核苷酸序列的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了SEQ?ID?NO.1或2所示的核苷酸序列在制備者治療惡性乳腺癌的藥物中的用途。本發(fā)明還公開了一種治療惡性乳腺癌的藥物。本發(fā)明公開的核苷酸序列是診斷惡性乳腺癌的靶標(biāo)位點，可用于快速篩選治療乳腺癌的藥物，本發(fā)明公開的藥物可用于治療惡性乳腺癌，具有實際應(yīng)用價值。
【專利說明】核苷酸序列的用途
[0001]本申請是專利申請?zhí)?201210243379.x, 申請人::?盧州醫(yī)學(xué)院，申請日:2012年7月13日的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及核苷酸序列的用途，具體涉及調(diào)控ERa表達(dá)的核苷酸序列序列的用途。
【背景技術(shù)】
[0003]乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于40~60歲絕經(jīng)前后的婦女，發(fā)病率僅次于胃癌和肺癌，并有逐年上升的趨勢。乳腺癌的治療方式眾多，包括外科治療、化學(xué)治療、放射治療和中醫(yī)中藥治療。外科治療主要方式是手術(shù)切除，化學(xué)治療包括手術(shù)前、中和后的化療，放射治療是作為手術(shù)后補(bǔ)充治療或晚期、復(fù)發(fā)病例的姑息治療，中醫(yī)中藥治療是我國傳統(tǒng)治療方法，可改善患者的全身情況，減輕化、放療的反應(yīng)，常作為手術(shù)、放射治療的輔助手段。大量研究表明，不同亞型的乳腺癌之間具有不同的生物學(xué)特征，并不是任意一種乳腺癌治療方法對所有的患者都適用。
[0004]雌激素受體(ERa )是與乳腺癌密切相關(guān)的小分子，大多數(shù)乳腺癌發(fā)生最初，表達(dá)雌激素受體(ERa)，并依賴雌激素生長，對激素敏感、抗性弱，預(yù)后好，治療難度小。隨著病程發(fā)展，一些乳腺癌不再表達(dá)ER α，獲得非依賴雌激素的特征，對激素的敏感性差、抗性強(qiáng)，預(yù)后差，治療難度大，屬于惡性乳腺癌，恢復(fù)ER α表達(dá)后可以恢復(fù)乳腺癌恢復(fù)激素治療的敏感性，治療難度降低。
[0005]因此，可以通過檢測乳腺癌細(xì)胞ERa表達(dá)水平，判斷乳腺癌是否為惡性乳腺癌，還可以通過控制ERa的表達(dá)改善乳腺癌的惡性程度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的發(fā)明目的之一是提供ERa基因上的TWIST蛋白結(jié)合位點。本發(fā)明另一發(fā)明目的是提供檢測前述結(jié)合位點與TWIST蛋白是否結(jié)合的試劑盒，以及抑制前述結(jié)合位點與TWIST蛋白結(jié)合的藥物。
[0007]上述ERa基因上的TWIST蛋白結(jié)合位點，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，該位點含有601個堿基，其中，長度為332bp的序列是TWIST蛋白結(jié)合的關(guān)鍵序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。用基因工程的方法，可將SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所式的核苷酸序列克隆到其他載體上，形成重組載體，如，pGL-332ER a -Pro-Luc重組質(zhì)粒。
[0008]NuRD復(fù)合體是一個多亞基的復(fù)合體，包括ATP酶部分和組蛋白脫乙酰酶部分，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄抑制，TffIST蛋白通過募集Nu`RD復(fù)合體，結(jié)合到ERa基因的SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示序列區(qū)域上，抑制ERa表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌惡化。
[0009]因此，一方面，可以通過檢測TWIST蛋白是否結(jié)合到ER α基因的SEQ IDN0.1或者SEQ ID N0.2所示序列的區(qū)域上，確定待檢乳腺癌是否為惡性乳腺癌，檢測試劑盒包括任選的用于檢測TWIST蛋白與SEQ ID N0.1或者SEQ IDN0.2所示核苷酸序列的結(jié)合物的試劑。該檢測試劑可以為染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)用試劑和擴(kuò)增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的試劑。優(yōu)選地，所述染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)用試劑包括抗TWIST蛋白抗體，所述擴(kuò)增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的試劑包括SEQ IDN0.7~8所示的引物對2。[0010]另一方面，可以通過抑制TWIST蛋白或者NuRD復(fù)合體結(jié)合到ERa基因的SEQ IDN0.1或者SEQ ID N0.2所示序列的區(qū)域上，使ERa表達(dá)陽性，恢復(fù)惡性乳腺癌對激素敏感性。TWIST基因沉默劑可抑制TWIST基因表達(dá)，降低TWIST蛋白含量，抑制TWIST蛋白結(jié)合到ERa基因上，可以作為治療惡性乳腺癌的藥物。組蛋白脫乙酰酶抑制劑及其衍生物可以抑制被募集到ERa基因上的NuRD復(fù)合體的活性，也可以作為治療惡性乳腺癌的藥物。優(yōu)選地，所述的TWIST基因沉默劑為沉默TWIST基因的shRNA (shTWIST或者shT)，其中，與TffIST基因相匹配的特異性核苷酸序列如SEQ ID N0.19所示，shRNA全長如SEQ ID N0.20所示；所述的組蛋白脫乙酰酶抑制劑為曲古抑素A。SEQ ID N0.19所示的核苷酸序列是與TffIST基因相匹配的特異性核苷酸序列，能與TWIST特異性結(jié)合而沉默TWIST基因，該段序列為shRNA的核心序列，得到該序列后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)shRNA核心序列及載體性質(zhì)設(shè)計得到其余核苷酸序列，也可以人工合成小分子干擾RNA (Small interferingRNA，siRNA)試劑。
[0011]本發(fā)明所述惡性乳腺癌，是指乳腺癌細(xì)胞中ERd表達(dá)呈陰性；TWIST蛋白(gpTffISTl蛋白)，是一種轉(zhuǎn)錄因子，為高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，在動物與人類的胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用，TWIST基因，編碼TWIST蛋白的核苷酸序列；shRNA是shorthairpin RNA的縮寫，譯為“短發(fā)夾RNA” ；與TWIST基因相匹配的特異性核苷酸序列:是指能與TWIST特異性結(jié)合而沉默TWIST基因的核苷酸序列。
[0012]本發(fā)明提供的了 SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示序列，是TWIST蛋白的結(jié)合位點，可作為惡性腫瘤乳腺癌患診斷和治療的靶標(biāo)基因，用于制備惡性乳腺癌檢測試劑，篩選治療惡性乳腺癌的藥物，具有實際利用價值。本發(fā)明提供的惡性乳腺癌檢測試劑盒能準(zhǔn)確檢測待檢組織是否為惡性乳腺癌，可用于早期監(jiān)控和檢測惡性乳腺癌，實施早期預(yù)防和治療，減少損害。本發(fā)明提供的藥物可以重啟ERa基因表達(dá)，恢復(fù)惡性乳腺癌對激素的敏感性，具有良好的市場應(yīng)用前景。
[0013]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0014]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1檢測TWIST蛋白在FLAG-TWIST HEK293細(xì)胞中ER α結(jié)合位點的ChIP高通量測序圖譜。(Chip即染色質(zhì)免疫沉淀)。
[0016]圖2ChIP_PCR 檢測結(jié)果。
[0017]圖3使用HA抗體和β-actin (下)進(jìn)行Western blot和突光素酶活性測定(上)進(jìn)行了三次重復(fù)試驗，p<0.001。
[0018]圖 4ChIP-re-ChIP 實驗分析 FLAG-TWIST 的 HEK293 和 FLAG 的 HEK293 對照細(xì)胞的結(jié)果。
[0019]圖5表達(dá)無靶向性shRNA (shCtrl)或靶向干擾TWIST mRNA(shT)的shRNAMDA-MB-435細(xì)胞用標(biāo)明的TWIST蛋白，MTA2, HDAC2或RbAp46抗體做ChIP分析結(jié)果圖。
[0020]圖6shCtrl或shT的MDA-MB-435細(xì)胞用乙?；蚣谆慕M蛋白H3K9抗體的ChIP分析結(jié)果圖。
[0021]圖 7 在 SUMl315，MDA-MB-435(MDA435)，
[0022]MDA-MB-231 (MDA231)，T47D和MCF-7人類乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行實時定量檢測逆轉(zhuǎn)錄PCR分析TWIST的mRNA水平⑴和ER a (E)，數(shù)據(jù)規(guī)范化到GAPDH的mRNA水平，表現(xiàn)為土平均標(biāo)準(zhǔn)差。
[0023]圖8Western blot分析人類乳腺癌細(xì)胞系的TWIST蛋白和ER α表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參蛋白。
[0024]圖9在TWIST陰性的T47D人類乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)TWIST后的TWIST和ERa的mRNAs由實時RT-PClUIUS，p〈0.001。注意過表達(dá)TWIST后ER α的mRNA表達(dá)降低了。
[0025]圖10轉(zhuǎn)染對照載體或TWIST蛋白表達(dá)載體的MCF-7細(xì)胞中Western blot分析ER a、E-cadherin、TWIST 蛋白和 β-actin。
[0026]圖11 在表達(dá)非靶性 shRNA (shCtrl)或 shRNA TWIST mRNA (shT)的 4T1 和MDA-MB-435 (MDA435)乳腺癌細(xì)胞中實時 RT-PCR 檢測 ER a mRNA 水平，**，p〈0.001。
[0027]圖12TSA對ER α表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。shTWIST或?qū)φ誷hRNA (shCtrl)的4T1和MDA-MB-435細(xì)胞用330nM的TSA(+)處理。使用ERa和β-actin蛋白抗體進(jìn)行印跡分析。
[0028]圖13半定量RT-PCR分析中國人女性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中ER α，TWIST和GAPDH的mRNA表達(dá)。
[0029]圖14免疫組化分析(棕色)人類乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中ERa，TffIST蛋白表達(dá)。用ERa，TWIST蛋白抗體對28位人類乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的組織免疫染色，圖片在顯微鏡400倍放大倍數(shù)下拍攝。
[0030]圖1528個人類乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織的免疫組織化學(xué)的TWIST蛋白和ER α的統(tǒng)計數(shù)據(jù)匯總。
[0031]圖16MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)TWIST蛋白的ChIP實驗檢測結(jié)果?！揪唧w實施方式】
[0032]實施例1TWIST蛋白與ERa基因TWIST蛋白結(jié)合位點結(jié)合可以抑制ERa基因表達(dá)
[0033]1、實驗材料
[0034](I)細(xì)胞系
[0035]HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系，HEK293T細(xì)胞系，均為市售品；可被Doxcycline (DOX)誘導(dǎo)的FLAG-TffIST 或者 FLAG 的 HEK293 穩(wěn)定細(xì)胞系，按照文獻(xiàn) Fu Junjiang, Li Qin, Tao He, JunQin, Jun Hong, Jiemin Wong, Lan Liao and Jian ming Xu.The TWIST/Mi2/NuRD ProteinComplex and its Essential Role in Cance r Metastasis.Cell Res:275-289(2011).所述方法制備。
[0036]2、實驗方法
[0037](一)FLAG-TffIST標(biāo)簽和單獨FLAG對照標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞的ChIP (染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù))實驗
[0038](I)將帶有FLAG-TWIST標(biāo)簽和單獨FLAG對照標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞在15cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到細(xì)胞密度達(dá)到65%時，加入0.1 μ g/ml的DOX誘導(dǎo)16h ；
[0039](2)步驟(1)細(xì)胞用福爾馬林交聯(lián)固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，3000g離心5分鐘；
[0040](3)洗滌沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制劑的溶液重懸沉淀物，后用超聲波破碎至DNA片段長度為200-500bp ；
[0041](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制劑的溶液重新洗滌和稀釋步驟(3)所得上清液，得樣本；[0042](5)每0.4ml步驟(4)所得樣本與6 μ I的M2-FLAG標(biāo)簽抗體珠混合，復(fù)合物在4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜；
[0043](6)抗體珠連續(xù)用ChIP I，II和III緩沖液和含有ImM DTT的TE buffer洗滌；
[0044](7)用5yg蛋白酶K洗脫和65°C消化蛋白-DNA復(fù)合物過夜，DNA從交聯(lián)蛋白中釋放出來；
[0045](8)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析和如下高通量測序及分析。
[0046](9)高通量測序及分析:將得到的DNA片段用T4DNA連接酶連接到oligo上構(gòu)建DNA庫后，高通量測序儀測序，序列讀數(shù)分析用BWA法在人類Mar.2006匯編(hgl8)中映出，用MACS鑒定出峰值和用整合的基因組瀏覽器(IGB)來觀察，詳見
[0047]http://www.affymetrix.com/partners programs/programs/developer/tools/download igb.affx。
[0048]10)根據(jù)步驟(9)的結(jié)果，分離和測定出調(diào)控ERa表達(dá)的DNA序列，序列如SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列。根據(jù)SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，設(shè)計三對引物進(jìn)行實時定量PCR，分析ChIP結(jié)果，驗證步驟(9)的結(jié)論。
[0049](二)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及熒光素報告分析
[0050](I)質(zhì)粒構(gòu)建
[0051]目的基因:位于人類ER α中內(nèi)含子7的TWIST蛋白結(jié)合區(qū)域的332bp的DNA片段。以人類基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到，擴(kuò)增引物(SEQ ID N0.3~4所示的引物):
[0052]ER a -BamHl-F(5，-cgcggatccGGGGGGAGGTTCTTCTTC-3，)
[0053]ER a -Sal1-R(5，-acgcgtcgacTTATTGCTCAGAAATAGTCATG-3，)。
[0054]將PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段用BamHl和SalI在37°C雙酶切3_5小時，用膠回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，與相同BamHl和SalI雙酶切和純化的pGL3-Pro-Luc載體(promega公司)連接和篩選陽性克隆，從而亞克隆到pGL3-Pro_Luc載體，從而構(gòu)建PGL-332ERa -Pro-Luc質(zhì)粒，克隆的DNA片段的序列正確性用DNA測序法證實，與SEQ IDN0.2相同。[0055](2)熒光素報告基因分析
[0056]HEK293T細(xì)胞在12孔板培養(yǎng)到密度為40%時，將一定量50ng的pGL3-Pro_Luc或 pGL-332ERa -Pro-Luc，一定量 120ng 的 pSG5-HA_TWIST 質(zhì)粒或 pSG5 空質(zhì)粒和 30ng 的β -半乳糖β -Gal表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染。
[0057]轉(zhuǎn)染2天后檢測熒光素酶效果和β -gal活性，每個樣本的熒光素酶活性都是被β -gal活性所標(biāo)準(zhǔn)化的，所有的實驗均重復(fù)三次。
[0058]3、實驗結(jié)果
[0059](一)FLAG-TWIST標(biāo)簽和單獨FLAG對照標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞的ChIP結(jié)果
[0060](I)關(guān)于FLAG-TWIST標(biāo)簽和單獨FLAG對照標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞的ChIP-高通量DNA測序結(jié)果如圖1所示，該圖說明人類ERa基因上只有一個TWIST蛋白結(jié)合位點，且該結(jié)合位點位于ER α基因內(nèi)含子7內(nèi)，定位在6號染色體上第152458103位，左右300bp，如SEQ ID N0.1所示。進(jìn)一步對其進(jìn)行序列分析，顯示該結(jié)合位點存在6個潛在的TWIST蛋白結(jié)合E-boxes (CANNTG)。根據(jù)該結(jié)果，設(shè)計三對引物:
[0061]引物對1: [0062]Pl (5，-tcacaccttgcttcgcatag-3，)
[0063]P2(5， -tgagctcagaaatccacttcc-3，)
[0064]用于擴(kuò)增ERa基因的內(nèi)含子I區(qū)域，確定該區(qū)域是否是陰性對照區(qū)域；
[0065]弓丨物對2:
[0066]P3(5， -agctgggctcactcacacat-3，)
[0067]P4(5， -gaggcatagagcagagtcacc-3，)
[0068]用于擴(kuò)增ERa基因的內(nèi)含子7區(qū)域，確定該區(qū)域是否含有TWIST蛋白結(jié)合位點；
[0069]引物對3:
[0070]P5(5， -acctgtgagcagggtgactt-3，)
[0071]P6(5， -acaaaaacccgcaacttcct—3，)
[0072]用于擴(kuò)增ERci基因的3’端
[0073]用于擴(kuò)增ERa基因3’端區(qū)域，確定該區(qū)域是否是陰性對照區(qū)域。
[0074](2)如圖2所示:用引物對2(P3/P4)擴(kuò)增ChIP分離的DNA樣本，比較FLAG-TWIST標(biāo)簽細(xì)胞和FLAG標(biāo)簽細(xì)胞，前者的擴(kuò)增量是后者的1200倍，而以引物對I (P1/P2)和引物對3 (P5/P6)擴(kuò)增ChIP分離的DNA樣本，均難以增得擴(kuò)增條帶。進(jìn)一步驗證了前述結(jié)論是正確的，也說明引物對2可以準(zhǔn)確擴(kuò)增包含TWIST蛋白結(jié)合位點的區(qū)域。
[0075](二)熒光素報告基因分析結(jié)果
[0076]如圖3所示:
[0077]當(dāng)pGL3-332ERa -Pr0-Luc報告基因質(zhì)粒和TWIST對照空載體共轉(zhuǎn)染入ΗΕΚ293Τ細(xì)胞時，TffIST蛋白不表達(dá)，熒光強(qiáng)度高；當(dāng)PGL3-332ERa -PiO-Luc報告基因質(zhì)粒和TWIST表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入ΗΕΚ293Τ細(xì)胞時，TffIST蛋白表達(dá)，熒光強(qiáng)度顯著低于前者。
[0078]當(dāng)pGL3-Pro_Luc報告基因質(zhì)粒和TWIST對照空載體共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞時，TWIST蛋白不表達(dá)，熒光強(qiáng)度高；當(dāng)pGL3-Pro-Luc報告基因質(zhì)粒和TWIST表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞時，TffIST蛋白表達(dá)，熒光強(qiáng)度與前者無顯著差異。
[0079]實驗說明，存在332bp的ERa序列時，過表達(dá)的TWIST蛋白顯著地抑制了報告基因的活性，缺乏332bp的ERa序列時，TWIST蛋白的過表達(dá)沒有抑制報告基因的活性，證明TWIST蛋白可以結(jié)合在如SEQ ID N0.2所示的長度為332bp的序列上，也就是說，SEQ IDN0.2所示的基因片段上面有TWIST蛋白結(jié)合位點，ER α基因的TWIST蛋白結(jié)合位點有轉(zhuǎn)錄抑制功能 。
[0080]實驗證明:人類ER α基因上存在TWIST蛋白結(jié)合位點，位于內(nèi)含子7內(nèi)，定位在6號染色體上第152458103位，左右300bp，如SEQ ID N0.1所示，其TWIST蛋白結(jié)合關(guān)鍵位點為SEQ ID N0.2所示的序列。而且，該TWIST蛋白結(jié)合位點與TWIST蛋白結(jié)合后，會抑制ERa基因的轉(zhuǎn)錄，因而，可以通過檢測ERa基因上的TWIST蛋白結(jié)合位點上是否結(jié)合了TWIST蛋白，確定ERa基因是否表達(dá)，也可以通過抑制ER α基因上的TWIST蛋白結(jié)合位點結(jié)合TWIST蛋白，恢復(fù)ER α的表達(dá)。
[0081]實施例2TWIST蛋白通過募集NuRD復(fù)合物到ERa基因TWIST蛋白結(jié)合區(qū)域上抑制ER α基因表達(dá)
[0082]1、實驗材料
[0083](I)細(xì)胞系--被 Doxcycline (DOX)誘導(dǎo)的 FLAG-TWIST 或者 FLAG 的 HEK293 穩(wěn)定細(xì)胞系，同實施例1。
[0084]MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系，是人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，能穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源性TWIST蛋白，市售品。
[0085]表達(dá)無靶向性的短發(fā)夾RNA (shRNA)或者可以表達(dá)能特異干擾TWIST信使RNA(mRNAs)的 shRNA 穩(wěn)定的 MDA-MB-435 細(xì)胞系。按照文獻(xiàn) Fu Junjiang, Li Qin, Tao He, JunQin, Jun Hong, Jiemin Wong, Lan Liao and Jian ming Xu.The TWIST/Mi2/NuRD ProteinComplex and its Essential Role in Cance r Metastasis.Cell Res:275-289(2011).所述方法制備。
[0086]2、實驗方法
[0087](一)FLAG-TWIST標(biāo)簽和單獨FLAG對照標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞的ChlP-re-ChlP實驗
[0088](1)將帶有FLAG-TWIST標(biāo)簽和單獨FLAG對照標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞在15cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到細(xì)胞密度達(dá)到65%時，加入0.1 μ g/ml的DOX誘導(dǎo)16h ；
[0089](2)步驟(1)細(xì)胞用福爾馬林交聯(lián)固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，3000g離心5分鐘；
[0090](3)洗滌沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制劑的溶液重懸沉淀物，后用超聲波破碎至DNA片段長度為200-500bp ;；
[0091](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制劑的溶液重新洗滌和稀釋步驟(3)所得上清液，得樣本；
[0092](5)每0.4ml步驟(4)所得樣本與6 μ I的M2-FLAG標(biāo)簽抗體珠混合，復(fù)合物在4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜；
[0093](6)抗體珠連續(xù)用ChIP I，II和III緩沖液和含有ImM DTT的TE buffer洗滌；
[0094](7)用Tris-buffered saline進(jìn)一步洗漆,用3XFLAG肽溶液將復(fù)合物洗脫下來；
[0095](8)被洗脫下來的材料用抗MTA2，HDAC2或Mi2抗體和瓊脂糖A/G珠抗體(M1-2, MTA2和HDAC2是NuRD復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)成分，)稀釋，4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜；[0096](9)用5yg蛋白酶K洗脫和65°C消化蛋白-DNA復(fù)合物過夜，DNA從交聯(lián)蛋白中釋放出來；
[0097](10)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析；
[0098](11)得ChIP-re-ChIP中分離出來的DNA樣本；
[0099](12)以引物對2
[0100]P3(5’ agctgggctcactcacacat-3J )
[0101]P4 (5’ -gaggcatagagcagagtcacc-3’)為引物，進(jìn)行實時定量 PCR,分析 ChIP 結(jié)果。
[0102](二)表達(dá)無靶向性的短發(fā)夾RNA (shRNA)或者可以表達(dá)能特異干擾TWIST信使RNA (mRNAs)的 shRNA (shT)穩(wěn)定的 MDA-MB-435 細(xì)胞的 ChlP-re-ChlP 實驗
[0103](I)表達(dá)無靶向性的短發(fā)夾RNA (shRNA)或者可以表達(dá)能特異干擾TWIST信使RNA(mRNAs)的shRNA穩(wěn)定的MDA-MB-435細(xì)胞在15cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到細(xì)胞密度至100% ；
[0104](2)步驟(1)細(xì)胞用福爾馬林交聯(lián)固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，3000g離心5分鐘；
[0105](3)洗滌沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制劑的溶液重懸沉淀物，后用超聲波破碎至DNA片段長度為200-500bp ；
[0106](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制劑的溶液重新洗滌和稀釋步驟(3)所得上清液，得樣本；
[0107](5)每0.4ml步驟(4)所得``樣本與6 μ I的抗TWIST蛋白抗體珠混合，4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜；
[0108](6)抗體珠連續(xù)用ChIP I，II和III緩沖液和含有ImM DTT的TE buffer洗滌；
[0109](7)用Tris-buffered saline進(jìn)一步洗漆,用3XFLAG肽溶液將復(fù)合物洗脫下來。
[0110](8)被洗脫下來的材料用抗MTA2，HDAC2, RbAp46,乙?；M蛋白H3K9和甲基化組蛋白H3K9的抗體(MTA2，HDAC2和RbAp46是NuRD復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)成分)混合，4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜；
[0111](9)用5yg蛋白酶K洗脫和65°C消化蛋白-DNA復(fù)合物過夜，DNA從交聯(lián)蛋白中釋放出來；
[0112](10)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析；
[0113](11)得ChIP-re-ChIP中分離出來的DNA樣本；
[0114](12)以引物對2
[0115]P3(5，-agctgggctcactcacacat-3J )
[0116]P4 (5’ -gaggcatagagcagagtcacc-3’)為引物，進(jìn)行實時定量 PCR,分析 ChIP 結(jié)果。
[0117]3、實驗結(jié)果
[0118](一)FLAG-TWIST標(biāo)簽和單獨FLAG對照標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞的ChlP-re-ChlP實驗
結(jié)果
[0119]如圖4所示，比較FLAG-TWIST標(biāo)簽細(xì)胞與FLAG標(biāo)簽細(xì)胞中，ERa基因的TWIST蛋白結(jié)合部位上M1-2，MTA2和HDAC2的量，前者是后者的100倍以上。說明了 HEK293細(xì)胞中，TffIST蛋白可以有效地將NuRD復(fù)合物募集到ERa基因上的TWIST蛋白結(jié)合區(qū)域。
[0120](二)表達(dá)無靶向性的短發(fā)夾RNA (shRNA)或者可以表達(dá)能特異干擾TWIST蛋白信使 RNA (mRNAs)的 shRNA 穩(wěn)定的 MDA-MB-435 細(xì)胞的 ChIP-re-ChIP 實驗結(jié)果
[0121]如圖5所示，表達(dá)無靶向性的shRNA的MDA-MB-435細(xì)胞中，ERa基因上MTA2, HDAC2和RbAp46均有募集，shRNA干擾使TWIST蛋白基因沉默的MDA-MB-435細(xì)胞中，這些因子幾乎未被募集到ERa基因上。NuRD復(fù)合物的核心成分能否結(jié)合到ERa基因上，與TWIST蛋白是否存在緊密相關(guān)，證實NuRD復(fù)合物的核心成分確實是與TWIST蛋白相互作用而募集到ERa基因上的TWIST蛋白結(jié)合區(qū)域。
[0122]如圖6所示，表達(dá)無靶向性的shRNA的MDA_MB_435細(xì)胞中，檢測出染色質(zhì)相關(guān)的組蛋白H3K9乙?；蛦渭谆f明NuRD復(fù)合物募集到了 ERa基因上，但是TWIST基因沉默的MDA-MB-435細(xì)胞中乙?；慕M蛋白H3K9增加，單甲基化的組蛋白H3K9減少，說明NuRD復(fù)合物沒有募集到ER α基因上。結(jié)果證明TWIST蛋白調(diào)節(jié)的NuRD復(fù)合物募集情況與ERa基因上TWIST蛋白結(jié)合染色質(zhì)區(qū)域被抑制的表觀遺傳染色質(zhì)修飾是一致的。
[0123]NuRD復(fù)合體是一個多亞基的復(fù)合體，包括ATP酶部分和組蛋白去乙?；?HDAC)酶部分，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄抑制，特別是表觀遺傳調(diào)控的轉(zhuǎn)錄抑制。實驗證明NuRD復(fù)合物的核心成分是與TWIST蛋白相互作用而募集到ERa基因TWIST蛋白結(jié)合區(qū)域上，進(jìn)一步抑制ERa基因的表達(dá)。
[0124]實施例3TWIST和NuRD復(fù)合物抑制ER α表達(dá)，沉默TWIST基因和HDAC活性抑制物能重新恢復(fù)乳腺癌細(xì)胞中ERa的表達(dá)
[0125]1、實驗材料
[0126](I)細(xì)胞系:
[0127]高分化的非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系:高表達(dá)ER α的T47D細(xì)胞系和MCF_7細(xì)胞系，它們?yōu)榉菒盒匀橄侔┘?xì)胞系；
[0128]低分化的轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系:ERa表達(dá)陰性的SUM1315細(xì)胞系、MDA_MB_435細(xì)胞系和MDA-MB-231細(xì)胞系，它們?yōu)閻盒匀橄侔┘?xì)胞系。
[0129]表達(dá)無靶向性的短發(fā)夾RNA (shRNA)或者可以表達(dá)能特異干擾TWIST信使RNA(mRNAs)(其核苷酸序列如SEQ ID N0.20所示)的shRNAs穩(wěn)定的4T1和MDA-MB-435細(xì)胞系，按照文獻(xiàn)Fu Junjiang, Li Qin, Tao He, Jun Qin, Jun Hong, Jiemin Wong, Lan Liao andJian ming Xu.The TWIST/Mi2/NuRD Protein Complex and its Essential Role in Cancer Metastasis.Cell Res: 275-289 (2011).所述方法制備。
[0130]2、實驗方法
[0131](I)ERa和TWIST表達(dá)水平的測量
[0132]通過RT-PCR和Western blot分析方法，檢測T47D細(xì)胞系、MCF-7細(xì)胞系、SUM1315細(xì)胞系、MDA-MB-435細(xì)胞系和MDA-MB-231細(xì)胞系中ERa ,TffIST的mRNA水平和ER a ,TWIST的蛋白水平。
[0133]RT-PCR:
[0134]Wlyg的人乳腺癌細(xì)胞總RNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫。
[0135]用qPCR MasterMix Plus (Eurogentec)和 StepOnePlus 實時 PCR 系統(tǒng)來進(jìn)行實時PCR:
[0136]引物5，-tcctaacttgctcttggacagg-3，和 5，-gtagccagcagcatgtcg-3，和 TaqManprobe22用來測量cDNA文庫中ERa cDNA的水平。[0137]引物5，-gggccggagacctagatg-3，和 5，_tttccaagaaaatctttggcata_3，和 TaqMan探針50用來檢測cDNA文庫中TWIST cDNA水平。
[0138]每個樣本的GAPDH mRNA在同樣的條件下反應(yīng)作為內(nèi)參來標(biāo)準(zhǔn)化檢測ER α和TWIST mRNAs 的水平。
[0139]Western blot:
[0140]TWISTl, E-cadherin, β-actin 和 HA-tag 抗體、單克隆 ER α 抗體(D-12)均為市售品。蛋白印跡方法的文獻(xiàn)見一傅俊江主編:精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)，中國醫(yī)藥科技出版社，2012年2月。
[0141](2)TWIST蛋白募集NuRD復(fù)合物包含有組蛋白脫乙酰酶，比如HDAC2。TrichostainA(TSA)，曲古抑素A是一種HDAC抑制物。
[0142]將TSA加入表達(dá)無靶向性的短發(fā)夾RNA (shRNA)或者可以表達(dá)能特異干擾TWIST信使RNA (mRNAs)的shRNA穩(wěn)定的4T1和MDA-MB-435細(xì)胞系中，檢測ERa的表達(dá)水平。
[0143]3、實驗結(jié)果
[0144]如圖7~8所示，在ERa表達(dá)陰性的SUM1315和MDA-MB-435細(xì)胞系中檢出高水平的TWISTmRNA和蛋白質(zhì)，在ER α表達(dá)陰性的MDA-MB-231細(xì)胞系中也檢出低水平的TWIST蛋白；高表達(dá)ER α的T47D和MCF-7細(xì)胞中沒有檢測出TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)水平。如圖9~10所示，T47D細(xì)胞中，過表達(dá)TWIST抑制了 ERa的mRNA的表達(dá)；MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)TWIST蛋白抑制了 ERa的蛋白水平；如圖11所示，細(xì)胞系中TWIST基因沉默，使ER α的mRNA表達(dá)提高了 2.5-3倍。結(jié)果顯示在這些細(xì)胞系中ER α的表達(dá)與TWIST蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
[0145]如圖12所示，同它們各 自的空白處理組相比，表達(dá)無靶向性shRNA的TSA處理4T1和MDA-MB-435細(xì)胞中表達(dá)出更高水平的ER α蛋白(Compare lanelwith lane2andlane5with lane6) ；TSA 分別處理 shRNA 沉默 TffIST 基因的 4T1 和 MDA-MB-435 細(xì)胞中，ER α 蛋白水平并沒有顯著增加。(compare the ratios of ER a to β -actin in lane4withIanes2and3and in lane8with Ianes6and7)。實驗一方面說明 ERa 的表達(dá)與 TWIST 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，另一方面說明沉默TWIST基因或抑制NuRD中HDAC的活性都能夠有效地減輕ERa基因的轉(zhuǎn)錄抑制。
[0146]因此，實驗證明，ER α的表達(dá)被TWIST蛋白抑制，且TWIST蛋白是通過募集NuRD復(fù)合物來抑制ER α的表達(dá)。另一方面，HDAC酶抑制劑-TSA能夠阻斷TWIST和NuRD復(fù)合物的功能。
[0147]基于ERa的丟失導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞在內(nèi)分泌激素治療中所獲得的抗藥性，對乳腺癌治療是個巨大的挑戰(zhàn)，重新恢復(fù)ER α的表達(dá)對乳腺癌恢復(fù)激素治療的敏感性具有重大意義。因而，TSA及其衍生物和沉默TWIST基因的shRNA (TWIST基因相匹配的特異性核苷酸序列如SEQ ID N0.19所示的)，均可以阻斷TWIST和NuRD復(fù)合物對ER α表達(dá)的抑制，可重新恢復(fù)乳腺癌細(xì)胞中ERa的表達(dá)，而恢復(fù)乳腺癌對激素治療的敏感性。
[0148]實施例4人體乳腺癌細(xì)胞中TWIST蛋白抑制ERa表達(dá)
[0149]1、實驗材料:乳腺癌腫瘤和總RNA分離
[0150]在取得知情同意書的情況下，在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收集了 28個乳腺侵襲性導(dǎo)管癌的組織樣本。所有的實驗設(shè)計過程得到了瀘州醫(yī)學(xué)院的同意。所有患者年齡是33到72歲的中國婦女。在這一階段，沒有患者的存活數(shù)據(jù)是可用的。取下的乳腺癌組織立刻用液氮速凍，放_80°C保存。用TRIZOL試劑盒從細(xì)胞中分離總RNA —樣從乳腺癌組織中分離出總RNA，放-80°C保存。
[0151]2、實驗方法
[0152](I)用半定量PCR來分析mRNA表達(dá)
[0153]Wlyg的人乳腺癌細(xì)胞總RNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫。
[0154]設(shè)計特定引物，用乳腺癌mRNA樣本做半定量RT-PCR:
[0155]RT-ERα -5(5，-gtgcctggctagagatcctg-3，)和 RT-ER α -3(5，-agagacttcagggtgctgga-3’ )來逆轉(zhuǎn)錄和半定量PCR來檢測ER α的mRNA ；
[0156]RT-TffIST-5(5，_acgagctggactccaagatg_3，)和 RT-TWIST-3(5，-cacgccctgtttctttgaat-3’ )用來檢測 TWIST 的 mRNA。[0157]每個樣本的GAPDH mRNA在同樣的條件下反應(yīng)作為內(nèi)參來標(biāo)準(zhǔn)化檢測ER α和TWIST mRNAs 的水平。
[0158]總RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法的文獻(xiàn)見一傅俊江主編:精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)，中國醫(yī)藥科技出版社，2012年2月)。
[0159](2)免疫組化
[0160]乳腺癌組織被固定在10%的福爾馬林中，石蠟包埋用來做免疫組化:
[0161]取4μπι厚的上述乳腺癌組織在二甲苯中去石蠟，在梯度酒精和蒸餾水中水化；
[0162]抗原修復(fù)后，用0.3%過氧化氫在甲醇中封阻內(nèi)源性過氧化物酶活性，30分鐘，用I XPBS洗滌，5%兔血清孵育30min來封阻非特異性背景；
[0163]載玻片用TWIST單克隆抗體或ERa抗體在含有2%血清和1%BSA的Tris-bufferedsaline中4°C孵育過夜:
[0164]漂洗過的載玻片用適當(dāng)?shù)亩挂?:100稀釋，室溫孵育30min，之后用與過氧化物酶結(jié)合的過氧化物酶復(fù)合物孵育:
[0165]用DAB染色法來進(jìn)行免疫染色，用蘇木精復(fù)染，在光學(xué)顯微鏡下觀察。用包含有2%兔血清和1%BSA而沒有一抗的TBS來孵育對照載玻片作為陰性對照。
[0166]3、實驗結(jié)果
[0167]如圖13~15所示，有17位(61%)的腫瘤患者具有高水平的TWIST的mRNA與蛋白，和低水平或者無法檢測到ERa的mRNA和蛋白水平，7位(25%)的腫瘤患者具有低或者無法檢測到TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)水平以及高水平的ERa，2位(7%)腫瘤患者TWIST和ER α的mRNA和蛋白質(zhì)水平都增高，剩下2位(7%)腫瘤患者TWIST和ER α的mRNA和蛋白質(zhì)水平都降低。這些結(jié)果顯示在85.7%的侵襲性乳腺癌中TWIST的表達(dá)與ERa表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
[0168]臨床實驗證明，TWIST與ER α在臨床患者乳腺癌腫瘤中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示TWIST過表達(dá)會抑制ERa基因的表達(dá)。
[0169]實施例4惡性乳腺癌細(xì)胞檢測試劑盒及其使用方法
[0170]1、試劑盒的組成
[0171]①染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)用試劑:抗TWIST蛋白抗體和其他染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)常用試劑；[0172]②擴(kuò)增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的試劑:
[0173]引物對2:
[0174]上游引物:5，-agctgggctcactcacacat-3?
[0175]下游引物:5’-gaggcatagagcagagtcacc-3’
[0176]和其他擴(kuò)增核苷酸的常用試劑。
[0177]2、使用方法
[0178](I)取待測樣本組織和細(xì)胞；
[0179]( 2 )用本發(fā)明染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)用試劑對待測樣本進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀，獲得DNA分子混合物；
[0180](3)以步驟(2)所得DNA分子混合物為模板，提取DNA，用擴(kuò)增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的試劑進(jìn)行擴(kuò)增；
[0181](4)檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，若PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則待測樣本中存在TWIST蛋白與SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的結(jié)合物，若PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性，則待測樣本中不存在TWIST蛋白與SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的結(jié)合物。
[0182]3、驗證實驗:用本 發(fā)明試劑盒檢測MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞
[0183]1、實驗材料:MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系，市售品，是人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，ERa表達(dá)陰性，為惡性乳腺癌，能穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源性TWIST蛋白，其細(xì)胞內(nèi)存在TWIST蛋白與ERa基因上TWIST蛋白結(jié)合位點的結(jié)合物，用本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增應(yīng)當(dāng)?shù)玫綌U(kuò)增產(chǎn)物。
[0184]實驗方法:
[0185](I) MDA-MB-435細(xì)胞在15cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到細(xì)胞密度至100% ；
[0186](2)步驟(1)細(xì)胞用福爾馬林交聯(lián)固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，3000g離心5分鐘；
[0187](3)洗滌沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制劑的溶液重懸沉淀物，后用超聲波破碎至DNA片段長度為200-500bp ；
[0188](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制劑的溶液重新洗滌和稀釋步驟(3)所得上清液，得樣本；
[0189](5)每0.4ml步驟(4)所得樣本與6 μ I的抗TWIST蛋白抗體珠或者IgG抗體珠(其作為陰性對照)混合，復(fù)合物在4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜；
[0190](6)抗體珠連續(xù)用ChIP I，II和III緩沖液和含有ImM DTT的TE buffer洗滌；
[0191](7 )用5 μ g蛋白酶K混合和65 V消化蛋白-DNA復(fù)合物過夜，DNA從交聯(lián)蛋白中釋放出來；
[0192](8)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析；
[0193](9)以引物對2:
[0194]P3(5，-agctgggctcactcacacat-3J )
[0195]P4(5，-gaggcatagagcagagtcacc-3J )
[0196]為引物，定量PCR分析CHIP結(jié)果。
[0197]I1、實驗結(jié)果
[0198]用本發(fā)明試劑盒檢測該細(xì)胞系，以抗TWIST蛋白抗體作為抗體珠，陰性對照以IgG抗體作為抗體株，檢測結(jié)果如圖16所示，本發(fā)明試劑盒確實可以擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，而陰性對照則基本無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明本發(fā)明試劑盒可以準(zhǔn)確地檢測待檢樣本是否為惡性乳腺癌細(xì)胞。
[0199]綜上，本發(fā)明提供了 ERa基因上的TWIST蛋白結(jié)合位點，可用于惡性乳腺癌診斷試劑和治療藥物的開發(fā)；并提供了檢測TWIST蛋白是否結(jié)合在ERd基因上的試劑盒，可以準(zhǔn)確檢測待檢樣本是否為惡性乳腺癌；還提供了抑制TWIST蛋白和NuRD復(fù)合物結(jié)合到ERa基因上的藥物，可用于治療惡性乳腺癌， 臨床應(yīng)用前景良好。
【權(quán)利要求】
1.SEQ ID N0.1或2所示的核苷酸序列在制備者治療惡性乳腺癌的藥物中的用途。
2.一種治療惡性乳腺癌的藥物，其特征在于:所述的藥物是組蛋白脫乙酰酶抑制劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑衍生物或TWIST基因沉默劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于:所述的組蛋白脫乙酰酶抑制劑為曲古抑素A，所述的TWIST基因沉默劑為沉默TWIST基因的shRNA，其中，與TWIST基因相匹配的特異性核苷酸序列如SEQ ID N0.19所示。
4.一種如SEQ ID N0. 19所不的核苷酸序列。
【文檔編號】A61K31/165GK103509868SQ201310444284
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月9日
【發(fā)明者】傅俊江, 張連美 申請人:瀘州醫(yī)學(xué)院