專利名稱：利用轉(zhuǎn)基因靈芝表達人胰島素降血糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工合成人胰島素基因，并在編碼區(qū)結(jié)構(gòu)上加以修飾。選用真菌中強表達的啟動子構(gòu)造。置于適合靈芝轉(zhuǎn)化的載體中，通過電擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化靈芝。獲得表達人胰島素的靈芝，并通過口服灌喂高血糖大鼠證明有效，從而提供了利用轉(zhuǎn)基因靈芝降血糖的方法。
背景技術(shù)：
1、胰島素胰島素是由胰島β細胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，分子量約6000kD，分子中有兩條肽鏈，稱為A鏈和B鏈，人胰島素A鏈有21個氨基酸殘基，B鏈有30個氨基酸殘基，A、B鏈之間通過兩個二硫鍵連接在一起(A鏈第7位的半胱氨酸殘基與B鏈第7位的半胱氨酸殘基連接，A鏈第20位的半胱氨酸殘基與B鏈第19位的半胱氨酸殘基連接)，A鏈內(nèi)部有一個二硫鍵連接(A鏈第6位的半胱氨酸殘基與第11位的半胱氨酸殘基連接)。胰島素分子的結(jié)構(gòu)可分為六個片斷A鏈中兩段α螺旋(A1-A8和A12-A18)由A9到A11肽鏈連接，其中A6、A11由二硫鍵相連；B鏈的中部是一段α螺旋(B9-B19)，緊接著一個β回折(B20-B23)，其兩端是兩段運動性很大的伸展肽段(B1-B9和B24-B30)。六個片斷中三段α螺旋和一個β回折是具有一定剛性的二級結(jié)構(gòu)，組成了胰島素分子的三維骨架，這是胰島素發(fā)揮其生物功能所必需的最基本的空間結(jié)構(gòu)要素。同時它們之間鉸鏈?zhǔn)降南鄬\動，為胰島素發(fā)揮各種復(fù)雜的生物功能提供了結(jié)構(gòu)上的可能性(王志珍，梁棟材，1985)。
胰腺中的β細胞首先合成的是一個大分子的前胰島素原(Preproinsulin)，以后加工成由86個氨基酸殘基組成的胰島素原(Proinsulin)，在酶的作用下，胰島素原又進一步裂解，產(chǎn)生一個胰島素分子和一段連接肽(C肽)。編碼前胰島素原的基因位于第11對染色體的短臂上，基因共有1355個堿基對，其編碼區(qū)域包括3個外顯子，分別編碼前胰島素原的前肽、B鏈和部分C肽以及A鏈和其他部分的C肽。
胰島素起作用的方式是通過與受體的結(jié)合實現(xiàn)的。胰島素的受體是一種跨膜糖蛋白，是由2個α亞單位及2個β亞單位組成的四聚體，前者分子量約為135000Da，后者分子量約為95000Da，4個亞單位由二硫鍵連接，一種非典型的酪氨酸蛋白激酶(PTK)受體。編碼胰島素受體的基因位于第19號染色體短臂之上，位置與低密度脂蛋白受體基因接近。α亞單位穿過細胞膜，一端暴露在細胞膜表面，具有胰島素結(jié)合位點。β亞單位由細胞膜向胞漿延伸，是胰島素引發(fā)細胞膜與細胞內(nèi)效應(yīng)的功能單位。胰島素與α亞單位結(jié)合后，β亞單位中酪氨酸激酶被激活，使受體磷酸化，產(chǎn)生介體，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酶系統(tǒng)活性，控制物質(zhì)代謝。每種細胞與胰島素結(jié)合的程度取決于細胞膜上的受體數(shù)目與親和力，此二者又受血漿胰島素濃度的調(diào)節(jié)。當(dāng)血漿胰島素濃度增高時，胰島素受體數(shù)目下降，這種現(xiàn)象稱下降調(diào)節(jié)。如肥胖的非胰島素依賴型糖尿病人由于脂肪細胞膜上受體數(shù)下降，臨床上呈胰島素不敏感性，稱為胰島素抵抗。而當(dāng)肥胖的非胰島素依賴型糖尿病患者經(jīng)飲食控制、體育鍛煉后體重減輕時，脂肪細胞膜上胰島素受體數(shù)增多，與胰島素的結(jié)合力也增強，胰島素又恢復(fù)了其控制血糖的正常功能。
2、糖尿病糖尿病是一個古老的疾病，其名字來源于病人小便中因含糖而味甜。糖尿病在臨床上以高血糖為主要標(biāo)志，常見的癥狀俗稱“三多一少”，即多飲、多尿、多食、消瘦。
糖尿病的病因十分復(fù)雜，遺傳因素和環(huán)境因素均能導(dǎo)致糖尿病。但所有的病因歸根結(jié)底有三項，即胰島素絕對缺乏、胰島素相對缺乏、胰島素抵抗。因此，在β細胞產(chǎn)生胰島素、血液循環(huán)系統(tǒng)運送胰島素以及靶細胞接受胰島素并發(fā)揮生理作用這三個步驟中任何一個發(fā)生問題，均可引起糖尿病。
A.胰島β細胞水平由于胰島素基因突變，β細胞合成變異胰島素，或β細胞合成的胰島素原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，不能被蛋白酶水解，均可導(dǎo)致II型糖尿病的發(fā)生。而如果β細胞遭到自身免疫反應(yīng)或化學(xué)物質(zhì)的破壞，細胞數(shù)顯著減少，合成胰島素很少或根本不能合成胰島素，則會出現(xiàn)I型糖尿病。
B.血液運送水平血液中抗胰島素的物質(zhì)增加，可引起糖尿病。這些對抗性物質(zhì)為胰島素受體抗體及一些激素類物質(zhì)。胰島素受體與其抗體結(jié)合后，便不能再與胰島素結(jié)合，因而胰島素不能發(fā)揮生理性作用，從而導(dǎo)致血糖升高，引起糖尿病。激素類物質(zhì)也可對抗胰島素的作用，如兒茶酚胺。皮質(zhì)醇在血液中的濃度異常升高時，亦可致血糖升高。
C.靶細胞水平胰島素受體數(shù)量減少、受體與胰島素親和力降低以及受體的缺陷，均可引起胰島素抵抗、代償性高胰島素血癥。這些因素最終使胰腺β細胞逐漸衰竭，血漿胰島素水平下降。胰島素抵抗在II型糖尿病的發(fā)病機制中占有重要地位。
根據(jù)對糖尿病病因的進一步認(rèn)識，世界衛(wèi)生組織(WHO)于1996年對糖尿病的分型分類進行了新的修訂。WHO在1985年已制定了一套糖尿病的分類方法，鑒于這套分類方法中的胰島素依賴型糖尿病(IDDM)及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)主要是基于治療層面的分類，但不能反映其發(fā)病機制的差異，因此在1996年的修訂中取消了IDDM和NIDDM的命名術(shù)語，而保留了I型及II的分型方法，并在亞型充分體現(xiàn)其發(fā)病機制的差異。新的分型分類方法同時取消了糖耐量損害(IGT)的分型，因為IGT是糖尿病發(fā)展過程中的一個階段，而不是一種疾病。
糖尿病最新分型、分類法(WHO，1996年12月)(一)I型糖尿病胰島β細胞破壞致胰島素缺乏1.自身免疫性(1)急性發(fā)病(1)緩慢發(fā)病2.特發(fā)性(二)II型糖尿病1.胰島素抵抗為主伴胰島素分泌不足2.胰島素分泌不足為主伴或不伴胰島素抵抗(三)特異型糖尿病1.胰島β細胞功能基因缺失2.胰島素作用的基因缺失3.胰腺外分泌疾病4.內(nèi)分泌疾病5.藥物及化學(xué)毒物所致6.感染7.非常見型免疫調(diào)節(jié)糖尿病8.某些遺傳疾病糖尿病鏈尿霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型鏈尿霉素(又稱鏈脲佐菌素，英文Streptozocin，簡稱STZ)能破壞實驗大鼠的胰腺β細胞，使得實驗大鼠胰島素的分泌水平降低，從而導(dǎo)致血糖升高，一般在斷食4小時后血糖值仍高于14mmol/L，而大鼠正常的血糖值為4～8mmol/L。鏈霉素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型是目前常用的糖尿病模型，它模擬了糖尿病患者β細胞分泌胰島素功能降低的病因。
3、食用真菌生物反應(yīng)器植物及食用真菌生物反應(yīng)器通常是指利用轉(zhuǎn)基因的整株植物或食用真菌子實體及菌絲作為工廠大量表達藥物、植物次生代謝產(chǎn)物、工業(yè)用酶及新興工業(yè)原料等產(chǎn)品。植物及食用真菌作為生物反應(yīng)器由于具有可以直接口服、對蛋白質(zhì)正確折疊、糖基化和組裝，低廉的生產(chǎn)成本，避免了動物病原體的感染等優(yōu)勢，因此在表達疫苗、抗體及其他藥用蛋白質(zhì)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。食用真菌如香菇、金針菇、靈芝等由于蛋白含量大，可以不長出子實體直接在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)菌絲從而縮短了生長周期，因此也成為一類很有發(fā)展前景的生物反應(yīng)器。
4、口服胰島素胰島素是治療糖尿病的重要藥物。對于I型糖尿病病人而言，降低血糖水平的方法通常有兩種一種是注射胰島素，另一種是胰腺移植。然而，注射胰島素由于并非模仿胰腺β細胞分泌胰島素的生理過程，因此只能夠控制病情的發(fā)展，而不能夠使疾病的狀況有所改善，并且有可能引起視神經(jīng)萎縮、皮膚過敏和神經(jīng)痛等副作用；胰腺移植則經(jīng)常會引起較強的免疫排斥反應(yīng)。
口服耐受性是對于口服蛋白質(zhì)抗原特異的免疫反應(yīng)，它最近被越來越多的人認(rèn)為是一種治療自身免疫疾病和防止移植排斥的好方法。作為一種達到口服耐受性的途徑，口服胰島素成為了一種新興的治療方法，并已引起人們的關(guān)注。它突破了傳統(tǒng)的治療方法，治療目的在于防止或減輕β細胞自身免疫的損害，意圖在高血糖癥出現(xiàn)之前阻止其破壞。已有的實驗表明，口服胰島素可以對I型糖尿病的病情起到一定程度的改善，并且可以預(yù)防或延遲I型糖尿病的發(fā)生；同時對II型糖尿病也有一定的療效。
口服胰島素起作用的方式有兩種(I)、沒有被胃腸酶類降解的胰島素穿過腸系膜系統(tǒng)進入血液循環(huán)系統(tǒng)，按照注射胰島素相同的作用機理與肌肉、肝臟及脂肪等器官組織的細胞表面胰島素受體結(jié)合，再通過一系列的后續(xù)反應(yīng)起到降低血糖的作用。(II)、胰島素及被降解后的部分胰島素抗原片段激活腸道的粘膜免疫系統(tǒng)，這種自身抗原(即胰島素和降解后的部分抗原片段)可以引發(fā)口服耐受性的產(chǎn)生，口服免疫性的一個作用就是使得原本有害的自身免疫反應(yīng)被一種無害的過程所代替，可以起到對疾病的預(yù)防作用。I型糖尿病就是一種自身免疫疾病，胰腺β細胞分泌的胰島素導(dǎo)致了人體產(chǎn)生攻擊β細胞的T免疫細胞，從而使得β細胞慢慢失去功能。

發(fā)明內(nèi)容
1、克隆了人胰島素原類似物基因InsK將人胰島素的B鏈和A鏈通過6個氨基酸的柔性連接短肽連接成一個完整的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，并在人胰島素原類似物基因的C端添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(Endoplasmic Reticulum retention signal)編碼序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu-COO-，即KDEL)，并命名為人胰島素原類似物基因InsK。
為了有利于合成的人胰島素可以正確折疊成天然的構(gòu)象，在人胰島素的B鏈與A鏈之間設(shè)計了一個6個氨基酸的柔性連接短肽以代替胰島素原的C肽。因為對天然人胰島素的三維結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，B鏈C端和A鏈N端的空間線性距離為16.12埃，而線性排列的五肽的最小空間距離為16.0埃，為了不改變?nèi)诤系亩嚯逆溨蠥鏈和B鏈的構(gòu)象，推測它們之間的連接肽的最小殘基數(shù)應(yīng)不少于5個殘基?？紤]到B鏈C端和A鏈N端在空間上的取向相反，連接肽最好能形成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。不同氨基酸在形成二級結(jié)構(gòu)時具有不同的傾向和能力，其中Pro和Gly很少形成α-螺旋和β-折疊，而Pro，Gly，Asn，Ser在β-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象中最常見，推測Gly-Pro-Ser的結(jié)構(gòu)最有可能形成β-轉(zhuǎn)角。基于以上考慮，本實驗選用的連接肽序列為Gly-Gly-Pro-Ser-Gly-Gly。
2、構(gòu)建了電擊法及PEG介導(dǎo)法的表達載體pbinsK和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達載體p1300-GinsK在轉(zhuǎn)基因靈芝中采用了香菇三磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)啟動子驅(qū)動人胰島素原類似物基因InsK，并構(gòu)建了電擊法及PEG介導(dǎo)法的表達載體pbinsK和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達載體p1300-GinsK。pbinsK載體以具有除草劑(PPT)抗性的bar基因為選擇標(biāo)記，無左邊界序列(Left Border，LB)和右邊界序列(Right Border，RB)，p1300-GinsK表達載體以具有除草劑(PPT)抗性的bar基因以及具有潮霉素(Hyg)抗性的hptII基因為選擇標(biāo)記，具有左右邊界序列，適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝。
三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD)是糖代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，在糖酵解和糖異生作用中催化三磷酸甘油醛與磷酸甘油酸的相互轉(zhuǎn)化()。NADH通過電子傳遞鏈產(chǎn)生三個ATP。該反應(yīng)是酵解過程中唯一生成NADH的反應(yīng)，是產(chǎn)生能量的重要一步。因此GPD蛋白在活細胞內(nèi)含量極其豐富且持續(xù)表達。三磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)在香菇中呈組成型強表達，GPD啟動子在酵母和黑曲霉等工業(yè)用真菌中可以驅(qū)動外源基因的高效表達(Bitter and Egan 1984)。靈芝與香菇同屬于真菌，采用GPD啟動子有效解決了人胰島素原類似物基因在轉(zhuǎn)基因靈芝中的高效表達。
3、通過電擊法、PEG介導(dǎo)法及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化靈芝利用溶壁酶降解靈芝細胞壁以制備原生質(zhì)體，在加入高濃度質(zhì)粒pbinsK后進行電擊和PEG轉(zhuǎn)化，在含有PPT(20μg/ml)的篩選CYM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7天后有轉(zhuǎn)化子長出；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法則無需制備靈芝原生質(zhì)體，將一定濃度的靈芝菌絲懸浮液與含有表達載體p1300-GinsK的農(nóng)桿菌LBA4404菌株共培養(yǎng)2天，然后在上層倒上CYM篩選培養(yǎng)基(PPT濃度20μg/ml)，7～10天后有具有PPT抗性的轉(zhuǎn)化子長出。通過電擊法、PEG介導(dǎo)法及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的靈芝品種之間差異較小，我們獲得了赤芝(Ganoderma lucidum)、紫芝(Ganoderma japonicum)及南方靈芝(Ganoderma australe)的陽性轉(zhuǎn)基因靈芝株系，由于不同靈芝品種之間的差異較小，因此用同樣的方法可以獲得薄蓋靈芝(Ganodermacapense)、樹舌(Ganoderma applanatum)以及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金針姑、猴頭等，以及藥用真菌蟲草菌(Cordyceps sinensis)等。
4、靈芝子實體的培養(yǎng)及孢子的收獲所得含有上述胰島素基因結(jié)構(gòu)的靈芝菌株接種于含木屑、麥麩等成分的固體培養(yǎng)基上。子實體培養(yǎng)基采用通用的木屑加麥麩，即三份體積的細木屑加一份體積的麥麩，加水(含水量80％)，混勻，裝瓶(或裝于耐高溫的塑料袋內(nèi))，滅菌。接種后置28℃培養(yǎng)。待菌絲長滿后置28℃高濕(相對濕度80-90％以上)條件下使其分化出子實體，長出菌傘。隨著菌傘的成熟過程，形成大量靈芝孢子粉。在潔凈的條件下，收集靈芝孢子粉。此靈芝孢子粉具有高含量的人胰島素。此靈芝孢子粉中人胰島素含量通常不低于試驗中的菌絲體。因其具有更為濃密的原生質(zhì)成分。孢子中代謝穩(wěn)定，人胰島素得到很好的保護。孢子粉的外殼及所具有的萌發(fā)孔，對人胰島素在腸道中起緩慢釋放的作用。
5、PCR和ELISA檢測人胰島素原類似物基因的整合及表達量將具有PPT抗性的靈芝培養(yǎng)出一定數(shù)量，采用SDS法提取靈芝總DNA，并采用PCR檢測轉(zhuǎn)基因靈芝中的GPD-InsK片段，以此判斷外源基因是否整合到靈芝基因組中。為了定量檢測轉(zhuǎn)基因靈芝中人胰島素原類似物的表達量，采用ELISA方法檢測，以人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品為參照作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗結(jié)果表明人胰島素原類似物在轉(zhuǎn)基因靈芝中表達量能達到抽提總蛋白的4.40％～10.40％，每克靈芝菌絲或孢子鮮重中含有的人胰島素原類似物質(zhì)量為105.0μg～174.8μg。
6、高血糖大鼠灌喂實驗證實轉(zhuǎn)人胰島素靈芝具有口服降血糖作用為了驗證轉(zhuǎn)基因靈芝中含有的人胰島素原類似物能否在靈芝細胞壁和細胞膜的包裹下避免在胃腸道被大量降解，我們設(shè)計了高血糖大鼠灌喂實驗。挑選48只體重均為250克左右的雄性大鼠(SD品系)，按照60mg/kg的劑量腹腔注射鏈尿佐菌素(streptozocin，STZ)來制作高血糖大鼠模型，挑選血糖值14mmol/L以上的大鼠作為造模成功的高血糖大鼠模型。挑選其中的30只大鼠按照血糖值由低到高排序并隨機分為三組，每組10只，使得低、中、高血糖的大鼠比較均勻地分入三組中。為了驗證轉(zhuǎn)基因靈芝的血糖較低功效是由于轉(zhuǎn)入的人胰島素原類似物表達所產(chǎn)生的，而非靈芝本身的功效，因此除了做灌喂生理鹽水為對照，還以灌喂未轉(zhuǎn)基因的普通靈芝為對照。對實驗數(shù)據(jù)的Student’s t檢驗表明灌喂轉(zhuǎn)基因靈芝的大鼠組血糖水平與灌喂未轉(zhuǎn)基因靈芝的對照組相比有極顯著性降低(P＜0.0002)，除了2只血糖值下降在誤差范圍內(nèi)，余下的80％大鼠血糖值均有大幅度下降，下降的最高幅度可達64％。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的有益效果在于利用食用真菌靈芝作為生物反應(yīng)器高效表達了人胰島素原類似物，每克靈芝菌絲或孢子鮮重中人胰島素原類似物的含量可以達到105.0μg～174.8μg的水平。高血糖大鼠灌喂實驗表明口服這種轉(zhuǎn)基因靈芝在4小時后可以大幅度降低大鼠的血糖水平，與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.0002)，從而說明本專利發(fā)明的方法制備了一種可以用來治療糖尿病的轉(zhuǎn)基因靈芝。
四、附圖簡要說明

圖1是表示靈芝表達載體pbinsK構(gòu)建流程的示圖。
圖2是表示靈芝表達載體p1300-GinsK構(gòu)建流程的示圖。
圖3是電擊法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體在CYM篩選培養(yǎng)基上的再生。
圖4是PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體在CYM篩選培養(yǎng)基上的再生。
圖5是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝菌絲在CYM篩選培養(yǎng)基上的再生。
圖6是轉(zhuǎn)基因靈芝的熱啟動PCR檢測。
PCR檢測的片段為GPD-InsK，譜帶從左到右編號依次為M，+，-，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11。其中M為λDNA/HindIII+EcoRI Marker，+為正對照p1300-GinsK，-為負(fù)對照ddH2O，1-11表示不同轉(zhuǎn)基因靈芝株系。熱啟動PCR是指在94℃10分鐘后加入Taq聚合酶。
圖7是轉(zhuǎn)基因靈芝Western點雜交。
從左到右依次編號1，2，3，4，5，6。上排表示樣品原液，下排表示稀釋10倍的樣品。其中1為未轉(zhuǎn)基因靈芝，2-6為不同轉(zhuǎn)基因靈芝株系。
圖8是轉(zhuǎn)基因靈芝Western雜交。
從左到右依次編號1，2，3，4，5。其中1為未轉(zhuǎn)基因靈芝，2-5為不同轉(zhuǎn)基因靈芝株系。
圖9是高血糖大鼠模型灌喂未轉(zhuǎn)基因靈芝后血糖變化圖。
從圖中可以看出在灌喂前后大鼠的血糖無明顯變化，統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示灌喂前后無顯著性差異(P＝0.210)。
圖10是高血糖大鼠模型灌喂轉(zhuǎn)基因靈芝4小時后血糖變化圖。
從圖中可以看出在灌喂后大鼠的血糖明顯下降，統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示灌喂前后有極顯著性差異(P＜0.0002)。
圖11是高血糖大鼠模型灌喂轉(zhuǎn)基因靈芝4小時及20小時后血糖變化圖。
本圖反映了灌喂轉(zhuǎn)基因靈芝后4小時大鼠血糖降低及20小時后部分大鼠血糖恢復(fù)的情況。
五具體實施例方式所有實施例中的細菌培養(yǎng)和DNA操作均參考《分子克隆實驗室操作指南》(金冬雁等譯，科學(xué)出版社，北京(1993))和《精編分子生物學(xué)指南》(顏子穎等譯，科學(xué)出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性內(nèi)切酶均購自Promega公司，New EnglandBiolabs公司。
實施例1 InsK基因的克隆根據(jù)Murray E.E.等人提供的植物中使用密碼子的情況，推測植物偏愛密碼子。將人胰島素原類似物基因InsK的雙鏈分成8段，使得兩條鏈5’端的一端略短，同時可作為PCR反應(yīng)的引物，另外3’端略長，彼此相互重疊并覆蓋基因全長。注意分段時盡量以G、C作為結(jié)尾。
表1雙鏈法合成InsK基因所用的8條鏈


雙鏈DNA的處理第一步將8條寡聚核苷酸引物以每管2.5OD的量合成，并按照下表無菌水的量稀釋，使得每一條寡聚核苷酸引物的終濃度均為0.11nmol/μl表2合成InsK基因所用的8條寡聚核苷酸引物基本信息及稀釋情況

第二步5’端加磷反應(yīng)上述8管各取10μl分別加入0.5ml的Eppendorf管中，在冰上放15min，其后進行加磷反應(yīng)。加磷反應(yīng)于37℃反應(yīng)1hr以上，反應(yīng)體系為25μl體系寡聚核苷酸引物 10μlT4寡聚核苷酸激酶(稀釋10倍) 2.5μl10×緩沖溶液 2.5μl無菌水 10μl第三步退火將加磷后的8個片段各取5μl，加入0.2ml Eppendorf管中，再加入10μl10×T4連接酶緩沖溶液及15μl無菌水，混勻；95℃放置10min，用沸水浴逐漸冷卻至室溫，后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，慢慢冷卻。
載體pGEM-11Z的酶切用堿裂解法提取pGEM-11Z質(zhì)粒，并用EcoRI和BamHI消化pGEM-11Z質(zhì)粒載體，酶切過夜后補無菌水400ul，用2倍無水乙醇沉淀，其后溶解至30ul。酶切體系為100μl體系pGEM-11Z質(zhì)粒 59μl10×緩沖溶液 10μlEcoRI 3μlBamHI 3μlRNase 4μl無菌水 21μl堿裂解法提取細菌質(zhì)粒的步驟(1)、挑取單菌落接種于含適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜(14～16小時為宜)；(2)、取1.5ml菌液加入1.5ml的Eppendorf離心管中，7000rpm離心20秒；(3)、倒掉上清再加入1.5ml菌液，7000rpm離心20秒后倒掉上清液并倒置于吸水紙上，盡量讓液體流盡(這一步相當(dāng)于富集了菌液3.0ml)；(4)、加入300μl溶液I(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH＝8.0)并于漩渦器上將菌液完全漩渦混勻；(5)、加入新鮮配置的溶液II(0.2mol/L NaCl，1％SDS)300μl，輕輕上下顛倒混勻，并置于冰上2分鐘；(6)、加入300μl預(yù)冷的溶液III(100ml溶液中加5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，無菌水28.5ml)，上下顛倒混勻5～6次，置于冰上5分鐘；(7)、12000rpm離心5分鐘；(8)、取出上清液至另一管中，并加入450μl氯仿(CI)，顛倒混勻后12000rpm離心5分鐘；(9)、取上清液至另一管中，加入500μl異丙醇，上下顛倒混勻后室溫放置10分鐘以上；(10)、12000rpm離心5分鐘；(11)、棄上清液，沉淀晾干后每管分別加入200μl無菌水，待其溶解后加入100μl預(yù)冷的乙酸銨(7.5mol/L)，顛倒混勻后于冰上放置8分鐘；(12)、12000rpm離心5分鐘；(13)、取上清液入另一管，加入250μl異丙醇，顛倒混勻后室溫放置10分鐘以上；(14)、12000rpm離心5分鐘；(15)、棄上清液，在吸水紙上使液體盡量流盡，加入500μl 70％的乙醇進行洗滌并真空抽干；(16)、質(zhì)粒用20μl無菌水溶解。
人胰島素原類似物基因InsK與載體的連接將退火后的體系取出，冰上放置10min，再加入載體pGEM-11Z酶切后沉淀的大片段27μl及8μl T4DNA連接酶(3U/μl)，于16℃連接過夜。連接體系為100μl體系寡聚核苷酸引物 8×5μl(即8條引物各加5μl)載體大片段 27μl10×連接酶緩沖溶液 10μlT4DNA連接酶 8μl無菌水 15μl連接產(chǎn)物p11Z-InsK的轉(zhuǎn)化及鑒定連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細胞，并通過藍白篩和PCR擴增對重組子進行鑒定。對鑒定陽性的重組子進行測序，測序由上海生工公司進行。測序結(jié)果出來后通過DNAMAN分析軟件與原來設(shè)計的序列進行比對，將核對后測序無誤的重組子中所含的質(zhì)粒命名為p11Z～InsK。
大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(1)、挑取大腸桿菌(E.coli)DH5α單菌落接種于100ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.4；(2)、冰浴10分鐘，分裝于無菌離心管中，4℃，4000rpm離心5分鐘并收集細胞；(3)、重懸于600μl預(yù)冷的0.1M CaCl2中，冰浴30分鐘；(4)、4℃，4000rpm離心10分鐘收集細胞。用100μl預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸細胞沉淀，待用。
感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化(1)、取100μl感受態(tài)細胞加5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰置30分鐘；(2)、于42℃水中熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2分鐘；(3)、加200μl LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘至1小時；(4)、均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
重組子的藍白斑篩選對于載體上含有l(wèi)acZ基因的重組質(zhì)粒，可以利用X-Gal/IPTG選擇培養(yǎng)基進行初步篩選，沒有插入外源片段的自身環(huán)化質(zhì)粒菌落為藍色，插入外源片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。pGEM-11Z質(zhì)粒含有l(wèi)acZ基因，BamHI和EcoRI酶切位點位于lacZ基因的中間，插入DNA片段后破壞了lacZ基因的讀碼框，因而可進行藍白斑篩選。
PGR擴增反應(yīng)體系為25μl，體系中各組分的用量如下DNA模板1μl5’引物1μl3’引物1μlPCR緩沖液(10×)2.5μlTaq酶 0.3μldNTP 0.2μl無菌水 19μl
PCR擴增反應(yīng)條件如下 實施例2 靈芝表達載體pbinsK的構(gòu)建用HindIII和BamHI完全消化pL221質(zhì)粒，從中切出1.4kb的含有PLeGPD啟動子的片段，回收該小片段，并將該片段連接至同樣用HindIII和BamHI酶切消化并回收大片段的pGEM11Z-insK質(zhì)粒中，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pLinsK。用HindIII和SacI從pLinsK質(zhì)粒上切下含有GPD-insK的大小約1.6kb的片段，并將該片段連接至同樣用HindIII和SacI酶切消化并回收大片段的pL321b質(zhì)粒上，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pbinsK。構(gòu)建流程見附圖1。
操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定均按照實施例1所述步驟進行。
本構(gòu)建流程中用到的初始質(zhì)粒pL221和pL321b由本實驗室的孫麗構(gòu)建(見孫麗2001年博士論文)。
實施例3 靈芝表達載體p1300-GinsK的構(gòu)建用HindIII和KpnI完全消化pbinsK質(zhì)粒，從中切出3.4kb的片段，回收該片段，并將該片段連接至同樣用HindIII和KpnI酶切消化并回收大片段的p1300-Super-PAnos質(zhì)粒中，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為p1300-GinsK。構(gòu)建流程見附圖2。
操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PGR鑒定均按照實施例1所述步驟進行。
本構(gòu)建流程中用到的初始質(zhì)粒p1300-Super-PAnos由美國Purdue大學(xué)StantonB.Gelvin教授實驗室惠贈并在本實驗室保存。
實施例4 電擊法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體靈芝菌絲的培養(yǎng)將不同種類的靈芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方靈芝Ganoderma australe、薄蓋靈芝Ganoderma capense)接種于CYM固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5天。將活化好的菌種接種于裝有玻璃珠的100ml液體CYM培養(yǎng)基中，28℃靜止培養(yǎng)4～5天，每天搖瓶1～2次以打散菌絲。菌絲培養(yǎng)過程可以發(fā)現(xiàn)，紫芝和薄蓋靈芝生長要快于赤芝和南方靈芝，此外樹舌(G.applanatum)及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金針姑、猴頭等，以及藥用真菌蟲草菌(Cordyceps sinensis)等也同樣可以按照以下的實施例進行基因遺傳轉(zhuǎn)化和動物實驗，也能達到相同的降血糖效果。
靈芝對除草劑的抗性將靈芝接種于含不同濃度除草劑(PPT)的CYM平板上(0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml)，28℃培養(yǎng)14天，以菌絲生長被顯著抑制的最低除草劑濃度作為靈芝的抗性選擇壓力。
靈芝原生質(zhì)體的制備將100ml菌絲培養(yǎng)物用4層醫(yī)用紗布過濾，無菌水沖洗，無菌吸水紙吸干菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)移至15ml塑料螺口離心管中，加入1ml酶解液(1.5％溶壁酶，0.6M甘露醇，0.1MNa2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH5.6；液氮反復(fù)凍融3次滅菌后分裝于Effendorf管中，-20℃保存)，充分混勻后置37℃水浴中酶解，每隔15min將離心管顛倒幾次以促進原生質(zhì)體的釋放，顯微鏡下觀察有大量原生質(zhì)體釋放時結(jié)束反應(yīng)，加入2ml 0.6M甘露醇，混勻后倒入裝有0.5cm脫脂棉柱的10ml玻璃注射器內(nèi)過濾，濾液收集于Effendorf管中，4000rpm離心5min，棄上清，用1ml 0.6M甘露醇離心洗滌2次，將純化的原生質(zhì)體懸浮于100μl 0.6M甘露醇中。
靈芝原生質(zhì)體的再生將純化的原生質(zhì)體加入5ml CYM再生培養(yǎng)基(含0.6M甘露醇，1％低熔點瓊脂糖；熔化后保持37～40℃)，混勻，倒入用30ml CYM再生培養(yǎng)基(含1％瓊脂糖)鋪好的平板上，待上層培養(yǎng)基完全凝固后，將平板用封口膜封好，置28℃溫箱培養(yǎng)。
用于電擊轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pbinsK的大量提取與純化質(zhì)粒的大量提取將含有質(zhì)粒的E.coli DH5α接種于含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的100ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將菌體離心收集于50ml離心管中，加入5ml溶液I將菌體完全懸起，加入5ml溶液II，充分混勻，室溫放置10min，加入5ml溶液III，混勻，冰浴5min，12000rpm 4℃離心5min，取上清，加入16ml異丙醇，混勻，12000rpm離心5min，DNA沉淀用1.2ml雙蒸水溶解后平均分裝于2個Effendorf管中進行純化。
質(zhì)粒的純化分別取300μl 7.5M NH4Ac加入上述2個Effendorf管中，混勻，-20℃放置10min，12000rpm離心5min，取上清，CI抽提后加入600μl異丙醇，12000rpm離心5min，兩管沉淀合在一起，用250μl雙蒸水溶解，加入250μl 5M LiCl(預(yù)冷)，-20℃放置10min，12000rpm離心5min，取上清，加入1ml乙醇，混勻，12000rpm離心5min，沉淀用300μl雙蒸水溶解后加入300μl PEG溶液(13％PEG8000，1.6M NaCl)，混勻，12000rpm離心10min，沉淀300μl雙蒸水溶解后加入150μl 7.5M NH4AC，-20℃放置10min，12000rpm離心10min，取上清，加入1ml無水乙醇，12000rpm離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌后真空抽干，加入50μl無菌雙蒸水溶解，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的含量，將質(zhì)粒濃度調(diào)整至1μg/μl(保持無菌狀態(tài))，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 靈芝原生質(zhì)體的電擊轉(zhuǎn)化將1ml電擊緩沖液(0.6M甘露醇，10mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0)加入純化的原生質(zhì)體(107-108)，4000rpm離心5min，棄上清，將原生質(zhì)體重懸于200μl電擊緩沖液中，加入10μg質(zhì)粒DNA，混勻后轉(zhuǎn)入電擊杯，冰浴10min，在電壓500v、電容25μF、電阻400Ω的條件下施加一次電脈沖，冰浴10min，加入5ml CYM選擇性再生培養(yǎng)基(含0.6M甘露醇，20μg/ml除草劑，1％低熔點瓊脂糖；熔化后保持37～40℃)，混勻，倒入用30ml CYM選擇性再生培養(yǎng)基(含1％瓊脂糖)鋪好的平板上，待上層培養(yǎng)基完全凝固后，將平板用封口膜封好，置28℃培養(yǎng)。
另取部分純化的原生質(zhì)體(不加質(zhì)粒)，在CYM再生培養(yǎng)基上(不加除草劑)分別檢測電擊前與電擊后的原生質(zhì)體的再生率。
實施例5 PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體靈芝菌絲的培養(yǎng)同實施例4。
用于PEG介導(dǎo)法質(zhì)粒pbinsK的大量提取與純化同實施例4。
靈芝原生質(zhì)體的制備將100ml菌絲培養(yǎng)物用4層紗布過濾，無菌水沖洗，無菌吸水紙吸干菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)移至15ml塑料螺口離心管中，加入1ml酶解液(1.5％溶壁酶，0.6M甘露醇，0.1MNa2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH5.6；液氮凍融滅菌后分裝于Effendorf管中，-20℃保存)，充分混勻后置30℃水浴2h(每隔15min將離心管顛倒幾次以促進原生質(zhì)體的釋放)，加入2ml 0.6M甘露醇，混勻后倒入裝有0.5cm脫脂棉柱的10ml注射器內(nèi)過濾，濾液收集于Effendorf管中，4000rpm離心5min，棄上清，用1ml MTC緩沖液(10mM CaCl2，0.6M甘露醇，10mM Tris-HCl，pH7.5)離心洗滌2次，將原生質(zhì)體懸浮于100μl MTC緩沖液中。
PEG介導(dǎo)的靈芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化取10μg經(jīng)PEG純化的質(zhì)粒pbins或pbinsK加入100μl原生質(zhì)體懸液中，混勻，冰浴10min，加入20μl PEG溶液(60％PEG4000，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5)，混勻后冰浴20min，加入1ml PEG溶液，混勻后室溫靜置20min，加入5ml CYM選擇性再生培養(yǎng)基(含0.6M甘露醇，40μg/ml除草劑，1％低熔點瓊脂糖；熔化后保持37～40℃)，混勻，倒入用30ml CYM選擇性再生培養(yǎng)基(含1％瓊脂糖)鋪好的平板上，待上層培養(yǎng)基完全凝固后，將平板用封口膜封好，置28℃培養(yǎng)。
實施例6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝菌絲靈芝菌絲的培養(yǎng)將不同種類活化好的靈芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方靈芝Ganoderma australe、薄蓋靈芝Ganoderma capense)接種于裝有玻璃珠的500ml液體CYM培養(yǎng)基中，與28℃靜止培養(yǎng)4～5天，每天搖瓶1～2次以打散菌絲，使得菌絲始終保持極小的不規(guī)則顆粒狀。菌絲培養(yǎng)過程可以發(fā)現(xiàn)，紫芝和薄蓋靈芝生長要快于赤芝和南方靈芝，此外樹舌(G.applanatum)及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金針姑、猴頭等，以及藥用真菌蟲草菌(Cordyceps sinensis)等也同樣可以按照以下的實施例進行基因遺傳轉(zhuǎn)化和動物實驗，也能達到相同的降血糖效果。
含有p1300-GinsK質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌株的培養(yǎng)將含有p1300-GinsK質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404接種到LB(Km100μg/ml+Sm100μg/ml+Rif50μg/ml)液體培養(yǎng)基中，于28℃振蕩(250r/min)培養(yǎng)過夜，第2天加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度為200μmol/L。農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD660為0.6～0.8。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝菌絲在超凈臺中用4層醫(yī)用紗布過濾培養(yǎng)好的靈芝菌絲，并用無菌水洗滌4～5次，用1ml無菌水懸浮。取100μl懸浮的靈芝菌絲與100μl活化好的農(nóng)桿菌LBA4404(p1300-GinsK)混勻，涂布在CYM固體培養(yǎng)基(1％瓊脂糖)上于28℃共培養(yǎng)2天。2天后在培養(yǎng)基上倒入10ml篩選培養(yǎng)基(CYM固體培養(yǎng)基+PPT20μg/ml+Cb500μg/ml)，于28℃繼續(xù)培養(yǎng)，大約7～10天后有白色的再生菌落出現(xiàn)。
實施例7 轉(zhuǎn)基因靈芝的鑒定及人胰島素原類似物含量的測定轉(zhuǎn)基因靈芝總DNA的制備用雙層紗布過濾不同種類靈芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方靈芝Ganoderma australe、薄蓋靈芝Ganoderma capense)的菌絲，將收集到的菌絲用蒸餾水洗滌、濾紙吸干。取0.1g(濕重)菌絲置于1.5ml的effendorf管中，液氮冷凍數(shù)秒后將菌絲在研缽中充分研碎，加入800μl DNA提取緩沖液(50mM EDTA，0.5M NaCl，1.5％SDS，1％(v/v)β-巰基乙醇，0.1M Tris-HCl，pH8.0)，充分混勻后置65℃水浴15min，加入250μl 5M KAc，-20℃冰箱中放置5min，12000rpm離心5min，上清液轉(zhuǎn)移后加入300μl CI，混勻后12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清，加入600μl異丙醇，混勻后12000rpm離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌后置室溫下晾干，用50μl無菌雙蒸水溶解備用。
轉(zhuǎn)基因靈芝總DNA的PCR鑒定PCR擴增反應(yīng)以靈芝的總DNA為模板，以含有目的基因的質(zhì)粒為正對照，無菌去離子水為負(fù)對照，在PE2000型PCR擴增儀(Perkin Elmer Co.)上進行。反應(yīng)體系為25μl，在200μl無菌PCR專用管中依次加入無菌雙蒸水 19μl10×PCR緩沖液(含15mM MgCl2) 2.5μl上游引物(10μM)GPDIns_5’或InsK 5’1μl下游引物(10μM)GPDIns_3’或Ins_new 3’ 1μldNTP(10mM) 0.3μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl模板 1μl擴增條件為94℃預(yù)變性10min，30個循環(huán)(94℃60s，50℃50s，72℃50s)后72℃延伸8min。如擴增效果不好，可采用熱啟動PCR，即在94℃預(yù)變性10min后再在每管中加入Taq DNA聚合酶。
用于檢測Ins基因的引物InsK 5’，編號e5715，21bp，序列為5’-GTT AAC CAA CAC CTT TGC GGA T-3’
Ins_new 3’，編號e11582，22bp，序列為5’-GAG AGC AGA TAG AGG TGC AGC A-3′用于檢測GPD-InsK這段DNA的引物GPDIns_5’，編號97831，22bp，序列為5’-ACC AAG AAA GCT CGT GAA GAG G-3’GPDIns_3’，編號97832，21bp，序列為5’-CCG CAA ACA AGG TAA AGA GCC-3’轉(zhuǎn)基因靈芝總蛋白的提取將轉(zhuǎn)基因靈芝與未轉(zhuǎn)基因的對照接種于CYM液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上28℃培養(yǎng)7d，取少量菌絲(約0.05g鮮重)放于研缽中，加液氮冷凍數(shù)秒后將其充分研碎，加入500μl提取緩沖液(0.1M PBS，0.001％NaN3，0.00029％PMSF)，混勻后12000rpm離心5min，取上清用于檢測。
轉(zhuǎn)基因靈芝Western點雜交(1)、將樣品提取液用TNT buffer(TNT 100mmol/L Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，0.5％Tween 20，pH8.0)緩沖液稀釋10倍。
(2)、取未處理的尼龍膜，切去左上角標(biāo)記，放在玻璃板上一塊watman吸水紙上。
(3)、取轉(zhuǎn)基因靈芝及未轉(zhuǎn)基因靈芝的總蛋白提取液(未稀釋和稀釋10倍)各4μl，輕輕點在膜上，記下相應(yīng)位置，取標(biāo)樣胰島素4μl，1mg/ml點于對應(yīng)位置。
(4)、在空氣中室溫晾干尼龍膜。
(5)、將干膜放入約10ml TNT buffer中，清洗10min(2次，換液一次)。
(6)、將膜轉(zhuǎn)入含1％BSA的TNT buffer中，室溫封閉1小時，輕輕搖動。
(7)、封閉后，用TNT buffer漂洗2次，5min/次(室溫輕搖)。
(8)、加入用TNT buffer稀釋的一抗(1∶10000)10ml，室溫輕搖1小時。
(9)、用TNT buffer洗三次，每次10min。
(10)、加入10mlTNT buffer稀釋的二抗(1∶2000)10ml，室溫1小時。
(11)、用TNT洗3次，10min/次。
(12)、用AP buffer(0.1M NaCl，0.05M MgCl2，0.1M Tris-HCl，pH9.5)平衡10min后，加入20ml含顯色劑NBT(133μl)/BCIP(67μl)的顯色緩沖液，室溫暗處顯色10min～數(shù)小時。
(13)、用TNT buffer清洗5min，終止反應(yīng)，用蒸餾水清泡5min后取出晾干，掃描。
轉(zhuǎn)基因靈芝的ELISA測定用于計算人胰島素原類似物含量溶液的準(zhǔn)備1)包被液50mM Na2CO3-NaHCO3，pH9.6
2)洗滌液0.05％Tween-20，0.01M磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)，pH7.43)封閉液1％牛血清白蛋白(BSA)，洗滌液4)一抗溶液豚鼠抗人胰島素抗體(干粉制劑用10ml洗滌液溶解后直接應(yīng)用)或兔抗人胰島素抗血清(抗血清用洗滌液稀釋10000倍后應(yīng)用)5)二抗溶液羊抗兔IgG-HRP或羊抗豚鼠IgG-HRP，根據(jù)對應(yīng)的一抗加相應(yīng)的二抗，用2000倍的洗滌液稀釋后應(yīng)用6)TMB顯色應(yīng)用液10ml PBS(0.1M，pH6.0)，100μl TMB儲存液(60mg TMB粉末溶于1ml DMSO中，避光保存)，15μl H2O2(30％)7)終止液2M H2SO4ELISA檢測的具體步驟為1)胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的包被在反應(yīng)孔中加入100μl的用包被液配置的不同濃度梯度的胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.5μg/ml，0.8μg/ml，1.0μg/ml)，同時在陰性對照中加入100μl包被液。
2)待測樣品的包被在反應(yīng)孔中加入90μl包被液，同時加入10μl待測樣品。封上Pala Film膜后置4℃過夜或37℃恒溫箱溫浴1h。
2)封閉棄去孔內(nèi)液體，每孔中加200μl洗滌液，靜置3min后棄去，重復(fù)3次，扣在濾紙上吸去水分并用力甩干。每孔加入200μl封閉液，加膜后置37℃恒溫箱1h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次。
3)加入一抗取100μl已稀釋好的一抗溶液加于孔中，加膜后置37℃恒溫箱1h，用洗滌液洗滌3次。
4)加入二抗取100μl已稀釋好的二抗溶液加于孔中，加膜后置37℃恒溫箱1h，用洗滌液洗滌3次，用ddH2O洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分并用力甩干。
5)顯色每孔加入100μl TMB顯色應(yīng)用液，等待3～5min至反應(yīng)液變藍后迅速加入50μl終止液終止反應(yīng)，ELISA板放入BioRad酶標(biāo)儀中讀數(shù)并用熱敏紙打出結(jié)果。
6)人胰島素原類似物含量的計算根據(jù)胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的A450nm值及對應(yīng)的濃度在Excel 2000中自動生成平滑線散點圖，并作出線性回歸直線和對應(yīng)的等式，根據(jù)等式就可以算出不同轉(zhuǎn)基因靈芝株系的人胰島素原類似物含量。
轉(zhuǎn)基因靈芝總蛋白含量的測定配制考馬斯亮藍試劑(0.01％考馬斯亮藍G-250，4.7％乙醇，8.5％磷酸)，用水配制不同濃度的BSA梯度溶液(100μg/ml，200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，2000μg/ml)。取Eppendorf管均加入0.5ml考馬斯亮藍試劑，然后每管中分別加入不同梯度的BSA溶液或轉(zhuǎn)基因靈芝總蛋白提取液，在紫外分光光度計上分別讀出每個樣品的A595nm值，將A595nm值與對應(yīng)的濃度在Excel 2000中自動生成平滑線散點圖，并作出線性回歸直線和對應(yīng)的等式，根據(jù)等式就可以算出不同轉(zhuǎn)基因靈芝株系的總蛋白含量。
表3胰島素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)的ELISA測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品A450值(y)與胰島素濃度(x)的線性回歸公式y(tǒng)＝0.165x-0.0192(R2＝0.9845)，根據(jù)該公式算出測定樣品的人胰島素含量。
表4不同轉(zhuǎn)基因靈芝提取液的A450nm值及通過公式算出的濃度

備注1、轉(zhuǎn)基因靈芝代入公式的的y值＝測定值-未轉(zhuǎn)基因靈芝背景A450值，代入的公式為y＝0.165x-0.0192(R2＝0.9845)2、因為ELISA加樣時是10ul樣品加入90ul包被液中，因此抽提液中目的蛋白的濃度為公式算出值的10倍。
3、另有轉(zhuǎn)基因靈芝GinsK8～15為除草劑(PPT)篩選陽性和PCR鑒定陽性，但尚未進行ELISA檢測。
表5轉(zhuǎn)基因靈芝抽提總蛋白濃度測定

在Excel 200中輸入測定數(shù)據(jù)得出公式y(tǒng)＝0.0015x+0.494(R2＝0.9398)表6人胰島素原類似物在轉(zhuǎn)基因靈芝中含量比較

備注用于抽提的靈芝鮮重為0.05g。
實施例8 靈芝子實體的培養(yǎng)及孢子粉的制備轉(zhuǎn)基因靈芝菌株接種于含木屑、麥麩等成分的固體培養(yǎng)基上。子實體培養(yǎng)基采用通用的木屑加麥麩，即三份體積的細木屑加一份體積的麥麩，加水(含水量80％)，混勻，裝瓶(或裝于耐高溫的塑料袋內(nèi))，滅菌。接種后置28℃培養(yǎng)。待菌絲長滿后置28℃高濕(相對濕度80-90％以上)條件下使其分化出子實體，長出菌傘。隨著菌傘的成熟過程，形成大量靈芝孢子粉。在超凈工作臺中收集靈芝孢子粉。
光鏡下觀察可以看到孢子具有堅固的孢壁，并有萌發(fā)孔的結(jié)構(gòu)。利用模擬胃液和模擬腸液對孢子粉進行體外降解實驗，樣品分別加入等量模擬胃液和腸液后于37℃分別消化10min、30min及60min，然后液氮研磨使蛋白全部進入提取液(0.01M磷酸緩沖液)中，取15μl樣品進行SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未消化的陽平相比，10min、30min及60min蛋白條帶無明顯差別。這個結(jié)果說明靈芝孢子的堅硬外壁有效防止了胃部和腸道中各種消化酶類對所含胰島素蛋白的降解作用，從而使得人胰島素能在腸道內(nèi)被大量吸收，進而進入血液發(fā)揮降血糖的功效。此外，孢子粉與靈芝菌絲相比，其總蛋白的含量與菌絲相當(dāng)，含有的人胰島素量亦同菌絲相當(dāng)。
模擬胃液成分0.2％胃蛋白酶pepsin，0.9％NaCl，pH1.2模擬腸液成分0.2％胰酶trpsin，0.9％NaCl，pH8.5實施例9 高血糖大鼠灌喂轉(zhuǎn)基因靈芝降血糖實驗一、實驗設(shè)計挑選48只體重均為250克左右的雄性大鼠(SD品系)，按照60mg/kg的劑量腹腔注射鏈尿佐菌素(streptozocin，STZ)來制作高血糖大鼠模型，約7天后大部分大鼠窩內(nèi)變得比較濕潤(血糖升高后導(dǎo)致試驗動物多飲多尿)，用強生穩(wěn)捷型血糖儀配合強生One Touch血糖試紙測定大鼠空腹血糖(斷食8小時)，挑選血糖值14mmol/L以上的大鼠作為造模成功的高血糖大鼠模型。挑選其中的30只大鼠按照血糖值由低到高排序并隨機分為三組，每組10只，使得低、中、高血糖的大鼠比較均勻地分入三組中。由于每只大鼠通過在毛上涂抹黃色的苦味酸來進行編號識別，為了容易識別，動物的編號并不是連續(xù)的，而是按照容易識別的編號系統(tǒng)進行。
為了驗證轉(zhuǎn)基因靈芝的血糖較低功效是由于轉(zhuǎn)入的人胰島素原類似物表達所產(chǎn)生的，而非靈芝本身的功效，因此除了做灌喂生理鹽水為對照，還以灌喂未轉(zhuǎn)基因的普通靈芝為對照。
二、實驗材料1實驗試劑無菌生理鹽水(0.9％NaCl)購自北京雙鶴藥業(yè)，鏈尿佐菌素(streptozocin，STZ)由實驗委托單位北大醫(yī)學(xué)部實驗動物中心購買。
2實驗動物及飼料雄性SD大鼠(平均質(zhì)量為250克)及專用飼料由北大醫(yī)學(xué)部實驗動物中心從北京維通利華實驗動物公司購買。
3實驗器材及儀器血糖儀及試紙血糖儀為購自強生公司的穩(wěn)捷型血糖儀，搭配試紙為強生One Touch血糖試紙。
用于處理靈芝菌球的榨汁機榨汁機為購自家樂福超市的西貝樂多功能食品加工機。
灌喂針灌喂所有的注射器為醫(yī)用注射器，灌喂針為頭部圓形內(nèi)徑約0.8mm，長8cm的鋼針，由北大醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。
三、實驗方法1、轉(zhuǎn)基因靈芝灌喂樣品的制備及灌喂(1)將不同轉(zhuǎn)基因靈芝(赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方靈芝Ganoderma australe、薄蓋靈芝Ganoderma capense)菌球(CYM培養(yǎng)基中搖成菌球)用紗布過濾并洗去培養(yǎng)基后擠去多余水分(約80克)，并加入1/5的生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，用家用榨汁機旋轉(zhuǎn)勻漿10秒種，使得菌球勻漿成含有較小顆粒(直徑不大于0.5mm)的懸浮液，馬上置于冰浴中直至灌喂前取出。在超凈工作臺中收集轉(zhuǎn)基因靈芝孢子，用1∶1比例的0.9％NaCl溶液懸浮，取其中的6ml用于灌喂每只高血糖大鼠。此外樹舌(G.applanatum)及多孔菌科的其它食用菌如香菇、蘑菇、平菇、草菇、金針姑、猴頭等，以及藥用真菌蟲草菌(Cordyceps sinensis)等也同樣可以按照實施例中提到的基因遺傳轉(zhuǎn)化、菌絲及子實體培養(yǎng)、孢子收集和動物灌喂實驗，也能達到相同的降血糖效果。
(2)灌喂前測定每組各只大鼠的血糖值(剪大鼠尾部采血，每次10ul的血量能滿足血糖儀的要求)；(3)用帶灌喂針(孔徑0.8mm，長8cm，便于能伸到大鼠胃部灌喂，針頭為圓形，不對大鼠食道及胃造成損傷)的醫(yī)用注射器吸取6ml生理鹽水灌喂高血糖大鼠，另分別取6ml的處理后的轉(zhuǎn)基因靈芝和未轉(zhuǎn)基因靈芝懸浮液灌喂對應(yīng)的實驗組。
2、血糖測定及數(shù)據(jù)分析分別于灌喂前、灌喂4小時后和灌喂20小時后測定每組大鼠的血糖值。采用Excel 2000中的Student’s t-TEST統(tǒng)計功能來檢驗不同實驗組及對照組灌喂4小時后與灌喂前兩組大鼠的血糖值有無顯著性變化。
表7未轉(zhuǎn)基因靈芝組大鼠血糖變化情況

備注血糖值單位為mmol/L，血糖值測定的誤差為±10％。
表8轉(zhuǎn)基因靈芝組大鼠血糖變化情況

備注血糖值單位為mmol/L，血糖值測定的誤差為±10％。
六、專利菌種說明此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關(guān)村，該微生物分類名稱為靈芝(Ganoderma lucidum)，保藏代號為GinsK3，保藏編號為CGMCC NO.1708，保藏日期為2006年5月10日。
總之，本發(fā)明人工合成了一個新的人胰島素原類似物基因(InsK)，并采用在食用真菌中組成型高效表達的GPD啟動子驅(qū)動，構(gòu)建了適合電擊法和PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體的表達載體pbinsK和適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化靈芝菌絲的表達載體p1300-GinsK，獲得了一批轉(zhuǎn)基因靈芝株系，PCR檢測表明目的基因已整合到靈芝基因組中，ELISA檢測表明人胰島素原類似物在靈芝中的表達量達到105.0μg/g～174.8μg/g靈芝鮮重的水平。高血糖大鼠灌喂實驗表明轉(zhuǎn)基因靈芝與未轉(zhuǎn)基因靈芝相比顯著降低了大鼠的血糖水平，兩組大鼠之間具有極顯著性差異(P＜0.0002)。動物降血糖實驗說明轉(zhuǎn)基因靈芝能有效降低血糖水平，可以作為一種口服胰島素用于糖尿病的血糖降低調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)基因靈芝培養(yǎng)與普通靈芝一樣，能夠大規(guī)模放大生產(chǎn)。
序列表<110>林忠平<120>利用轉(zhuǎn)基因靈芝表達人胰島素降血糖的方法<140>
<141>
<160>1<210>1<211>195<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(6)...(194)<400>1gatccatgtt cgttaaccaa cacctttgcg gatctcacct tgttgaggct ctttaccttg 60tttgcggaga gaggggattc ttctacaccc caaagaccgg aggaccatct ggaggaggaa 120tcgttgagca atgctgcacc tctatctgct ctctttacca acttgagaac tactgcaaca 180aggacgagct ttaag 19權(quán)利要求
1.一種利用轉(zhuǎn)基因靈芝表達人胰島素來降低糖尿病患者血糖水平的方法，其特征在于人工合成人胰島素原類似物基因，選用真菌中強表達的GPD啟動子，置于適合靈芝轉(zhuǎn)化的載體中，通過電擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化靈芝，獲得表達人胰島素的靈芝，并通過口服灌喂高血糖大鼠證明能有效降低血糖水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該人胰島素原類似物基因中的堿基用植物偏愛的密碼子替代，所述胰島素具有類似天然胰島素的三維結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該人胰島素原類似物基因在所翻譯蛋白的C端添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因靈芝中人胰島素原類似物的含量為105.0μg/g～174.8μg/g靈芝鮮重的水平，占靈芝可溶總蛋白的4.40％～10.40％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于對高血糖大鼠灌喂權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因靈芝菌絲或孢子后，大鼠的血糖水平大幅度降低，最大幅度可達64％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過電擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的宿主選自赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma japonicum、南方靈芝Ganoderma australe、薄蓋靈芝Ganoderma capense、樹舌Ganoderma applanatum及多孔菌科的其它食用菌香菇、蘑菇、平菇、草菇、金針姑、猴頭和藥用真菌蟲草菌Cordyceps sinensis中的任何一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于電擊法或PEG介導(dǎo)法所用的表達載體為附圖1所述的pbinsK。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法所用的表達載體為附圖2所述的p1300-GinsK。
9.一種藥品，是利用權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的能表達人胰島素原類似物的靈芝菌絲、子實體及孢子。
10.一種靈芝表達載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的人工合成的人胰島素原類似物基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的靈芝表達載體，其特征在于該靈芝表達載體具有附圖1所述pbinsK的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的靈芝表達載體，其特征在于該靈芝表達載體具有附圖2所述p1300-GinsK的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明人工合成了人胰島素原類似物基因，并在編碼蛋白的C端添加了KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列以便蛋白更多地積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中從而防止細胞中酶的降解。選用高等真菌中高效表達的GPD啟動子驅(qū)動目的基因，并置于適合靈芝轉(zhuǎn)化的載體中，通過電擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化靈芝。ELISA檢測表明轉(zhuǎn)基因靈芝中人胰島素原類似物的含量為105.0μg/g～174.8μg/g靈芝鮮重的水平，占靈芝可溶總蛋白的4.40％～10.40％。將表達人胰島素的靈芝口服灌喂鏈尿霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型證明能有效降低血糖，從而提供了利用靈芝生物反應(yīng)器降血糖的方法。
文檔編號A61K36/074GK1879891SQ20061007884
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者林忠平, 倪挺, 胡鳶雷, 孫麗, 陳溪 申請人:林忠平