專利名稱：重組紅火蟻致敏毒素蛋白及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和昆蟲學(xué)領(lǐng)域。更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及重組紅火蟻(Solenopsisinvicta Buren，又稱為Red imported fire ant，RIFA)致敏毒素蛋白及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
紅火蟻(Solenopsis invicta Buren，又稱為Red imported fire ant，RIFA)，是繼SARS、禽流感后在我國(guó)發(fā)生的一種新的有嚴(yán)重危害的侵入性外來(lái)生物。紅火蟻原產(chǎn)于南美洲的巴西、阿根廷、巴拉圭和巴拿馬運(yùn)河一帶，具有很強(qiáng)的入侵性，其繁殖、適應(yīng)能力非常強(qiáng)。目前美國(guó)南部、澳大利亞和新西蘭的部分地區(qū)以及我國(guó)臺(tái)灣省等都已成為紅火蟻的主要發(fā)生區(qū)域。美國(guó)每年因紅火蟻引起的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)10億美元，同時(shí)由于紅火蟻的攻擊性很強(qiáng)，并具有厲害的螫刺，能迅速攻擊任何騷擾其巢穴的物體，人被紅火蟻叮咬后，皮膚出現(xiàn)紅斑、紅腫、痛癢、高燒、休克，一些體質(zhì)敏感的人，嚴(yán)重者會(huì)死亡，美國(guó)已死亡100多人。由于其能造成重大經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境影響，已經(jīng)被國(guó)際上列為最具入侵性和破壞性的百種外來(lái)有害生物之一(deShazo RD，Griffing C，Kwan TH，et al.Dermal hypersensitivity reactions to imported fireants.J Allergy Clin Immunol 1984；74841-847；Stafford CT.Hypersensitivity to fire ant venom.Ann Allergy Asthma Immunol 1996；7787-95)。2004年9月我國(guó)的廣東省吳川市，2005年廣東省珠海市、惠州市、深圳市、湛江、張家界以及香港部分地區(qū)都發(fā)生紅火蟻疫情，造成了人員傷害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失及社會(huì)的恐慌。
紅火蟻屬于膜翅目(Hymenoptera)、蟻科(Formicidae)、切葉蟻亞科(在我國(guó)的臺(tái)灣地區(qū)稱為家蟻亞科)(Myrmicinae)、火蟻屬(SolenopsisWestwood)。蟻科昆蟲俗稱螞蟻，屬于社會(huì)性昆蟲，有多個(gè)品級(jí)，即具有生殖能力的雌蟻、雄蟻和工蟻(發(fā)育不全無(wú)生殖能力的雌蟻)。其中的工蟻又可分為一至多型，多型時(shí)包括大型工蟻(俗稱兵蟻)和小型工蟻(工蟻)。蟻科的分類至今仍以工蟻尤其是兵蟻的描述為主?；鹣亴俟は佊懈贡Y(jié)2個(gè)；觸角一般10節(jié)，末2節(jié)成錘棒狀；唇基兩側(cè)有縱脊向前延伸成齒。雌蟻和雄蟻有單眼，雌蟻觸角一般11節(jié)，雄蟻觸角一般12節(jié)。并胸腹節(jié)不具刺或齒。
紅火蟻在我國(guó)是第一次出現(xiàn)的新的有害物種，危害大，但對(duì)其了解甚少，因此對(duì)其遺傳學(xué)及致病機(jī)制等進(jìn)行深入系統(tǒng)研究，并在此基礎(chǔ)上做好診斷和防治工作是非常必要和十分迫切的。
紅火蟻的殺滅以物理方法(例如，參見，CN1685814A)和化學(xué)藥品(例如，參見，CN1692729A，WO2005070210A1、US5798311A和JP6345751A等)為主。目前，紅火蟻過敏反應(yīng)的診斷和治療主要采用的是全蟻提取物和純化毒液，不過由于全蟻提取物毒素蛋白含量少，毒素蛋白僅占全蟻毒液的5％，不易大量制備獲得，而且制備過程比較復(fù)雜和不安全。因此，本領(lǐng)域迫切需要通過基因工程方法開發(fā)出紅火蟻的特異性重組毒素蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供重組表達(dá)的紅火蟻特異性毒素蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供所述紅火蟻特異性毒素蛋白的制備方法和用途。
紅火蟻叮咬人類后出現(xiàn)致敏性休克甚至死亡主要是由其毒液引起的。紅火蟻的毒液在組成上比較獨(dú)特，主要由水不溶性的生物堿和痕量的蛋白質(zhì)組成。[10]Hoffman等1988年從紅火蟻毒液中分離純化出4種蛋白質(zhì)，即Sol i 1、2、3和4，用火蟻毒素過敏病人的血清對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)，所有4種蛋白均具有明顯的致敏活性。Freeman等(1992)分析了利用紅火蟻全蟻提取物對(duì)紅火蟻過敏進(jìn)行免疫治療的效果，表明經(jīng)過治療的病人再次受到叮咬后只有局部的反應(yīng)。[8]盡管紅火蟻4種致敏蛋白的IgE反應(yīng)彼此無(wú)相關(guān)性。
本發(fā)明人利用大腸桿菌成功地表達(dá)了紅火蟻毒素蛋白Sol i 1和Sol i4。此外，由于Sol i1的全長(zhǎng)表達(dá)產(chǎn)物為包函體，有可能影響蛋白質(zhì)的活性，因此此外又表達(dá)了包含Sol i 1主要功能區(qū)的多肽片段Sol i 1-1，該表達(dá)產(chǎn)物是可溶性的。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離的soli1蛋白及其編碼的多核苷酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該蛋白具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了soli1蛋白的片段多肽soli1-1及其編碼的多核苷酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多肽具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種分離的soli4蛋白及其編碼的多核苷酸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該蛋白具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該蛋白具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
另外，本發(fā)明還提供了含有上述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明還提供了重組紅火蟻特異性毒素蛋白的制備方法，該方法包含(a)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增出紅火蟻毒素蛋白基因；(b)將擴(kuò)增的基因連接入表達(dá)載體；(c)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化含有步驟(b)所得載體的宿主細(xì)胞；(d)從培養(yǎng)物中分離出重組紅火蟻特異性毒素蛋白。
另一方面，本發(fā)明還提供了可用于防治紅火蟻的藥物組合物，其中含有本發(fā)明所述的重組紅火蟻毒素蛋白soli1、soli1-1或soli4，以及藥物學(xué)上可接受的載體。
試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明所述的重組紅火蟻毒素蛋白soli1、soli1-1或soli4均具有良好的生物學(xué)活性。用本發(fā)明所述的重組紅火蟻毒素蛋白soli1、soli1-1或soli4對(duì)受試者免疫接種后，當(dāng)再次接種純化的致敏毒素蛋白時(shí)未出現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng)，表明本發(fā)明提供的重組紅火蟻毒素蛋白具有良好的免疫保護(hù)作用。
另一方面，本發(fā)明還提供了重組紅火蟻毒素蛋白soli1、soli1-1或soli4在制備用于預(yù)防和/治療紅火蟻引發(fā)疾病的藥物中的用途。


圖1圖示的是表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。其中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道1為.BL21(DE3)菌體；泳道2為空白質(zhì)粒pET43.1a轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；泳道3為重組質(zhì)粒pET43.1a-soli1(全長(zhǎng))轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；泳道4為重組質(zhì)粒pET43.1a-soli1(部分)轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；泳道5為重組質(zhì)粒pET43.1a-soli4轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。
圖2圖示的是注射本發(fā)明重組毒素蛋白后的兔體反應(yīng)。其中圖2A圖示的是接種紅火蟻毒素蛋白soli1-1后的兔體反應(yīng)；圖2B圖示的是接種紅火蟻毒素蛋白soli1-1后的耳部瘀斑；圖2C圖示的是接種紅火蟻毒素蛋白soli1-1后的皮膚反應(yīng)；圖2D圖示的是接種紅火蟻毒素蛋白soli4后的皮膚反應(yīng)；圖2E圖示的是接種紅火蟻毒素蛋白soli1后的皮膚反應(yīng)；圖2F圖示的是接種NUSA和PBS后的皮膚反應(yīng)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而絕不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說(shuō)明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請(qǐng)中引用的任一專利、專利申請(qǐng)和出版物在此引入作為參考。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常采用常規(guī)條件例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。
實(shí)施例試驗(yàn)材料試劑Ex Taq酶、AMV酶、RNAase抑制劑、質(zhì)粒純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA LigationKit、DNA Marker DL2000、EcoRI、XhoI均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RNA mini Kit試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；Ni Sepharose High Performance購(gòu)白Amersham Biosciences公司。
菌株和載體載體pET43.1a以及菌株BL21(DE3)和DH5α均購(gòu)自Invitrogen公司。
試驗(yàn)用紅火蟻由深圳動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫局提供。
實(shí)施例1紅火蟻毒素蛋白I、IV基因的獲得1.引物的設(shè)計(jì)和合成1.1基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和合成參照Genbank紅火蟻核苷酸序列，共設(shè)計(jì)4條測(cè)序引物，引物由寶生物(大連)工程有限公司合成，引物序列如下表1紅火蟻毒素蛋白I、IV基因特異擴(kuò)增引物的序列和長(zhǎng)度

1.2表達(dá)引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)測(cè)序的結(jié)果，共設(shè)計(jì)6條表達(dá)引物，引物由寶生物(大連)工程有限公司合成，引物序列如下表2紅火蟻毒素蛋白I、IV克隆引物的序列和長(zhǎng)度

2.紅火蟻毒素蛋白I、IV基因的PCR擴(kuò)增2.1 RNA的提取紅火蟻的預(yù)處理，將一定數(shù)量的成年紅火蟻工蟻全蟻在液氮中充分研磨，然后用PBS沖懸，1000rpm離心5min收集上清，參照QIAGEN公司的RNA mini Kit試劑盒說(shuō)明書操作提取紅火蟻的總RNA。
2.2 RT-PCR取制備好的總RNA 10.5μL，加一擴(kuò)反向引物(ES1(反向)或ES4(反向))1μL，65℃水浴10min，立即冰浴5min，加5×RT-buffer 4μL，dNTP 2μL，AMV 2μL，RNasin 0.5μL，42℃1h，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存。
2.3 PCR擴(kuò)增10×PCR buffer 5μL，Mg2+3μL，dNTP 4μL，上游引物(ES1(正向)或ES4(正向))1μL，下游引物(ES1(反向)或ES4(反向))1μL，反轉(zhuǎn)錄模板10μl，Taq酶0.5μL，水25.5μL，總體積50μL，短時(shí)離心充分混勻。反應(yīng)條件95℃，5min；95℃，60s；50，1min；72℃，1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。
2.4 nPCR10×PCR buffer 5μL，Mg2+3μL，dNTP 4μL，二次PCR上游引物1μL(E-ES1(正向)、E-ES1-1(正向)或E-ES4(正向))，二次PCR下游下游引物1μL(E-ES1(反向)、E-ES1-1(反向)或E-ES4(反向)，上述一擴(kuò)產(chǎn)物soli1(全長(zhǎng))基因、soli1(部分)基因用引物ES1(正向)/ES1(反向)擴(kuò)增產(chǎn)物，soli4基因用引物ES4(正向)/ES4(反向)擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，Taq酶0.5μL，水33.5μL，總體積50μL，短時(shí)離心充分混勻。反應(yīng)條件95℃，5min；95℃，60s；55，30min；72℃，1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。
2.3目的基因的連接將nPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳純化回收，EcoRI和XhoI雙酶切純化回收產(chǎn)物后再次瓊脂糖凝膠電泳純化回收，取酶切后的soli1基因或soli4基因6μL，EcoR I和Xho I雙酶切后回收的pET43.1a 2μL，10×T4DNA Ligase buffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL，總體積10μL，16℃連接過夜，構(gòu)建出含soli1基因、soli1-1基因或soli4基因的重組質(zhì)粒pET43.1a-soli1、pET43.1a-soli1-1和pET43.1a-soli4。
2.4陽(yáng)性克隆的鑒定將上述連接產(chǎn)物pET43.1a-soli1、pET43.1a-soli1-1和pET43.1a-soli4分別全量轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，Amp+抗性篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR和EcoRI、XhoI雙酶切鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組克隆送公司測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果表明soli1、soli1-1和soli4分別具有SEQ ID NO1、2和3所示的核苷酸序列。
實(shí)施例3soli1和soli4重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)分別挑取含soli1和soli4的陽(yáng)性克隆接種于3mL含100μg/mL氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，取500μL接種于50mL 2×YT培養(yǎng)基中于，37℃振搖培養(yǎng)至OD600＝0.6，加IPTG至終濃度為1.5mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)后第3和第4小時(shí)收菌，同時(shí)培養(yǎng)誘導(dǎo)含pET43.1a的受體菌作為對(duì)照。
收取菌液，離心后棄上清，用PBS液懸浮后加入等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液于沸水中煮10min作為加樣的樣品。積層膠濃度為5％，分離膠濃度為12％，每個(gè)加樣孔上樣20μL；樣品在積層膠中采用80V的電壓，樣品在分離膠中采用120V的電壓，電泳4～6h后染色、在乙醇-冰醋酸中脫色。
將預(yù)先在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡1h的濾紙、海綿、NC膜按一層海綿、三層濾紙、凝膠、NC膜、三層濾紙、一層海綿依次放入塑料夾中后以180mA轉(zhuǎn)移3h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，剪下Marker與一個(gè)泳道，氨基黑染色觀察轉(zhuǎn)移的效果。NC膜用封閉液浸泡過夜，用PBST洗滌3次，加入組氨酸單抗37℃結(jié)合3h后用PBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗小鼠二抗37℃結(jié)合1h PBST洗滌3次，顯色。
SDS-PAGE凝膠電泳的結(jié)果如圖1所示，pET43.1a-soli1和pET43.1a-soli4轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在約62kDa、74.1kDa、99.7kDa、76.4kDa位置出現(xiàn)額外條帶，與預(yù)測(cè)的表達(dá)的重組融合蛋白大小相符，由此可見構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌經(jīng)誘導(dǎo)后能表達(dá)紅火蟻致敏毒素蛋白soli 1和soli 4及soli 1的多肽片段soli 1-1。
表達(dá)重組蛋白的Western blot分析結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白均能與組氨酸單抗發(fā)生特異性的反應(yīng)。
實(shí)施例4重組蛋白soli 1、soli 1-1和soli 4的純化本發(fā)明重組表達(dá)的soli1為包涵體形式，而soli 1-1和soli 4為可溶蛋白形式，本實(shí)施例中分別采用可溶蛋白純化方法和包涵體純化方法進(jìn)行純化。
4.1可溶蛋白的純化收獲重組表達(dá)soli 1-1和soli 4的菌體懸于1/10體積20mM Tris(pH7.0)，超聲破碎，使超聲時(shí)間累積40分鐘(工作時(shí)間2s；間隙時(shí)間2s；工作次數(shù)90；循環(huán)次數(shù)6；功率300HZ)后4℃15000rpm離心30分鐘，收集上清，再離心再收集上清，過濾，做為樣品。用5倍體積的超純水洗滌柱子，用5-10倍柱子體積的PBS平衡。加預(yù)處理的樣品，重復(fù)三次上樣。用洗滌緩沖液(20mM Tris，0.5M NaCl，15mM咪唑，pH7.0)洗滌，考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)是否洗滌完全，直到無(wú)雜蛋白為止。用洗脫緩沖液(20mM Tris，0.5M NaCl，100mM咪唑，pH7.0)溶解洗脫。考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)是否洗脫完全。洗脫產(chǎn)物濃縮至體積為0.5-1.0ml，將濃縮液移至一無(wú)菌離心管中，4℃保存。
4.2包函體的純化收獲重組表達(dá)soli 1的菌體懸于40ml裂解緩沖液(10mM Tris PH7.0，150mM NaCl，10mM EDTA，10％甘油，2mM DTT(二硫蘇糖醇)，0.5mM PMSF，400μg/ml溶菌酶(lysozyme)中，超聲破碎，使超聲時(shí)間累積40分鐘(工作時(shí)間2s；間隙時(shí)間2s；工作次數(shù)90；循環(huán)次數(shù)6；功率300HZ)，裂解液12000rpm，4℃離心25分鐘，棄上清；將沉淀懸于50ml washbuffer(1％Triton-100，50mM Tris PH7.0，100mM NaCl，10mM EDTA，2mM DTT)中，超聲洗滌(工作時(shí)間2s；間隙時(shí)間2s；工作次數(shù)60；功率200-300HZ)；12000rpm，4℃離心20分鐘，棄上清；重復(fù)3次；將沉淀懸于40ml重懸緩沖液(A)(50mM Tris PH7.0，100mM NaCl，10mM EDTA，2mM DTT，2M尿素)中，超聲洗滌；12000rpm，4℃離心20分鐘，棄上清，重復(fù)2次；將沉淀懸于40ml重懸緩沖液(B)(50mM Tris PH7.0，100mM NaCl，10mMEDTA，2mM DTT，8M尿素)中，超聲洗滌；12000rpm，4℃離心20分鐘，取上清，過濾器過濾，作為樣品。然后按可溶蛋白的純化方法用Ni柱純化，不同的是洗脫緩沖液中還含了8M的尿素。
實(shí)施例5蛋白活性試驗(yàn)將純化的蛋白用生理鹽水稀釋并除去咪唑與尿素，分別將大白兔皮進(jìn)行麻醉、剃毛、消毒后在皮下注射，進(jìn)行蛋白質(zhì)活性即過敏性試驗(yàn)。大白兔為大耳白，大小為4～6個(gè)月，1.5g，首先測(cè)定體溫、剃毛、消毒后在一側(cè)背部皮下注射，每只兔子注射200μl(蛋白量25μg/g)，對(duì)側(cè)注射PBS作為局部對(duì)照。注意觀察情況。將大耳白分為6個(gè)組。第一組，2雌1雄，注射ES1-1上蛋白；第二組，1雌2雄，注射ES4蛋白；第三組，2雌1雄，注射ES1蛋白；第四組，1雌2雄，注射三個(gè)混合蛋白；第五組，1雌1雄，注射純NUSA；第六組，2雌1雄，注射純PBS，作為空白對(duì)照。
結(jié)果大白兔正常體溫為39.0-39.6℃，注射毒素蛋白后反應(yīng)顯著，見圖2，由圖2可以看出注射15小時(shí)后，第一組雌兔出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象，體溫為41.2℃，全身出現(xiàn)紫斑，耳部尤為嚴(yán)重(見圖2A)；第二組雄兔出現(xiàn)皮下腫塊，體溫為40.5℃(見圖2B)；其他為正常。注射24小時(shí)后，第一組，雌兔出現(xiàn)耳部紫癲，腫脹嚴(yán)重，體溫40.5℃(見圖2C)；第二組，雌兔出現(xiàn)紅腫(見圖2D)，體溫為40.6℃，雄兔體溫為40.0℃；第三組，雌兔出現(xiàn)紅腫，體溫為39.8℃(見圖2E)；第四組，全身出現(xiàn)紅斑，體溫為40.0℃(見圖2F)；第五組，對(duì)照NUSA的體溫為39.2-39.5℃；第六組，空白PBS對(duì)照的體溫為39.0℃-39.3℃。
實(shí)施例6蛋白皮試預(yù)防試驗(yàn)將蛋白用PBS稀釋后，每只兔注射200μl(蛋白量1.5mμg/g)；實(shí)驗(yàn)兔分為6個(gè)組第一組，2雌1雄，注射ES1-1上蛋白；第二組，1雌2雄，注射ES4蛋白；第三組，2雌1雄，注射ES1蛋白；第四組，1雌2雄，注射三個(gè)混合蛋白；第五組，1雌1雄，注射純NUSA；第六組，2雌1雄，注射純PBS，作為空白對(duì)照。
結(jié)果蛋白皮試預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果注射毒素蛋白15小時(shí)后觀察發(fā)現(xiàn)，第一組雌兔出現(xiàn)紅腫；第二組1雄兔和1雌兔出現(xiàn)紅腫；第三組，1雌兔出現(xiàn)紅腫，第四組，1雄兔全身出現(xiàn)淤斑；第五組，對(duì)照NUSA正常；第六組PBS，正常。近41％的兔為過敏性體質(zhì)。
實(shí)施例7蛋白治療試驗(yàn)選擇過敏體質(zhì)的兔子3只，按表3標(biāo)準(zhǔn)方案經(jīng)皮下注射純化的重組致敏毒素蛋白進(jìn)行免疫治療，在4天治療結(jié)束后，再用按2.11進(jìn)行“攻毒”和蟻叮咬實(shí)驗(yàn)后，觀察兔體是否有過敏反應(yīng)。
表3重組致敏毒素蛋白的免疫治療方案

結(jié)果蛋白治療試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)兔子免疫治療4天后，再次接種純化的致敏毒素蛋白后均未出現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng)。
序列表<110>中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所<120>重組紅火蟻致敏毒素蛋白及用途<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>638<212>DNA<213>紅火蟻<220>
<221>基因組<222>(1)..(638)<223>
<400>1cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg attgatgacg 60acgacaagag tccgggagct cgtggatccg aattcgaatt catgagaaag tttgccgcga120tatttgtagt tttctttgta caatgcacgc atttgtattc ccttgcacag gcacgtgccg180agcctgatcc gggggttgta gagtatttga aacagtcctg tgtctacggt aattctagct240acattaacgt atacttgtac aacagtcgtt tccagggcaa aaatctcggg aaccaacaga300gctgccagga tattaatgca tcactaccgg tcgtcttcat aactcatggc ttcaccagtt360ctgcacaagt gtctacattt aaagatctgg caaatgcatt tgtacagaaa ggtcatacag420
catttatagt agattggtct gaggcagctt gcactgatgg actgcccggt gttcaatttg480ccgagtataa tgcggcggca tcgaacactt atgatatcgg tcaacttatg gcaaaatata540ccgttgattt gatgaacaag tgtaaaattc cattgaataa tatccaatat gtaggtcaca600gtcttggctc acacgtgtgc ggcttcgctg caaaacat638<210>2<211>500<212>DNA<213>紅火蟻<220>
<221>基因組<222>(1)..(500)<223>
<400>2cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg attgatgacg 60acgacaagag tccgggagct cgtggatccg aattcgtgtt cgatggtggg aaatcgcaac120cggcttgttc atggtatgac gttccttgct cacacagcga aagtatcgta tatgcaaccg180ggatggtgag tggtagatgt caacaccttg ctgttccttg gacagctcag cagagaatca240acccaattca atggaaattc tggagagttt tcacatcaaa tatacccgct tatcctacct300ctgacacaac gaattgtgta gttttgaaca ccaatgtatt taagaatgac aatactttcg360aaggagaata ccacgctttt cctgactgtg cacgtaatct atttaagtgc aggcagcaat420aactcgagca ccaccaccac caccactaat gttaattaag ttgggcgttc ctaggctgat480aaaacagaat ttgcctggcg500
<210>3<211>549<212>DNA<213>紅火蟻<220>
<221>基因組<222>(1)..(549)<223>
<400>3cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg attgatgacg 60acgacaagag tccgggagct cgtggatccg aattctccga attccttgat attaaggaaa120taagtattat gaatagaatt ttagaaaaat gtataagaac agtaccaaaa cgcgaaaatg180atccaataaa tcctttaaga aatgtcaatg tgtggtattg tgcattcact aagcgtggca240tatttactcc aaaaggtgta aatacgaaac aatatattaa ctattgcgag aagacggcca300ttagtcctgc tgatataaaa ctgtgcaaga aaatagcttc taaatgcgta aagaaagtgt360atgaccgccc gggaccaatc attgaaagaa gcaaaaatct attgtcatgt gttctaaaaa420agggtttgct cgaattgaca gtgtatggca aaaaaaaaac tcgagcacta actcgagcac480caccaccacc accactaatg ttaattaagt tgggcgttcc taggctgata aaacagaatt540tgcctggcg549<210>4<211>346<212>PRT<213>紅火蟻<220>
<221>soli1全長(zhǎng)
<222>(1)..(346)<223>
<400>4Met Arg Lys Phe Ala Ala Ile Phe Val Val Phe Phe Val Gln Cys Thr1 5 10 15His Leu Tyr Ser Leu Ala Gln Ala Arg Ala Glu Pro Asp Pro Gly Val20 25 30Val Glu Tyr Leu Lys Gln Ser Cys Val Tyr Gly Asn Ser Ser Tyr Ile35 40 45Asn Val Tyr Leu Tyr Asn Ser Arg Phe Gln Gly Lys Asn Leu Gly Asn50 5560Gln Gln Ser Cys Gln Asp Ile Asn Ala Ser Leu Pro Val Val Phe Ile65 70 75 80Thr His Gly Phe Thr Ser Ser Ala Gln Val Ser Thr Phe Lys Asp Leu8590 95Ala Asn Ala Phe Val Gln Lys Gly His Thr Ala Phe Ile Val Asp Trp100 105 110Ser Glu Ala Ala Cys Thr Asp Gly Leu Pro Gly Val Gln Phe Ala Glu115 120 125Tyr Asn Ala Ala Ala Ser Asn Thr Tyr Asp Ile Gly Gln Leu Met Ala130 135 140
Lys Tyr Thr Val Asp Leu Met Asn Lys Cys Lys Ile Pro Leu Asn Asn145 150 155 160Ile Gln Tyr Val Gly His Ser Leu Gly Ser His Val Cys Gly Phe Ala165 170 175Ala Lys His Val Lys Lys Leu Ile Asn Lys Thr Met Pro Tyr Ile Leu180 185 190Ala Leu Asp Pro Ala Asp Pro Ser Phe Gly Ser Asn Lys Cys Gly Glu195 200205Arg Ile Cys Lys Ser Asp Ala Lys Arg Ile Val Val Phe Lys Thr Ser210 215 220Ile Leu Gly Ile Gly Glu Asn Ile Ile Gly His Leu Leu Ile Val Phe225 230 235 240Asp Gly Gly Lys Ser Gln Pro Ala Cys Ser Trp Tyr Asp Val Pro Cys245 250 255Ser His Ser Glu Ser Ile Val Tyr Ala Thr Gly Met Val Ser Gly Arg260 265 270Cys Gln His Leu Ala Val Pro Trp Thr Ala Gln Gln Arg Ile Asn Pro275 280 285Ile Gln Trp Lys Phe Trp Arg Val Phe Thr Ser Asn Ile Pro Ala Tyr
290 295 300Pro Thr Ser Asp Thr Thr Asn Cys Val Val Leu Asn Thr Asn Val Phe305 310315 320Lys Asn Asp Asn Thr Phe Glu Gly Glu Tyr His Ala Phe Pro Asp Cys325330 335Ala Arg Asn Leu Phe Lys Cys Arg Gln Gln340 345<210>5<211>125<212>PRT<213>紅火蟻<220>
<221>soli1部分<222>(1)..(125)<223>
<400>5Gly Phe Thr Ser Ser Ala Gln Val Ser Thr Phe Lys Asp Leu Ala Asn1 5 1015Ala Phe Val Gln Lys Gly His Thr Ala Phe Ile Val Asp Trp Ser Glu20 25 30Ala Ala Cys Thr Asp Gly Leu Pro Gly Val Gln Phe Ala Glu Tyr Asn35 40 45
Ala Ala Ala Ser Asn Thr Tyr Asp Ile Gly Gln Leu Met Ala Lys Tyr50 55 60Thr Val Asp Leu Met Asn Lys Cys Lys Ile Pro Leu Asn Asn Ile Gln65 70 75 80Tyr Val Gly His Ser Leu Gly Ser His Val Cys Gly Phe Ala Ala Lys85 90 95His Val Lys Lys Leu Ile Asn Lys Thr Met Pro Tyr Ile Leu Ala Leu100105 110Asp Pro Ala Asp Pro Ser Phe Gly Ser Asn Lys Cys Gly115 120 125<210>6<211>118<212>PRT<213>紅火蟻<220>
<221>soli4<222>(1)..(118)<223>
<400>6Leu Asp Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Asn Arg Ile Leu Glu Lys Cys1 510 15Ile Arg Thr Val Pro Lys Arg Glu Asn Asp Pro Ile Asn Pro Leu Arg2025 30
Asn Val Asn Val Trp Tyr Cys Ala Phe Thr Lys Arg Gly Ile Phe Thr35 40 45Pro Lys Gly Val Asn Thr Lys Gln Tyr Ile Asn Tyr Cys Glu Lys Thr50 55 60Ala Ile Ser Pro Ala Asp Ile Lys Leu Cys Lys Lys Ile Ala Ser Lys65 70 75 80Cys Val Lys Lys Val Tyr Asp Arg Pro Gly Pro Ile Ile Glu Arg Ser85 90 95Lys Asn Leu Leu Ser Cys Val Leu Lys Lys Gly Leu Leu Glu Leu Thr100 105 110Val Tyr Gly Lys Lys Lys11權(quán)利要求
1.一種分離的重組紅火蟻毒素蛋白，其具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
2.一種分離的重組紅火蟻毒素蛋白soli1-1，其為權(quán)利要求1所述蛋白的多肽片段，具有SEQID NO5所示的氨基酸序列。
3.一種分離的重組紅火蟻毒素蛋白soli4，其具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
4.一種用于防治紅火蟻的藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組紅火蟻毒素蛋白以及藥物學(xué)上可接受的載體。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組紅火蟻毒素蛋白在預(yù)防和/或治療紅火蟻引發(fā)疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明從紅火蟻體內(nèi)提取RNA并在體外高效表達(dá)出兩種致敏原蛋白，利用親合層析對(duì)其進(jìn)行純化，以純化的重組毒素蛋白作為抗原進(jìn)行蛋白質(zhì)活性及致敏性的研究，試驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明提供的重組毒素蛋白具有良好的生物學(xué)活性和免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1876680SQ20061009002
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者韓雪清, 林祥梅, 吳紹強(qiáng), 劉建, 梅琳, 張永國(guó), 陳乃中 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所