專利名稱：一種東亞鉗蝎抗菌肽基因及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種蝎抗菌肽以及該蝎抗菌肽基因，還涉及一種東亞鉗蝎毒素基因的制備方法，同時(shí)還涉及該基因的用途，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種蝎抗菌肽基因的分離；涉及一種蝎抗菌肽的抗菌譜鑒定對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有廣譜抗性，而革蘭氏陰性菌無(wú)作用；涉及點(diǎn)突變其抗菌肽提高了對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性；還涉及蝎抗菌肽對(duì)臨床分離的耐藥溶血性葡萄球菌有效，具有潛在抗菌藥物開發(fā)的價(jià)值。
背景技術(shù)：
東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch，BmK)是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴中藥，2000多年前就記載了蝎子的藥用史。明朝《本草綱目》更詳細(xì)記載蝎主治“諸風(fēng)癮疹、中風(fēng)、半身不遂、口眼歪斜、語(yǔ)澀、手足抽摯，小兒驚癇風(fēng)搐”等多種疾病，具有抗腫瘤，殺蟲，抑菌和抗菌功效，其作用主要來(lái)源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一類由10-100個(gè)氨基酸組成的具有多種生物活性的小分子多肽(通常叫蝎毒素)，它們可以選擇性、特異性的與細(xì)胞膜上的膜蛋白相互作用，從而改變細(xì)胞對(duì)離子的通透能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、pH、膜電位、興奮性等多種細(xì)胞代謝過(guò)程和細(xì)胞分泌、激素作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過(guò)程。據(jù)估計(jì)，約有100000種不同生物活性肽存在于各種蝎毒腺中。因此，蝎毒素具有重要的理論研究意義和應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。但是由于蝎毒成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)相似，難以分離，許多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低，這些無(wú)疑都限制了蝎毒的研究和應(yīng)用。很有必要采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究蝎毒單體成分的生理功能。
對(duì)東亞鉗蝎有實(shí)驗(yàn)研究表明，全蝎乙醇提取物在體外對(duì)8種表淺致病真菌均有抑制作用，尤其對(duì)裴氏著色菌、中克氏孢子絲菌、石膏樣毛癬菌、絮狀表皮癬菌較為敏感，其抗真菌作用優(yōu)于大蒜浸出液。曾憲春等從我國(guó)東亞鉗蝎毒腺中分離到了一個(gè)抗菌肽基因BmKn2，發(fā)現(xiàn)該蝎毒肽具有抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的功能(Zeng X C，Wang S X，Zhu Y，Zhu S Y，Li W X.Identification andfunctional characterization of novel scorpion venom peptides with nodisulfide bridge from Buthus martensii Karsch.Peptides，2004，25143-150.)，本發(fā)明獲得的BmKAMP1是從東亞鉗蝎毒腺中分離的另一新基因。同時(shí)，目前涉及東亞鉗蝎毒腺毒素基因的專利有7項(xiàng)①東亞鉗蝎毒素BmKAS在制藥中的應(yīng)用，該發(fā)明涉及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗外周傷害藥中的應(yīng)用，以及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗痛覺(jué)過(guò)敏藥中的應(yīng)用；②一種含有雙價(jià)抗蟲基因的重組桿狀病毒，該發(fā)明涉及東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因BmKIT與一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)，獲得含雙價(jià)抗蟲基因的重組桿狀病毒AcNPV-BmKIT-Chi；③蝎抗心律失常肽重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，該發(fā)明涉及了一種蝎抗心律失常肽BmKIM基因重組大腸桿菌，用于大量生產(chǎn)可溶、具有抗心律失?；钚缘闹亟M肽；④蝎抗心律失常肽及其制備方法和應(yīng)用，該發(fā)明公開了一種蝎抗心律失常肽BmKIM及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明所得到的重組BmKIM多肽具有高效抗心律失?；钚?，且可溶性好，產(chǎn)量高；⑤一種人工合成的蝎氯離子通道神經(jīng)毒素基因-rBmKCTa，該專利涉及到氯離子通道神經(jīng)毒素BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重組蝎氯離子通道神經(jīng)毒素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制作用，可用于制備通過(guò)抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以治療的疾病的藥物；⑥一種過(guò)渡型蝎毒素BmKabT的用途，本發(fā)明公開了的過(guò)渡型蝎毒素BmKabT的用途，它可以作為一個(gè)獨(dú)特的鈉通道調(diào)制劑，研究鈉通道組成、結(jié)構(gòu)和功能的探針，可調(diào)節(jié)和治療鈉通道相關(guān)疾病的調(diào)制劑和藥品，可制備調(diào)節(jié)或治療高血鉀性麻痹、先天性肌強(qiáng)直及其它骨骼肌疾病、第三類長(zhǎng)QT間隔癥(LQT3)、原發(fā)性心室纖顫及其他心臟疾病的調(diào)制劑或藥品；⑦一種重組蝎昆蟲毒素及其可溶性表達(dá)和純化方法，該發(fā)明涉及一種重組蝎昆蟲毒素rBmKIT及其可溶性表達(dá)和純化方法。
盡管①②③④⑤⑥⑦專利都是關(guān)于東亞鉗蝎毒素的內(nèi)容，專利涉及的蝎毒素基因BmKAS、BmKIT、BmKIM、BmKCT、BmKabT與本發(fā)明獲得的BmKAMP1基因是完全不同的毒素基因，并且①②③④⑤⑥⑦專利發(fā)明都沒(méi)有涉及到蝎毒素的抗菌功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種東亞鉗蝎毒素抗菌肽基因，具有抗菌功能。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種東亞鉗蝎蝎毒抗菌肽，該抗菌肽含有13個(gè)氨基酸，生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明再一個(gè)目的在于提供一種制備東亞鉗蝎抗菌肽基因的方法，該方法簡(jiǎn)單，提高抗菌活性效果佳。
本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種東亞鉗蝎抗菌肽在制備治療或預(yù)防革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的構(gòu)思為①構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，首先取東亞鉗蝎的毒腺；其次是提取總RNA，并純化mRNA；第三是反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA；第四是雙鏈cDNA與載體pSPORT1的連接(采用T4DNA連接酶)；第五是重組分子的電轉(zhuǎn)化；第六是獲得毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)；②以①毒腺組織cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，通過(guò)PCR的方法篩選到了一個(gè)克隆子I5(編號(hào))，序列分析為一種抗菌肽基因，命名為BmKAMP1，該菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2007年4月3日，保藏編號(hào)CCTCC NOM207036，分類命名大腸桿菌DH5a/BmKAMP1(Escherichia coliDH5α/BmKAMP1)；③采用化學(xué)合成的方法(由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?，獲得了蝎毒抗菌肽BmKAMP1，抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，BmKAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(最小抑菌濃度MIC為10μg/ml)、枯草芽孢桿菌(MIC為6μg/ml)、金黃色葡萄球菌(MIC為3μg/ml)、滕黃微球菌(MIC為50μg/ml)具有不同濃度的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(100μg/ml無(wú)作用)和銅綠假單胞菌(100μg/ml無(wú)作用)無(wú)效。該蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有特異性；④分子設(shè)計(jì)了BmKAMP1的突變體BmKAMP1-M，抗菌試驗(yàn)表明，該蝎毒抗菌肽的突變體BmKAMP1-M提高了對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性(對(duì)大腸桿菌MIC為10μg/ml和對(duì)銅綠假單胞菌MIC為50μg/ml)；⑤BmKAMP1和BmKAMP1-M都可以對(duì)湖北省婦幼保健醫(yī)院分離的耐藥性溶血性葡萄球菌具有抗性作用(BmKAMP1的MIC為5μg/ml，而BmKAMP1-M的MIC為2.5μg/ml)。因此蝎毒抗菌肽BmKAMP1具有潛在抗菌藥物開發(fā)的價(jià)值。
本發(fā)明的目的是在于提供一種構(gòu)建高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)的方法，毒素基因覆蓋率達(dá)到95％以上。構(gòu)建高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)的技術(shù)路線如圖1。包括購(gòu)買東亞鉗蝎經(jīng)電擊取毒后48h，其毒腺用于總RNA的分離(圖2)；取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，通過(guò)Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA；制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量(圖3)。
通過(guò)上述方法制備的蝎毒腺總RNA量為3mg，采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)Promega)分離和純化mRNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其獲得的蝎毒腺mRNA量約10μg。用5μgmRNA作為起始量，進(jìn)行cDNA的第一鏈和第二鏈合成，繼續(xù)雙鏈cDNA與SalI銜接頭的連接，NotI消化雙鏈cDNA，去除雙鏈cDNA分子中的過(guò)量SalI銜接頭和酶切小片段，雙鏈cDNA與pSPORT1載體(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen)的連接和轉(zhuǎn)化，結(jié)果獲得了一個(gè)豐度為1.5*106個(gè)克隆子/μgcDNA。構(gòu)建的蝎毒腺cDNA文庫(kù)陽(yáng)性插入率達(dá)到95％以上(圖4)，此文庫(kù)具有較高的質(zhì)量。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種從東亞鉗蝎毒腺cDNA文庫(kù)中篩選獲得的抗菌肽基因。根據(jù)BmKn1的氨基酸序列和/或核苷酸序列設(shè)計(jì)一特定引物結(jié)合下游通用引物采用PCR策略從cDNA文庫(kù)中篩選目的毒素基因。其策略見圖5。將5ng cDNA和25ng pSPORT1載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的菌液800μl均勻涂布于10個(gè)LB/Ap+平板(每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH值至7.4，青霉素100μg/ml)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，每個(gè)平板大約含有500個(gè)左右的菌落(克隆子)，將其逐一用牙簽接種至含有950μl的LB/Ap+平板培養(yǎng)基的1.5ml Ep管(并按順序編號(hào))，37℃280rpm振搖過(guò)夜，次日從每管取出100μl用作制備PCR模板，然后將每管加入150μl甘油，-20℃或-70℃保存。同時(shí)在每個(gè)平板中加入800μl LB/Ap+液體培養(yǎng)基，用無(wú)菌接種環(huán)將菌落刮下，分裝入1.5ml Ep管，37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，用煮沸法制備質(zhì)粒，-20℃保存用作PCR模板。文庫(kù)篩選分三個(gè)輪次，首輪次用從10個(gè)平板制備的混合質(zhì)粒作模板，進(jìn)行10管PCR，電泳檢測(cè)后將陽(yáng)性管對(duì)應(yīng)的500個(gè)克隆分成的10管(每管50個(gè)克隆)進(jìn)行10管PCR。第三輪篩選就可以通過(guò)50管PCR獲得我們所需要的目的克隆。將陽(yáng)性克隆子送公司測(cè)序。結(jié)果表明I5克隆子為一個(gè)新的東亞鉗蝎抗菌肽基因，命名為BmKAMP1。一種分離的多肽基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種東亞鉗蝎蝎毒抗菌肽。BmKAMP1的前體組織形式編碼70個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(23個(gè)殘基)、成熟肽(13個(gè)殘基)和前體肽(34個(gè)殘基)?；谛舅厍绑wC末端殘基的加工規(guī)則，BmKAMP1末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。因此，本發(fā)明提供一個(gè)東亞鉗蝎蝎毒抗菌肽一種分離或合成的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種特異性作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的蝎抗菌肽，可作為抗菌藥物開發(fā)。通過(guò)化學(xué)合成的辦法，得到了純度達(dá)95％以上，且與天然抗菌肽BmKAMP1氨基酸序列一致的合成多肽(HPLC分析純度)(圖7)?？咕Y(jié)果表明對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(圖8)、金黃色葡萄球菌(圖9)、滕黃微球菌具有不同濃度的抑制作用，請(qǐng)見下表1，而對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(圖10)和銅綠假單胞菌(圖11)無(wú)效，該蝎毒抗菌肽BmKAMP1藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有特異性，與氨芐青霉素具有類似的抗菌效果。而且BmKAMP1藥物可以對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌(湖北省婦幼保健院檢驗(yàn)科急性分離的一株溶血性葡萄球菌，經(jīng)鑒定為頭孢類抗生素耐受MRCNS，編號(hào)1538)具有抗性作用(圖12)。
表1蝎毒抗菌肽BmKAMP1藥物的抑菌效果

BmKAMP1藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度MIC為10μg/ml、對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為6μg/ml、對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3μg/ml、對(duì)滕黃微球菌的MIC為50μg/ml。而BmKAMP1藥物濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和銅綠假單胞菌仍然無(wú)效。而且BmKAMP1藥物對(duì)湖北省婦幼保健醫(yī)院分離的耐藥溶血性葡萄球菌(耐受紅霉素)的MIC為5μg/ml。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種提高抗菌活性的分子設(shè)計(jì)方法。根據(jù)BmKAMP1的成熟肽序列(SEQ ID NO2)，利用免費(fèi)軟件ANTHEPROT2000(ftp://ftp.ibcp.fr/pub/antheprot/windows/anthe_5_0.exe)顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，BmKAMP1具有典型的兩親性(amphiphilic)α-Helix結(jié)構(gòu)(圖13)?；贐mKAMP1成熟肽氨基酸序列(SEQ ID NO2)的α-Helix結(jié)構(gòu)，兩親性和等電點(diǎn)，采用點(diǎn)突變將BmKAMP1成熟肽氨基酸序列(SEQ ID NO2)的第3位Gly變?yōu)锳rg，第6位Pro變?yōu)長(zhǎng)ys，第10位Gly變?yōu)長(zhǎng)ys和第11位Gly變?yōu)锳rg(圖13)。其突變型蝎毒抗菌肽BmKAMP1-M的氨基酸序列一種分離或合成的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO3所示的氨基酸序列?？咕囼?yàn)結(jié)果表明，化學(xué)合成的突變體BmKAMP1-M提高了對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性，請(qǐng)見下表2，擴(kuò)大了抗菌譜。且BmKAMP1-M藥物仍然對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌有抗性(圖14)。
表2突變體BmKAMP1-M藥物的抑菌效果

突變型蝎毒抗菌肽BmKAMP1-M對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的MIC為3μg/ml、對(duì)滕黃微球菌的MIC為50μg/ml、對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為6μg/ml、對(duì)蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度MIC為10μg/ml，而BmKAMP1-M對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的MIC為10μg/ml、對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為50μg/ml。突變型BmKAMP1-M與野生型BmKAMP1相比，其對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性大大增強(qiáng)。而且BmKAMP1-M藥物對(duì)湖北省婦幼保健醫(yī)院分離的耐藥溶血性葡萄球菌(耐受紅霉素)的MIC為2.5μg/ml，比其野生型BmKAMP1的MIC5μg/ml提高了一倍。
本發(fā)明獲得的蝎毒抗菌肽具有對(duì)BmKAMP1革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的特異性，并對(duì)醫(yī)院分離的耐藥溶血性葡萄球菌有效。而且本發(fā)明的分子設(shè)計(jì)方法，具有簡(jiǎn)單和高效的特點(diǎn)，通過(guò)這種方法可以有效提高抗菌肽的抗菌活性，從而避免了隨機(jī)點(diǎn)突變的大量篩選和無(wú)目的性。


圖1東亞鉗蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)構(gòu)建示意圖。
①取東亞鉗蝎的毒腺；②提取總RNA，并純化mRNA；③反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA；④雙鏈cDNA與載體pSPORT1的連接；⑤重組分子的電轉(zhuǎn)化；⑥獲得毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)。
圖2取自湖北隨州的東亞鉗蝎及其毒腺。
圖3東亞鉗蝎毒腺總RNA的甲醛變性電泳。
1采用NaAc沉淀；2未采用NaAc沉淀。
圖4PCR檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量電泳圖。
M標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Mark；1-16從文庫(kù)中隨機(jī)挑選的16個(gè)不同克隆子。
圖5PCR篩選cDNA文庫(kù)的策略。
圖6東亞鉗蝎蝎毒抗菌肽BmKAMP1基因及其氨基酸。
cDNA序列下方為推斷的對(duì)應(yīng)氨基序列；信號(hào)肽氨基酸以單下劃線標(biāo)記；成熟肽氨基酸以黑體標(biāo)記；方框部分氨基酸為羧肽酶識(shí)別位點(diǎn)；陰影部分氨基酸為C端前體肽。
圖7化學(xué)合成東亞鉗蝎抗菌肽BmKAMP1的HPLC純度鑒定圖。
圖8BmKAMP1藥物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為50μg/ml氨芐青霉素；抗菌肽BmKAMP1藥物濃度為25μg/ml和50μg/ml。
圖9BmKAMP1藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為50μg/ml氨芐青霉素；抗菌肽BmKAMP1藥物濃度為5μg/ml和10μg/ml。
圖10BmKAMP1藥物對(duì)大腸桿菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為20μg/ml卡那霉素；抗菌肽BmKAMP1藥物濃度為50μg/ml和100μg/ml。
圖11BmKAMP1藥物對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為20μg/ml卡那霉素；抗菌肽BmKAMP1藥物濃度為50μg/ml和100μg/ml。
圖12野生型BmKAMP1藥物對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的抗性作用。
陽(yáng)性對(duì)照為30μg萬(wàn)古霉素；耐藥抗生素為15μg紅霉素；野生型抗菌肽BmKAMP1藥物為50μg；陰性對(duì)照為1％BSA。
圖13野生型BmKAMP1和突變型BmKAMP1-M蝎毒抗菌肽的兩親性a-Helix結(jié)構(gòu)。
圖14突變型BmKAMP1-M藥物對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的抗性作用。
陽(yáng)性對(duì)照為30μg萬(wàn)古霉素；耐藥抗生素為15μg紅霉素；突變型抗菌肽BmKAMP1-M藥物為50μg；陰性對(duì)照為1％BSA。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1蝎毒腺總RNA的提取(Trizol LS一步法Trizol LS購(gòu)自美Invitrogen)①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，加入10ml TRIZOL reagent混勻，室溫(20-25℃，以下相同)放置5分鐘；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室溫放置2-3分鐘，4℃下12000g離心15分鐘；③取水相加1倍體積異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃下12000g離心10分鐘得RNA沉淀；④沉淀用5ml75％乙醇洗滌，7500g離心5分鐘；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treated water，55-60℃保溫10分鐘以徹底溶解RNA。整個(gè)過(guò)程參照TRlZOL(Total RNA Isolation)ReagentKit推薦方法進(jìn)行。制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。
實(shí)施例2mRNA的分離純化采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)(Promega，USA)分離和純化mRNA，其工作原理是基于Oligo(dT)與mRNA 3’端poly(A)尾的互補(bǔ)配對(duì)特性，用生物素標(biāo)記Oligo(dT)，通過(guò)它與mRNA 3’端poly(A)的退火形成雜交體，然后用標(biāo)有親合素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗滌生物素Oligo(dT)/mRNA雜交體，最后用無(wú)RNA酶的ddH2O將之洗脫下來(lái)，達(dá)到從總RNA中分離mRNA的目的。①樣品的制備將RNA加入到含有32μlβ-巰基乙醇的800μl的GTC中。②探針的退火取250pM濃度Oligo(dT)5μl，加蒸餾水至50μl；加入1.6ml預(yù)熱的dilution buffer(dilution buffer已加入32μlβ-巰基乙醇)，與RNA混勻，70℃溫育5分鐘。③磁珠的活化取1.2ml的磁珠SA-PMPS(購(gòu)自美Promega)于1.5ml的離心管中；用0.5×SSC重懸SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原體積0.5×SSC洗滌SA-PMPS3次。④mRNA的獲取將70℃溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5分鐘放磁架上吸附磁珠，棄上清液；2ml的0.5XSSC懸浮磁珠，洗滌重復(fù)2次，最后一次盡量去除SSC；加入無(wú)RNA酶的ddH2O至磁珠中，輕輕混勻，然后離心(12000g×3分鐘)或磁架吸附磁珠；取上清，獲得mRNA。通過(guò)電泳和紫外測(cè)定mRNA的濃度和純度。⑤mRNA的沉淀將④獲得的mRNA中加入糖原和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀過(guò)夜，mRNA將用于cDNA的合成。
實(shí)施例3第一鏈cDNA合成①在1.5ml Ep管中加入2μl Not I Primer-adapter和6μl mRNA(含3μgmRNA)，70℃溫育10min，迅速放于冰上，離心后，加入下列成分4μl 5X firststrand buffer；2μl 0.1M DTT；1μl 10mM dNTPs；1μl DEPC·H2O。輕輕混勻后離心，37℃放至2min；②加入5μl逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后取2μl，加1μl[α-32P]dCTP(4μCi)(示蹤管)。與上述反應(yīng)組分(樣品管)同時(shí)37℃溫育1h，然后放入冰上終止反應(yīng)；③對(duì)于示蹤管，依次加入43μl 20mM EDTA和5μl酵母tRNA，混勻后，分別取兩份10μl點(diǎn)于兩張濾膜上，1份用10％TCA洗3次，每次5min，95％乙醇洗1次，空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液中(為1#樣品)；另1份空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液(為2#樣品)。另30μl示蹤液，加1.5μl 7.5M NH4OAc和90μl無(wú)水乙醇(-20℃)，混勻后立即14,000rpm離心20min，棄上清，加入0.5ml 70％無(wú)水乙醇(-20℃)，14,000rpm離心2min，棄上清，37℃干燥10min讓乙醇揮發(fā)，溶于10μl TEN溶液，加入10μl 2X加樣緩沖液，取10μl用于堿性凝膠電泳。用[α-32P]dCTP標(biāo)記λDNA HindIII片段作分子量標(biāo)記；④混勻后室溫下放置15min，加入2μl 0.2M EDTA終止反應(yīng)。取6μl反應(yīng)液和6ml 2X堿性電泳緩沖液混勻，電泳5h后，用7％TCA浸泡20min，直至溴酚蘭變黃。然后用衛(wèi)生紙吸干(8h左右)，進(jìn)行放射自顯影；⑤對(duì)于樣品管，用于第二鏈的合成。
Hind III 10X buffer 2μldGTP0.2mMdATP0.2mM[α-32P]dCTP 2μCiHind III markers1μgKlenow DNA polymerase 2unitAdd ddH2O to final volume of 20μl實(shí)施例4第二鏈cDNA合成①冰上在樣品管中依次加入下列成分；②輕輕混勻后，16℃溫育2h；③加入2μl(10units)T4DNA聚合酶，繼續(xù)16℃反應(yīng)5min；④轉(zhuǎn)入冰上，加入10μl0.5M EDTA；⑤加入等體積(150μl)酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，徹底渦旋后，室溫下14,000rpm離心5min。將水相(140μl)轉(zhuǎn)入另一1.5ml Ep管；⑥加入70μl的7.5M NH4OAc和0.5ML無(wú)水乙醇(-20℃)，渦旋后，室溫下14,000rpm離心20min；⑦棄上清，加入0.5ml 70％乙醇(-20℃)，同上離心2min。棄上清，37℃干燥10min。
DEPC-treated water92μl5X second strand buffer 30μl10mM dNTP mix 3μlE.coli DNA ligase(10units/μl)1μlE.coli DNA polymerase(10units/μl)4μlE.coli RNase H(2units/μl)1μlFinal Volume 150μl實(shí)施例5雙鏈cDNA與Sal I銜接頭的連接①用25μl DEPC處理的ddH2O溶解實(shí)施例4的cDNA樣品，然后按下表依次加入；②輕輕混勻，16℃反應(yīng)過(guò)夜(約20h)。③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提和NH4Oac/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。
5X T4DNA ligase buffer 10μlSal I adapters 10μlT4DNA ligase 5μlFinal Volume50μl實(shí)施例6Not I消化雙鏈cDNA①將實(shí)施例5的樣品溶于41μl，然后按下表依次加入；②混勻后，37℃溫育2h；③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5M NH4Oac/乙醇沉淀，37℃干燥10min。④溶于70μl TEN，取1μl用于定量，其余-20℃保存?zhèn)溆谩?br> REACT 3 buffer 5μlNot I 4μlFinal Volume50μl實(shí)施例7去除雙鏈cDNA分子中的過(guò)量Sal I銜接頭和酶切小片段用nucleon extraction and purification kit(Amersham，USA)去除過(guò)量SalI銜接頭和酶切小片段。①室溫下懸浮樹脂，然后取600μl加于離心柱中，2000rpm離心10s，去掉液體。在樹脂中央加入40μl上述cDNA溶液。同上離心；②收集洗脫液用于連接反應(yīng)。
實(shí)施例8雙鏈cDNA與pSPORT1載體的連接和轉(zhuǎn)化①在1.5ml Ep管中依次加入下列成分；②室溫下反應(yīng)16h；③在②反應(yīng)液中依次加入下列成分5.0μl yeast tRNA，12.5μl 7.5M NH4Oac，70μl無(wú)水乙醇(-20℃)。渦旋混勻后立即14000離心20min；④沉淀用70％乙醇(-20℃)洗滌，37℃干燥后溶于4μl；⑤取2μl電擊轉(zhuǎn)化50μl E.coli K12 MC1061。
5X T4DNA ligase buffer4μl
pSPORT1，Not I-Sal I-Cut(50ng/μl) 1μlcDNA(3ng/μl)4μlT4DNA ligase1μlAdd ddH2O to final volume 20μl實(shí)施例9毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)的初步鑒定用PCR方法鑒定文庫(kù)的質(zhì)量，正向引物5’TCGACCCACGCGTCCG 3’(按Sal銜接頭序列設(shè)計(jì))；反向引物5’GAGCGGCCGCCCT15 3’(按Not I引物-銜接頭的序列設(shè)計(jì))。
實(shí)施例10PCR引物的設(shè)計(jì)基于蝎毒素BmKn1的前體核苷酸序列其核苷酸序列為SEQ ID NO1所示。設(shè)計(jì)特定正向引物FP15′-TGGATACTATGAAGTACTTA-3′。反向引物RP15′-GAGCGGCCGCCT15-3′，根據(jù)建庫(kù)試劑盒提供的合成第一鏈cDNA引物的序列設(shè)計(jì)。
實(shí)施例11PCR策略篩選cDNA文庫(kù)采用PCR的方法對(duì)實(shí)施例8中構(gòu)建的東亞鉗蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，其篩選策略見圖5和具體操作步驟如下①取cDNA蝎毒庫(kù)800μl均勻涂布于10個(gè)LB/AP+平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；②每個(gè)平板大約含有500個(gè)左右的單菌落，將其逐一用牙簽接種至600μl的LB/AP+液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；③取50μl煮沸1分鐘，以制備PCR模板；④其余菌溶液中加入300μl60％無(wú)菌甘油-20℃保存；⑤同時(shí)，在每個(gè)平板中加入500μlLB/AP+溶液，用無(wú)菌接種環(huán)將菌落刮下，分裝入1.5mlEp管，37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，取100μl煮沸1分鐘，制備成為PCR模板；⑥首先用每個(gè)平板的混合菌溶液作為PCR模板，用實(shí)施例10中PCR引物FP1和RP1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最后72℃延伸5分鐘，循環(huán)35次。對(duì)經(jīng)PCR反應(yīng)能擴(kuò)出約200bp帶的平板進(jìn)行再篩選，即取此平板中的每個(gè)單菌落的菌溶液10μl，每50管混合后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)有陽(yáng)性信號(hào)的管所對(duì)應(yīng)的50個(gè)菌再進(jìn)行PCR反應(yīng)。將有約200bpPCR擴(kuò)增帶的單克隆菌溶液送交公司測(cè)序。
實(shí)施例12DNA測(cè)序和計(jì)算機(jī)分析通過(guò)PCR篩選初步鑒定為陽(yáng)性的克隆用ABI PRISMTMDNA自動(dòng)測(cè)序儀(北京華大基因公司)進(jìn)行測(cè)序。序列錄入軟件為BioEdit v4.5.8(Tom Hall，1999)，同源性比較和信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分別為CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)。序列分析表明陽(yáng)性克隆子為一個(gè)新的基因，命名為BmKAMP1。
實(shí)施例13化學(xué)合成蝎毒抗菌肽BmKAMP1BmKAMP1的前體組織形式編碼70個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(23個(gè)殘基)、成熟肽(13個(gè)殘基)和前體肽(34個(gè)殘基)。基于蝎毒素前體C末端殘基的加工規(guī)則，BmKAMP1末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。因此，采用化學(xué)合成的辦法獲得高純度的蝎毒抗菌肽，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
實(shí)施例14蝎毒肽BmKAMP1藥物對(duì)蘇云金芽孢桿菌(CCTCCAB92037)的抑制試驗(yàn)96孔板培養(yǎng)法①將蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；②37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；③確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)蘇云金芽孢桿菌的最低抑制濃度為10μg/ml。
實(shí)施例15蝎毒肽BmKAMP1藥物對(duì)枯草芽孢桿菌(CCTCCAB91021)的抑制試驗(yàn)涂平板法①將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取800μl加入到滅菌試管中，然后分別向試管加入200μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入200μl 1％BSA和200μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；②從37℃，250轉(zhuǎn)培養(yǎng)6小時(shí)后的各試管菌液做適當(dāng)?shù)南♂尯螅?0μl涂布平板，以確保陰性對(duì)照菌形成的菌落數(shù)為50-300個(gè)，以便進(jìn)行計(jì)數(shù)；③第一輪確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)枯草芽孢桿菌的有效抑制濃度為20μg/ml。
96孔板培養(yǎng)法(1)將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；(2)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；(3)確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前(1)(2)步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度為6μg/ml。
實(shí)施例16蝎毒肽BmKAMP1藥物對(duì)金黃色葡萄球菌(CCTCCAB94004)的抑制試驗(yàn)涂平板法①將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取800μl加入到滅菌試管中，然后分別向試管加入200μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入200μl 1％BSA和200μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；②從37℃，250轉(zhuǎn)培養(yǎng)6小時(shí)后的各試管菌液做適當(dāng)?shù)南♂尯?，?0μl涂布平板，以確保陰性對(duì)照菌形成的菌落數(shù)為50-300個(gè)，以便進(jìn)行計(jì)數(shù)；③第一輪確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)金黃色葡萄球菌的有效抑制濃度為10μg/ml。
96孔板培養(yǎng)法(1)將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；(2)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；(3)確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前(1)(2)步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為3μg/ml。
實(shí)施例17蝎毒肽BmKAMP1藥物對(duì)滕黃微球菌(CCTCCAB93113)的抑制試驗(yàn)96孔板培養(yǎng)法①將滕黃微球菌(Micrococcus luteus)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；②37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；③確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)滕黃微球菌的最低抑制濃度為50μg/ml。
實(shí)施例18蝎毒肽BmKAMP1藥物對(duì)大腸桿菌(CCTCCAB94012)的抑制試驗(yàn)涂平板法①將大腸桿菌(Escherichia coli)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取800μl加入到滅菌試管中，然后分別向試管加入200μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入200μl 1％BSA和200μl的卡那霉素(終濃度為20μg/ml)；37℃；②從37℃，250轉(zhuǎn)培養(yǎng)6小時(shí)后的各試管菌液做適當(dāng)?shù)南♂尯?，?0μl涂布平板，以確保陰性對(duì)照菌形成的菌落數(shù)為50-300個(gè)，以便進(jìn)行計(jì)數(shù)；第一輪確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，對(duì)大腸桿菌仍然無(wú)抑制效果。
96孔板培養(yǎng)法(1)將大腸桿菌培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的卡那霉素(終濃度為20μg/ml)；(2)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；(3)確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前(1)(2)步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)大腸桿菌的最低抑制濃度大于100μg/ml。
實(shí)施例19蝎毒肽BmKAMP1藥物對(duì)銅綠假單胞菌(CCTCCAB93066)的抑制試驗(yàn)涂平板法①將銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeroginosa)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取800μl加入到滅菌試管中，然后分別向試管加入200μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入200μl 1％BSA和200μl的卡那霉素(終濃度為20μg/ml)；②從37℃，250轉(zhuǎn)培養(yǎng)6小時(shí)后的各試管菌液做適當(dāng)?shù)南♂尯?，?0μl涂布平板，以確保陰性對(duì)照菌形成的菌落數(shù)為50-300個(gè)，以便進(jìn)行計(jì)數(shù)；③第一輪確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，對(duì)銅綠假單胞菌仍然無(wú)抑制效果。
96孔板培養(yǎng)法(1)將銅綠假單胞菌培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的卡那霉素(終濃度為20μg/ml)；(2)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；(3)確定藥物BmKAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前(1)(2)步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1對(duì)綠假單胞菌的最低抑制濃度大于100μg/ml。
實(shí)施例20蝎毒肽BmKAMP1突變體的分子設(shè)計(jì)根據(jù)BmKAMP1的成熟肽序列，利用軟件ANTHEPROT 2000顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，BmKAMP1具有典型的兩親性(amphiphilic)α-Helix結(jié)構(gòu)。基于BmKAMP1成熟肽氨基酸序列的α-Helix結(jié)構(gòu)，兩親性和等電點(diǎn)，采用點(diǎn)突變將BmKAMP1成熟肽氨基酸序列的第3位Gly變?yōu)锳rg，第6位Pro變?yōu)長(zhǎng)ys，第10位Gly變?yōu)長(zhǎng)ys和第11位Gly變?yōu)锳rg。其突變型蝎毒抗菌肽BmKAMP1-M的氨基酸序列為FIKRIARLLRKIF-NH2，其序列為SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
實(shí)施例21蝎毒肽突變體BmKAMP1-M藥物對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制試驗(yàn)96孔板培養(yǎng)法①分別將大腸桿菌、銅綠假單胞菌(革蘭氏陰性菌)和金黃色葡萄球菌、滕黃微球菌陽(yáng)、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1-M，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的卡那霉素(革蘭氏陰性菌終濃度為20μg/ml)或青霉素(革蘭氏陽(yáng)性菌終濃度為50μg/ml)；②37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；③確定藥物BmKAMP1-M的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1-M對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度。突變型蝎毒抗菌肽BmKAMP1-M對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的MIC為3μg/ml、對(duì)滕黃微球菌的MIC為50μg/ml、對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為6μg/ml、對(duì)蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度MIC為10μg/ml，而BmKAMP1-M對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的MIC為10μg/ml、對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為50μg/ml。突變型BmKAMP1-M與野生型BmKAMP1相比，其對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性大大增強(qiáng)。
實(shí)施例22BmKAMP1和BmKAMP1-M藥物對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的抑制試驗(yàn)?zāi)退幦苎云咸亚蚓旰笔D幼保健院檢驗(yàn)科急性分離的一株溶血性葡萄球菌，經(jīng)鑒定為MRCNS(頭孢類抗生素耐受)，編號(hào)“1538”。
96孔板培養(yǎng)法①將耐藥溶血性葡萄球菌培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的BmKAMP1或BmKAMP1-M，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；②37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；③確定藥物BmKAMP1或BmKAMP1-M的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽BmKAMP1和BmKAMP1-M對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的最低抑制濃度分別為5μg/ml和2.5μg/ml。
抑菌斑實(shí)驗(yàn)法新鮮接種的耐藥溶血性葡萄球菌斑培養(yǎng)過(guò)夜，用無(wú)菌的醫(yī)用棉簽挑取菌落，用無(wú)菌的生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛?，用無(wú)菌棉簽將上述菌懸液均勻涂布到9cm平板；向已經(jīng)滅菌好的直徑為5mm的濾紙片上加20μl多肽溶液，使紙片上最終含50μg多肽，然后將此紙片貼到平板上。陰性對(duì)照為20μl 1％BSA，陽(yáng)性對(duì)照為英國(guó)Oxoid公司生產(chǎn)的含有抗生素的濾紙片，分別為紅霉素(15μg)和萬(wàn)古霉素(30μg)；待紙片貼好后，將平板倒置培養(yǎng)過(guò)夜，觀察抑菌斑大小。其結(jié)果是紅霉素樣品和1％BSA都沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈，而萬(wàn)古霉素樣品有20mm的抑菌圈，蝎毒抗菌肽BmKAMP1和BmKAMP1-M藥物的抑菌圈大小分別為12mm和14mm。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種東亞鉗蝎抗菌肽基因及制備方法和應(yīng)用<130>一種東亞鉗蝎抗菌肽基因及制備方法和應(yīng)用<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>338<212>DNA<213>Mesobuthus martensi<400>1ttcctctgtg aaagtaagtt ctgtgaaact cactcttcga taaaatgaaa tctcagacct 60ttttccttct ttttctagtt gttttattat tagcaatttc acaatcagaa gctttcattg 120gtgctgttgc tagtcttctc tctaaaattt ttggaaaaag aagtatgaga gatatggata 180ctatgaaata cttatatgaa ccaagtttga gtgcagctga cttgaaaacc ttacaaaaac 240taatggaaaa ttactgatta tttgaatata ataatgttat ctctatttta gattataaat 300atttcttttg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 338<210>2<211>13<212>PRT<213>Mesobuthus martensi<400>2Phe Ile Gly Ala Ile Ala Arg Leu Leu Ser Lys Ile Phe1 5 10
<210>3<211>13<212>PRT<213>Mesobuthus martensi<400>3Phe Ile Lys Arg Ile Ala Arg Leu Leu Arg Lys Ile Phe1 5 10
權(quán)利要求
1.一種東亞鉗蝎抗菌肽重組大腸桿菌，其特征在于蝎毒抗菌肽重組大腸桿菌Escherichia coli DH5a/BmKAMP1，CCTCC NOM207036。
2.一種分離的抗菌肽基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的一種東亞鉗蝎抗菌肽重組大腸桿菌的制備方法，它包括下列步驟A、構(gòu)建的東亞鉗蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)；B、以步驟A毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，通過(guò)PCR的方法篩選到了一個(gè)克隆子I5，為一種抗菌肽基因；C、采用化學(xué)合成的方法，獲得了蝎毒抗菌肽BmKAMP1和BmKAMP1-M。
6.一種東亞鉗蝎抗菌肽在制備治療或預(yù)防對(duì)革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種東亞鉗蝎抗菌肽基因及制備方法和應(yīng)用，其特征是蝎毒抗菌肽重組大腸桿菌Escherichia coli DH5a/BmKAMP
文檔編號(hào)A61K38/17GK101063102SQ20071005196
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者曹志賤, 李文鑫, 戴潮, 吳英亮, 蔣達(dá)和, 毛歆, 劉輝 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)