統(tǒng)計(jì)，在韓國(guó)約有600噸可可豆殼作為廢物被拋棄。然而，就可可豆而言，目前已知可可豆殼中含有大量酚類植化成分和可可堿以及食物纖維。
從此以后，對(duì)可可豆的功能應(yīng)用的研究首先集中到可可豆中的多酚類、矢車菊苷配質(zhì)上。本發(fā)明者(Mars Inc.)預(yù)先公開(kāi)了可可豆中唯一的矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分能夠殺滅白血病、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等的癌細(xì)胞并抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性(韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?98-707952)。然而，本發(fā)明者尚未證實(shí)可可豆對(duì)肝癌和胃癌的作用且另外在上述專利中含有可可堿的級(jí)分不同于含有矢車菊苷配質(zhì)的級(jí)分而對(duì)癌癥沒(méi)有作用。
在上述發(fā)明前，本發(fā)明的發(fā)明者公開(kāi)了從生產(chǎn)巧克力中獲得的作為副產(chǎn)品的可可豆殼在經(jīng)濟(jì)上是可利用的且其含有矢車菊苷配質(zhì)A和矢車菊苷配質(zhì)C-1的化學(xué)聚合物組合物可有效地抑制導(dǎo)致齲齒的主要原因的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，由此通過(guò)混合可可豆殼的可溶性提取物而制成了用于預(yù)防齲齒的口香糖(韓國(guó)專利KR1991-45179和美國(guó)專利US4,908,212)。
本發(fā)明的發(fā)明者預(yù)先還公開(kāi)了一種對(duì)葡糖基轉(zhuǎn)移酶具有改善的抑制活性的可可豆殼級(jí)分的制備方法，該方法通過(guò)增加多酚含量來(lái)進(jìn)行(美國(guó)專利US6,159,451)。
如上所述，可可豆和可可豆殼含有各種具生理活性的成分，諸如食物纖維、酚類植化成分和可可堿。因此，可可豆和可可豆殼的生理活性不能僅由單獨(dú)的某一結(jié)構(gòu)的矢車菊苷配質(zhì)代表且另外看起來(lái)對(duì)某一結(jié)構(gòu)的矢車菊苷配質(zhì)的商業(yè)利用因高生產(chǎn)成本而并不切實(shí)際。因此，更為實(shí)際的是應(yīng)用通過(guò)如美國(guó)專利US6,159,451中公開(kāi)的單純分離方法制備的具有許多改善的生理活性的級(jí)分。
盡管在過(guò)去的幾十年有外科手術(shù)、放療和化療，但是包括肝癌、胃癌和結(jié)腸癌在內(nèi)的大部分上皮細(xì)胞癌的發(fā)生率和由上述癌癥導(dǎo)致的死亡率并沒(méi)有顯著下降(Sporn，M.B.，Lancet，3471377-1381，1996)?？雌饋?lái)這種情況是過(guò)去30年來(lái)針對(duì)癌癥的手段大部分集中在治療觀點(diǎn)而非預(yù)防觀點(diǎn)上所導(dǎo)致的。正如已知的，攝取含有可有效抑制或延緩癌癥多個(gè)發(fā)展階段的成分的某一食品或藥物有助于降低癌癥的發(fā)生和隨后由它導(dǎo)致的死亡率且已經(jīng)進(jìn)行了大量研究(Kang等，Chemica1 prevention of cancer，Korea Medicine，2000；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428305-327，1999；Sporn，M.B.，Lancet，3471377-1381，1996；Caragay，A.B.，F(xiàn)ood Technol.，65-68，1992)。
癌發(fā)生是由刺激、助長(zhǎng)和發(fā)展3個(gè)階段組成的多階段過(guò)程。在研究可有效預(yù)防或抑制癌癥的活性劑的過(guò)程中，近期的研究更多地涉及到鑒定可以抑制助長(zhǎng)和發(fā)展階段而非刺激階段的物質(zhì)，刺激階段是一個(gè)短期且不可逆轉(zhuǎn)的階段(Kang等，Chemical prevention of cancer，Korea Medicine，2000；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428305-327，1999；Sporn，M.B.，Lancet，3471377-1381，1996)。特別地，用食物提取物和級(jí)分預(yù)防和抑制癌癥不同于藥物而成為更有效的手段，條件是它們以癌發(fā)生助長(zhǎng)階段為靶，這一階段一般發(fā)展了20年以上且還可逆轉(zhuǎn)(Kang等，Chemical prevention of cancer，KoreaMedicine，2000；Yamasaki，H.等，Carcinogenesis 111051-1058，1990；Kelloff.G.J.等.，Eur.J.Cancer，351755-1762，1999；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428305-327，1999)。缺口連接細(xì)胞通訊(GJIC)對(duì)通過(guò)調(diào)節(jié)多細(xì)胞生物體內(nèi)細(xì)胞增殖和分化來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境平衡來(lái)說(shuō)是必不可少的。將抑制GJIC看作在癌發(fā)生時(shí)、特別是在癌助長(zhǎng)階段觀察到的關(guān)鍵生化指標(biāo)；因此，預(yù)計(jì)可以抑制這類過(guò)程的物質(zhì)可抑制癌發(fā)生的助長(zhǎng)階段，由此預(yù)防并抑制癌癥的發(fā)展。此外，將由DNA合成導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖看作癌發(fā)生發(fā)展階段時(shí)觀察到的關(guān)鍵生物指標(biāo)；因此，預(yù)計(jì)可以抑制這類過(guò)程的物質(zhì)可抑制癌發(fā)生的發(fā)展階段，由此預(yù)防并抑制癌癥的發(fā)展。(Kang等，Chemical prevention ofcancer，Korea Medicine，2000；Surh，Y.J.，Mutat.Res.，428305-327，1999；Holder.J.W.等Cancer Res.，53，3475-3485，1993)。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者在研究基于安全原因的來(lái)自天然食物的抗癌劑的有潛力候選物的過(guò)程中進(jìn)行了廣泛研究并發(fā)現(xiàn)可可豆和可可豆殼的提取物具有抗癌活性，諸如抑制癌發(fā)生助長(zhǎng)階段過(guò)程中發(fā)生的GJIC抑制、在體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用和通過(guò)抑制癌細(xì)胞的DNA合成來(lái)抑制增殖。此外，通過(guò)下列步驟獲得的可可豆和可可豆殼級(jí)分對(duì)癌癥的發(fā)展具有極佳的抑制作用通過(guò)溶劑提取制備可可豆和可可豆殼的提取物；將其裝填入吸附樹(shù)脂；用40％乙醇進(jìn)行分級(jí)分離并用60％乙醇對(duì)殘余物重新進(jìn)行分級(jí)分離。此外，已經(jīng)作為廢物丟棄的可可豆殼的利用可以增加經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種包括可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分作為活性組分的抗癌劑。
附圖描述附

圖1是表示可可豆和可可豆殼的級(jí)分對(duì)大鼠肝臟上皮細(xì)胞中由H2O2產(chǎn)生的GJIC抑制的抑制作用的一組圖，其中H2O2是人體內(nèi)的癌癥助長(zhǎng)劑和最強(qiáng)活性氧種類(ROS)之一(a對(duì)照組；b使用400∏M H2O2治療的組；c使用10∏M/ml可可豆級(jí)分+400∏M H2O2治療的組；d使用10∏M/ml可可豆殼級(jí)分+400∏M H2O2治療的組)。
附圖2是表示可可豆和可可豆殼對(duì)大鼠肝臟上皮細(xì)胞中由H2O2產(chǎn)生的控制GJIC的主要蛋白質(zhì)連接蛋白43的超磷酸化抑制作用的圖(a對(duì)照組；b使用400∏M H2O2治療的組；c使用10∏M/ml可可豆級(jí)分+400∏M H2O2治療的組；d使用10∏M/ml可可豆殼級(jí)分+400∏MH2O2治療的組)。
附圖3是表示可可豆和可可豆殼級(jí)分通過(guò)抑制一種肝癌細(xì)胞HepG2的DNA合成對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用的示意圖。
附圖4是表示可可豆和可可豆殼級(jí)分通過(guò)抑制一種胃癌細(xì)胞SNU1的DNA合成對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用的示意圖。
附圖5是表示可可豆和可可豆殼級(jí)分通過(guò)抑制一種結(jié)腸癌細(xì)胞SNUC2A的DNA合成對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用的示意圖。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明涉及一種包括可可豆和可可豆殼的級(jí)分或提取物作為活性組分的抗癌劑。
本發(fā)明具體描述如下。
本發(fā)明的可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分用于預(yù)防并抑制癌發(fā)生，這一過(guò)程不僅通過(guò)抑制GJIC的抑制、而且通過(guò)抑制癌細(xì)胞DNA的合成來(lái)進(jìn)行，所抑制的這些現(xiàn)象是癌發(fā)生助長(zhǎng)和發(fā)展階段過(guò)程中發(fā)生的特征現(xiàn)象。因此，本發(fā)明還涉及含有可可豆和可可豆殼的級(jí)分或提取物作為活性組分的藥物或食品添加劑。
可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分的制備方法如下。
首先，從干燥的可可豆中除去可可油并將1重量份剩余的可可豆部分(可可質(zhì)量)或可可豆殼加入到4-10重量份的50％丙酮、50％乙醇或50％甲醇的水溶液中。然后對(duì)該混合物進(jìn)行攪拌提取，同時(shí)在40-70℃下回流4-6小時(shí)。在將所得提取物離心后回收上清液并再次重復(fù)提取剩余的量。將提取物干燥、過(guò)濾且然后獲得可可豆和可可豆殼的提取物。使由此獲得的提取物吸附在基于苯乙烯的多孔樹(shù)脂上、用40％乙醇洗滌且然后用60％乙醇進(jìn)行溶劑分級(jí)分離而最終得到可可豆和可可豆殼的級(jí)分。
研究由此獲得的可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)GJIC抑制和癌細(xì)胞增殖的抑制活性。所得的結(jié)果表明可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分不僅可以抑制癌細(xì)胞DNA的合成、而且可以抑制屬于癌發(fā)生助長(zhǎng)和發(fā)展階段過(guò)程中發(fā)生的特征現(xiàn)象的GJIC抑制。
本發(fā)明還涉及包括可可豆和可可豆殼的級(jí)分或提取物作為活性組分的藥物或食品添加劑且所述藥物或所述商品名添加劑的制備方法是一種公知方法。
可以將可可豆和可可豆殼的級(jí)分單獨(dú)用作藥物。不過(guò)，也可以將其與藥物上可接受的載體、成形劑、稀釋劑等混合而制成粉劑、顆粒、膠囊和注射劑的形式。
本發(fā)明的可可豆已經(jīng)長(zhǎng)期用作可食用的食品且相對(duì)于對(duì)其提取物和級(jí)分的醫(yī)療用量而言沒(méi)有特別的限制，不過(guò)醫(yī)療用量可以隨患者身體吸收率、體重、年齡、性別和健康情況、給藥時(shí)間長(zhǎng)度、給藥方法、排泄率、疾病的嚴(yán)重性等的不同而改變。一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選每1kg體重給予0.1-10mg的可可豆和可可豆殼級(jí)分。因此，制備包括本發(fā)明活性組分的藥物應(yīng)考慮到所述提取物和級(jí)分的有效范圍。可以在專家的監(jiān)督下按照特定的醫(yī)療方案給予由此制備的給藥用單位制劑或根據(jù)患者的需求給藥或在規(guī)定時(shí)間間隔給藥幾次。
可以將可可豆和可可豆殼級(jí)分用作飲料、膠質(zhì)軟糖、糖果等的食品添加劑。包括可可豆和可可豆殼提取物或級(jí)分作為活性組分的藥物或食品添加劑在預(yù)防癌癥和抑制癌癥發(fā)展方面具有極佳的抑制作用。
在下文中使用下列實(shí)施例來(lái)具體描述本發(fā)明，不過(guò)，不應(yīng)將這些實(shí)施例看作用來(lái)限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1具有抗癌作用的可可豆級(jí)分的制備步驟1通過(guò)溶劑提取制備具有抗癌作用的提取物從可可豆中除去可可油，每1重量份剩余的部分(可可質(zhì)量)加入6重量份的50％丙酮溶液(Duksan Co.，Ltd.，Korea)并在60℃下進(jìn)行攪拌提取5小時(shí)，同時(shí)回流。在4℃下以8,000rpm的速率(Vision Co.，Ltd.，Korea)將該提取物離心30分鐘并收集所得的上清液。將殘余物重復(fù)提取1次并合并全部提取物。將由此收集的提取物通過(guò)濾紙(Whatmann41)過(guò)濾、蒸發(fā)、冷凍干燥且最終得到可可豆的提取物。
步驟2通過(guò)吸收柱層析法制備具有抗癌作用的級(jí)分基于美國(guó)專利US6,159,451中公開(kāi)的方法，通過(guò)使用上述步驟1中制備的提取物經(jīng)吸收柱層析法來(lái)制備可可豆級(jí)分。更具體地說(shuō)，使上述步驟1中制備的提取物吸附在疏水樹(shù)脂XAD-4(Sigma Co.，Ltd.，U.S.)或HP-20(Mitsubishi Co.，Ltd.，Japan)上并使用20％、40％、60％、80％、100％的乙醇依次進(jìn)行分級(jí)分離。
實(shí)施例2具有抗癌作用的可可豆殼級(jí)分的制備步驟1通過(guò)溶劑提取制備具有抗癌作用的提取物從可可豆中除去可可油，每1重量份剩余的部分(可可質(zhì)量)加入6重量份的50％丙酮溶液(Duksan Co.，Ltd.，Korea)并在60℃下進(jìn)行攪拌提取5小時(shí)，同時(shí)回流。在4℃下以8,000rpm的速率(Vision Co.，Ltd.，Korea)將該提取物離心30分鐘并收集所得的上清液。將殘余物重復(fù)提取1次并合并全部提取物。將由此收集的提取物通過(guò)濾紙(Whatmann 41)過(guò)濾、蒸發(fā)、冷凍干燥且最終得到可可豆殼的提取物。
步驟2通過(guò)吸收柱層析法制備具有抗癌作用的級(jí)分基于美國(guó)專利US6,159,451中公開(kāi)的方法，通過(guò)使用上述步驟1中制備的提取物經(jīng)吸收柱層析法來(lái)制備可可豆殼級(jí)分。更具體地說(shuō)，使上述步驟1中制備的提取物吸附在疏水樹(shù)脂XAD-4(Sigma Co.，Ltd.，U.S.)或HP-20(Mitsubishi Co.，Ltd.，Japan)上并使用20％、40％、60％、80％、100％的乙醇依次進(jìn)行分級(jí)分離。
對(duì)由此獲得的可可豆和可可豆殼提取物以及隨后獲得的級(jí)分檢驗(yàn)它們對(duì)通過(guò)由H2O2抑制GJIC和對(duì)癌細(xì)胞DNA合成的抑制作用的抗癌作用，所抑制的現(xiàn)象屬于癌發(fā)生助長(zhǎng)和發(fā)展階段過(guò)程中發(fā)生的特征現(xiàn)象。
實(shí)施例3可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)由H2O2抑制GJIC的作用正如下面進(jìn)一步所解釋的，通過(guò)按照Scrape Loading/DyeTransfer(SL/DL)測(cè)定法(Upham，B.L.，Kang，K.S.，Cho，H.Y.，&Trosko，J.E.，Carcinogenesis，1837-42，1997)的公知方法測(cè)定肝細(xì)胞的GJIC來(lái)檢驗(yàn)可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分的抗癌作用。
將WB-F344大鼠肝臟上皮細(xì)胞用于測(cè)定GJIC。在37℃和5％CO2下的培養(yǎng)箱(Forma Scientific Co.，Marjetta，OH，USA)中將WB-F344與10％FBS一起在添加了100IU/ml青霉素和100∏g/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于上述培養(yǎng)物的培養(yǎng)基組成商購(gòu)自GIBC0BRL(Grand Island，NY，U.S.)。將由此培養(yǎng)的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)入各為2ml的培養(yǎng)皿(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)并培養(yǎng)44小時(shí)。在該步驟后4小時(shí)用不同濃度的可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分與400∏g人體內(nèi)公知癌助長(zhǎng)劑和最強(qiáng)活性氧種類之一的H2O2一起處理細(xì)胞，同時(shí)僅用新鮮培養(yǎng)基替換對(duì)照組。上述處理后1小時(shí)通過(guò)聚焦顯微鏡(BioRad，Hercules，CA，USA)、使用熒光黃染色觀察可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)由H2O2抑制缺口連接通道的抑制水平。將可可豆提取物和級(jí)分對(duì)GJIC抑制的作用列在下面的表1和附圖1中。將可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)GJIC抑制的作用列在表2和附圖1中。通過(guò)測(cè)定圖中顯示出的熒光亮度和長(zhǎng)度、參比100％的對(duì)照組和單獨(dú)用0％的H2O2處理的組來(lái)計(jì)算GJIC的增加率，其中將低于20％的活性表示為幾乎沒(méi)有活性。
表1可可豆提取物和級(jí)分對(duì)GJIC增加的作用
表2可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)GJIC增加的作用
正如上述表1和2中所示，可可豆和可可豆殼的提取物在高于20∏g/mL濃度下對(duì)由H2O2抑制GJIC具有理想的抑制作用。因此，證實(shí)可可豆和可可豆殼的提取物可以通過(guò)抑制屬于癌癥助長(zhǎng)和發(fā)展階段過(guò)程中特征現(xiàn)象的GJIC抑制來(lái)預(yù)防癌癥。
此外，通過(guò)下列步驟獲得可可豆和可可豆殼的級(jí)分通過(guò)溶劑提取對(duì)可可豆和可可豆殼的提取物進(jìn)行分級(jí)分離；將其裝填入吸附樹(shù)脂；用40％乙醇進(jìn)行分級(jí)分離并用60％乙醇對(duì)殘余物重新進(jìn)行分級(jí)分離；所獲得的可可豆和可可豆殼級(jí)分在1∏g/mL濃度下對(duì)GJIC抑制表現(xiàn)出超過(guò)60％的抑制作用，而用50％丙酮和50％乙醇制備的提取物在10∏g/mL濃度下對(duì)GJIC抑制表現(xiàn)出約30-60％的抑制作用，由此證明了按照本發(fā)明獲得的可可豆和可可豆殼級(jí)分的極佳抗癌作用。
附圖1是表示可可豆和可可豆殼的級(jí)分對(duì)大鼠肝臟上皮細(xì)胞中由H2O2產(chǎn)生的抑制GJIC的抑制作用的一組圖，其中H2O2是人體內(nèi)的癌癥助長(zhǎng)劑和最強(qiáng)活性氧種類(ROS)之一(a對(duì)照組；b使用400∏MH2O2治療的組；c使用10∏M/ml可可豆級(jí)分+400∏MH2O2治療的組；d使用10∏M/ml可可豆殼級(jí)分+400∏MH2O2治療的組)。
正如下面進(jìn)一步解釋的，另外通過(guò)使用蛋白質(zhì)印跡分析的公知方法(Upham，B.L.，Kang，K.S.，Cho，H.Y.，&Trosko，J.E.，Carcinogenesis，1837-42，1997)檢驗(yàn)可可豆和可可豆殼的級(jí)分對(duì)控制看作是H2O2抑制GJIC時(shí)發(fā)生的主要現(xiàn)象的缺口連接通道的主要蛋白質(zhì)連接蛋白43超磷酸化的抑制作用。
通過(guò)使用含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的20％SDS從與GJIC測(cè)定中相同方式培養(yǎng)的細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。使用DC測(cè)定試劑盒(BioRadCorp.，U.S.)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。使各約15∏g的提取的蛋白質(zhì)上12.5％SDS-PAGE凝膠并通過(guò)凝膠電泳分離。在與單克隆抗體(Zymed，U.S.)反應(yīng)后通過(guò)使用ECL試劑盒(Amersham，Life Science，U.S.)檢測(cè)連接蛋白43。
附圖2是表示可可豆和可可豆殼對(duì)大鼠肝臟上皮細(xì)胞中由H2O2產(chǎn)生的控制GJIC的主要蛋白質(zhì)連接蛋白43的超磷酸化抑制作用的圖(a對(duì)照組；b使用400∏MH2O2治療的組；c使用10∏M/ml可可豆級(jí)分+400∏MH2O2治療的組；d使用10∏M/ml可可豆殼級(jí)分+400∏MH2O2治療的組)。
正如表1和2以及附圖1和2中所示，經(jīng)證實(shí)可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分通過(guò)經(jīng)抑制由H2O2產(chǎn)生的Cx43超磷酸化來(lái)抑制GJIC抑制而具有抗癌作用，其中H2O2是人體內(nèi)公知的癌癥助長(zhǎng)劑和最強(qiáng)ROS之一，所述的GJIC抑制是包括肝癌在內(nèi)的幾種癌癥癌發(fā)生中出現(xiàn)的病理現(xiàn)象。
實(shí)施例4可可豆或可可豆殼的提取物和級(jí)分對(duì)癌細(xì)胞增殖(DNA合成)的抑制作用正如下面進(jìn)一步所解釋的，通過(guò)使用3H胸苷吸收測(cè)定法(Marshall，E.S.等European J.Cancer，30A1370-1376，1994)來(lái)檢驗(yàn)可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分對(duì)癌細(xì)胞DNA合成的抑制作用。所用癌細(xì)胞的實(shí)例是作為肝癌細(xì)胞的HepG2、作為胃癌細(xì)胞的SNU1和作為結(jié)腸癌細(xì)胞的SNUC2A。
在37℃和5％CO2下的培養(yǎng)箱(Forma Scientific Co.，Marjetta，OH，USA)中分別將HepG2肝癌細(xì)胞、SNU1胃癌細(xì)胞、SNUC2A結(jié)腸癌細(xì)胞與10％FBS、100IU/ml青霉素和100∏g/ml鏈霉素一起在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該培養(yǎng)基商購(gòu)自GIBCO BRL(Grand Island，NY，U.S.)。將由此培養(yǎng)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔平板，其中各自含有2×104個(gè)細(xì)胞并加入獲自參比實(shí)施例1-2的不同濃度的可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分且培養(yǎng)72小時(shí)。在回收上述細(xì)胞前6小時(shí)向各孔中加入1∏Ci的3H-胸苷(Sigma，St.Louis，MO，USA)。在培養(yǎng)完成后，通過(guò)使用回收儀器(Cambridge Scientific Inc.，cambridge，MA，USA)將細(xì)胞回收入玻璃纖維濾器(Brandel Inc.，Gaithersburg，MA，USA)。用液體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)檢測(cè)與3mL閃爍混合物溶液(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)混合后回收細(xì)胞中導(dǎo)入的3H-胸苷。按照上述方法將整個(gè)過(guò)程重復(fù)3次。
分別與100、200、400、800∏g/mL濃度下的可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分一起培養(yǎng)癌細(xì)胞且然后進(jìn)行3H胸苷吸收試驗(yàn)。計(jì)算可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制率且列在下面的表3-8中。
正如下表3-8中所示，通過(guò)下列步驟獲得的可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)癌細(xì)胞增殖表現(xiàn)出極佳的抑制作用通過(guò)溶劑提取制備可可豆和可可豆殼的提取物；將其裝填入吸附樹(shù)脂；用40％乙醇進(jìn)行分級(jí)分離并用60％乙醇對(duì)殘余物重新進(jìn)行分級(jí)分離。可以將與對(duì)如上所述的GJIC抑制具有極佳抑制作用的可可豆和可可豆殼級(jí)分一致的可可豆和可可豆殼的這些級(jí)分用作對(duì)癌癥發(fā)展具有預(yù)防和抑制用的極佳抗癌劑。
表3可可豆提取物和級(jí)分對(duì)肝癌細(xì)胞增殖(DNA合成)的作用
表4可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)肝癌細(xì)胞增殖(DNA合成)的作用
表5可可豆提取物和級(jí)分對(duì)胃癌細(xì)胞增殖(DNA合成)的作用
表6可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)胃癌細(xì)胞增殖(DNA合成)的作用
表7可可豆提取物和級(jí)分對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖(DNA合成)的作用
表8可可豆殼提取物和級(jí)分對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖(DNA合成)的作用
正如附圖5-7中所示，肝癌、胃癌和結(jié)腸癌的細(xì)胞的增殖率依賴于可可豆和可可豆殼級(jí)分的濃度。因此，通過(guò)下列步驟獲得的可可豆和可可豆殼級(jí)分對(duì)癌癥發(fā)展表現(xiàn)出極佳的抑制作用通過(guò)溶劑提取制備可可豆和可可豆殼的提取物；將其裝填入吸附樹(shù)脂；用40％乙醇進(jìn)行分級(jí)分離并用60％乙醇對(duì)殘余物重新進(jìn)行分級(jí)分離。
硬脂酸鎂5g總計(jì)100g通過(guò)粉碎成小碎塊且將上述組分混合且然后通過(guò)直接壓片法制備。制備含有總量為100mg的各片且每片中活性組分的量為10mg。
實(shí)施例7毒性試驗(yàn)如下對(duì)可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分測(cè)試毒性將上述可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分溶于50％乙醇水溶液、用水稀釋且然后以1g/kg的濃度對(duì)大鼠給藥并觀察7天。結(jié)果證明全部大鼠均存活。
實(shí)施例8通過(guò)使用包括20wt％膠質(zhì)軟糖基質(zhì)、76.9wt％的糖、1wt％食用香料、2wt％的水和0.1wt％獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)口香糖。
實(shí)施例9通過(guò)使用包括60wt％糖、39.8wt％淀粉漿、0.1wt％食用香料和0.1wt％獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)糖果。
實(shí)施例10通過(guò)使用包括50wt％糖醇、49.8wt％麥芽糖、0.1wt％食用香料和0.1wt％獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)口香糖。
實(shí)施例11通過(guò)使用包括下列成分的的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)餅干25.59wt％的一級(jí)筋力弱的面粉、22.22wt％的一級(jí)中等面粉、4.80wt％的糖、0.73wt％的鹽、0.78wt％的葡萄糖、11.78wt％的棕櫚起酥、1.54wt％的碳酸氫銨、0.17wt％的碳酸氫鈉、0.16wt％的焦亞硫酸鈉、1.45wt％的米粉、0.0001wt％的維生素B1、0.0001wt％的維生素B2、0.04wt％的奶粉、20.6998wt％的水、1.16wt％的全脂奶粉、0.29wt％的干乳粉替代品、0.03wt％的磷酸二氫鈣、0.29wt％的霧化鹽、7.27wt％的霧化乳和1wt％的獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分。
實(shí)施例12通過(guò)使用包括下列成分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)飲料0.26wt％的蜂蜜、0.0002wt％的硫辛酸酰胺、0.0004wt％的煙酸酰胺、0.0001wt％的核黃素-5’-磷酸鈉、0.0001wt％的HCl吡哆素、0.001wt％的肌醇、0.002wt％的原酸、98.7362wt％的水和1wt％的獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分。
實(shí)施例13通過(guò)使用包括下列成分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)飲料3.5wt％的水果提取物、4.8wt％的果泥、7.78wt％的糖、0.11wt％的檸檬酸、82.71wt％的純水和1wt％的獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分。
實(shí)施例14通過(guò)使用包括下列成分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)香腸65.18wt％的豬肉、25wt％的雞肉、3.5wt％的淀粉、1.7wt％的大豆蛋白、1.62wt％的鹽、0.5wt％的葡萄糖；1.5wt％的甘油和1wt％的獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分。
實(shí)施例15通過(guò)使用包括下列成分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)片型的保健食品55wt％的spirurina、10wt％的胍爾豆膠的酶降解產(chǎn)品、0.01wt％的鹽酸維生素B1、0.01wt％的鹽酸維生素B6、0.23wt％的DL-甲硫氨酸、0.7wt％的硬脂酸鎂；22.2wt％的乳糖、1.85wt％的玉米淀粉和10wt％的獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分。
實(shí)施例16通過(guò)使用包括下列成分的組合物、按照常規(guī)方法生產(chǎn)膠囊型的保健食品11.26wt％的殼寡糖、0.2wt％的大蒜粉、0.2wt％的銀杏提取物粉、0.9wt％的E-胡蘿卜素(30％混懸液)、1.2wt％的A-生育酚、1.2wt％的卵磷脂；4.5wt％的精制棕櫚油、1.6wt％的黃蜂蠟、18.994wt％的大豆油、37.83wt％的明膠、16.51wt％的甘油、0.09wt％的乙基香草醛、0.076wt％的二氧化鈦、0.44wt％的食用色素和10wt％的獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼級(jí)分。
如上所述，可以將獲自上述實(shí)施例的可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分看作食品等同物且由此可以安全地作為抗癌劑給予而不再使用另外除去毒性的純化步驟。此外，通過(guò)單純分離方法生產(chǎn)可可豆和可可豆殼提取物和級(jí)分制劑的方法能夠比那些常規(guī)抗癌劑的生產(chǎn)方法降低單位生產(chǎn)成本；特別從經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)來(lái)看，已經(jīng)作為廢物丟棄的大量可可豆殼的再循環(huán)利用可能極有價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種抗癌劑，它包括可可豆的級(jí)分或提取物作為活性組分。
2.權(quán)利要求1所述的抗癌劑，其中所述的可可豆含有可可豆殼。
3.一種含有可可豆級(jí)分或提取物的食品添加劑，其特征在于它具有預(yù)防癌癥的作用和抑制癌癥的作用。
4.一種權(quán)利要求3的食品添加劑，其中所述的可可豆含有可可豆殼。
全文摘要
本發(fā)明涉及可可豆和可可豆殼的提取物和級(jí)分，它們抑制屬于癌發(fā)生助長(zhǎng)和進(jìn)展階段過(guò)程中發(fā)生的病理現(xiàn)象的GJIC(缺口連接細(xì)胞通訊)抑制和癌細(xì)胞DNA的合成。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1481827SQ0212760
公開(kāi)日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2002年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者李炯周, 李基遠(yuǎn), 康景宣, 金東永, 樸炯煥, 李萬(wàn)鐘, 金漢洙, 權(quán)益夫 申請(qǐng)人:Lotte制果株式會(huì)社