用于治療tweak相關(guān)病癥的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于治療TWEAK相關(guān)病癥的方法和試劑，該病癥包括心臟、肝臟、腎臟、肺、脂肪、骨骼、肌肉、神經(jīng)、骨和軟骨的病癥。本發(fā)明還提供用于鑒定治療TWEAK相關(guān)病癥的TWEAK的激動劑或拮抗劑的方法。此外，本發(fā)明提供表達(dá)編碼TWEAK多肽或其片段、類似物或突變體的外源DNA的轉(zhuǎn)基因動物，以及用這種動物來鑒定TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。本發(fā)明還提供用于診斷基于TWEAK表達(dá)的疾病的方法。本發(fā)明還提供用TWEAK多肽、激動劑或拮抗劑來影響祖細(xì)胞的細(xì)胞分化的方法。
【專利說明】用于治療TWEAK相關(guān)病癥的方法
[0001]本申請是中國申請03813317.2的分案申請，該母案于2003年4月9日以國際申請?zhí)朠CT/US2003/011350提交，于2004年12月09日進(jìn)入中國國家階段，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于治療TWEAK相關(guān)病癥的方法和試劑，該病癥包括心臟、肝臟、腎臟、肺、脂肪、骨骼肌、神經(jīng)、骨、軟骨、皮膚、胃腸道、胰腺、生殖器官和結(jié)締組織疾病。本發(fā)明還涉及用于鑒定治療TWEAK相關(guān)病癥的TWEAK的激動劑或拮抗劑的方法。此外，本發(fā)明涉及表達(dá)編碼TWEAK多肽或其片段、類似物或突變體的外源DNA的轉(zhuǎn)基因動物，以及用這種動物來鑒定TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。本發(fā)明還涉及用于診斷基于TWEAK表達(dá)的疾病的方法。本發(fā)明還涉及用TWEAK多肽、激動劑或拮抗劑來影響祖細(xì)胞的細(xì)胞增生和分化的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]腫瘤壞死因子家族成員的配體因其結(jié)構(gòu)與TNF-α相似而如此命名，是各種過程如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫和凋亡中的重要成分。TNF配體可能作為II型膜結(jié)合蛋白通過直接細(xì)胞與細(xì)胞接觸而局部起作用，或作為具有自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌功能的分泌蛋白而起作用。TNF家族成員通過其C末端的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合TNF受體(TNF-R)成員。各種TNF家族成員包括 TNF、淋巴毒素(LT)、Fas、CD27、CD30、CD40、4-lBB、0X-40、TRAMP、CAR-l、TRAIL、GITR、HVEM、osteoprotegrin、NGF、TRAIN、Kay (BAFF)、APRIL 和 TWEAK (TNF 相關(guān)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力弱。
[0004]該細(xì)胞因子受體家族的特定特征在于富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，最早通過兩種不同的TNF受體的分子克隆來顯示。該家族的基因編碼糖蛋白，特征為I型跨膜蛋白具有細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，單一的跨膜結(jié)構(gòu)域和參與激活細(xì)胞功能的胞質(zhì)區(qū)域。富含半胱氨酸的配體結(jié)合區(qū)域具有一個緊密結(jié)合的二硫鍵連接的核心結(jié)構(gòu)域，根據(jù)特定的家族成員，該核心結(jié)構(gòu)域重復(fù)出現(xiàn)多次。絕大部分的受體具有四個結(jié)構(gòu)域，雖然可能少至I個或多達(dá)6個。
[0005]TNF家族成員在調(diào)控免疫系統(tǒng)中起作用，控制細(xì)胞存活和分化，以及在急性宿主防御系統(tǒng)如炎癥中起作用。本領(lǐng)域一直在嘗試操作TNF家族成員來產(chǎn)生治療性效果，這可能提供控制疾病的獨(dú)特方法。例如，該家族的一些配體能夠直接誘導(dǎo)許多被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的程序性死亡，如LT、TNF、Fas配體和TRAIL。Fas和可能TNF以及CD30受體的活化能夠在未被轉(zhuǎn)化的具有免疫調(diào)控功能的淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0006]誘導(dǎo)編程細(xì)胞死亡的能力是多個TNF家族成員的重要和被深入研究的特性。Fas介導(dǎo)的凋亡似乎在外周和可能在胸腺中起調(diào)控自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞的作用。此外，TNF和CD30系統(tǒng)與T細(xì)胞和大細(xì)胞退行發(fā)育的淋巴瘤細(xì)胞系的存活相關(guān)。這種細(xì)胞系對TNF、Fas或LT-β受體信號響應(yīng)的死亡具有凋亡的特征。[0007]TNF家族的配體抗原根據(jù)它們誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力被分成三類。首先，TNF、Fas配體和TRAIL能夠有效地在許多細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，其受體最可能具有極好的規(guī)則的死亡結(jié)構(gòu)域。大概DR-3的配體(TRAMP/WSL-1)也屬于這一類。接著是如TWEAK、⑶30配體和LTalb2等配體，其引起僅限于少數(shù)細(xì)胞的較為微弱的死亡信號。在這些系統(tǒng)中進(jìn)行的研究已經(jīng)證明，存在分開的較微弱的死亡信號機(jī)制。最后，存在不能有效地遞送死亡信號的成員?？赡芩蓄悇e的配體都對一些細(xì)胞類型產(chǎn)生抗增生作用，結(jié)果誘導(dǎo)細(xì)胞分化，如CD40。
[0008]總之，死亡是由位于TNF受體的胞質(zhì)一側(cè)的死亡結(jié)構(gòu)域集聚后引發(fā)的。這些死亡結(jié)構(gòu)域協(xié)調(diào)各種信號傳導(dǎo)成分的組裝，引起caspase級聯(lián)活化。一些受體缺乏規(guī)則的死亡結(jié)構(gòu)域，如LTb受體和CD30，但是能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，盡管較為微弱。相反，通過其他路徑如CD40發(fā)送信號是維持細(xì)胞存活所必需的。還需要進(jìn)一步鑒定和表征TNF家族成員的功能，從而便于開發(fā)用于TNF家族相關(guān)疾病的新治療方法。
[0009]TWEAK在篩選雜交到促紅細(xì)胞生成素探針的RNA中被分離。Chicheportiche等，J.Biol.Chem.272:32401-32410 (1997) 0小鼠和人的肽具有異乎尋常的高度保守性，包括在受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有93%氨基酸同一性。TffEAK被證實(shí)高效地從細(xì)胞中分泌，在許多組織中豐富地被表達(dá)，包括心臟、大腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、闌尾和外周血 液淋巴細(xì)胞。
[0010]一種已知的TWEAK受體是Fnl4，生長因子調(diào)節(jié)的立即早期反應(yīng)基因，其降低對細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞附著和減弱血清刺激的生長和遷移(Me i ghan-Mantha等，J.B i ο 1.Chem.274:33166-33176(1999))。Fnl4已經(jīng)被證明會被FGF、小牛血清和氟波醇酯(phorbolester)處理誘導(dǎo)，并且在心臟、腎臟、肺、皮膚、骨骼肌、卵巢和胰腺組織中，以及在肝細(xì)胞癌模型和其他癌細(xì)胞系中以相對高的水平被表達(dá)，在正常肝臟組織中以較低水平被表達(dá)。
[0011]TffEAK與許多生物學(xué)過程相關(guān)。例如，用IFN- Y和TWEAK處理的HT29細(xì)胞被證明發(fā)生凋亡；盡管TWEAK誘導(dǎo)凋亡的能力是微弱的，并且僅少數(shù)細(xì)胞類型易感。Chich印ortiche 等，J.Biol.Chem.272:32401-32410(1997)。相反，TWEAK 已經(jīng)被證明在不依賴VEGF的路徑中誘導(dǎo)血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞增生。Lynch等，J.Biol.Chem.274:8455-8459 (1999)。星細(xì)胞被TWEAK特異地結(jié)合和刺激。TWEAK能夠滲入發(fā)炎的大腦中來影響星細(xì)胞的行為。暴露于TWEAK的星細(xì)胞分泌大量IL-6和IL-8，并上調(diào)ICAM-1表達(dá)。Saas 等，GLIA32:102-107 (2000)。
[0012]TffEAK還與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)相關(guān)。在用IFN- Y刺激時，單核細(xì)胞迅速地表達(dá)TWEAK，抗TWEAK的抗體部分地抑制它們對人鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性?？筎WEAK和抗TRAIL的抗體的結(jié)合幾乎完全抑制細(xì)胞毒性。Nakayama等，J.Exp.Med.192:1373-1379(2000)。相反TWEAK的mRNA在用脂多糖(LPS)處理的小鼠中迅速消失，脂多糖是免疫炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)物。此外，在小鼠模型的自體免疫溶血性貧血和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，TWEAK的mRNA也減少。這些數(shù)據(jù)表明，下調(diào)TWEAK的表達(dá)是急性和慢性炎癥中的重要事件。Chicheportiche 等，Biochem.Biophys.Res.Comm.279:162-165 (2000)。
[0013]當(dāng)前，本領(lǐng)域缺乏對哪些病癥或疾病與TWEAK表達(dá)和功能相關(guān)的完整了解，包括TffEAK在炎癥和非炎癥病癥中的作用。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本發(fā)明涉及TWEAK對于促進(jìn)各種病理狀況的嚴(yán)重性和進(jìn)展中的作用，包括多種組織和器官系統(tǒng)的疾病。這種病理狀況包括急性心臟損傷，慢性心力衰竭，非炎癥性充血性心肌病，充血性心力衰竭，肝臟上皮細(xì)胞增生，肝細(xì)胞死亡，肝臟纖維變性，肝細(xì)胞液泡化，其他肝臟損傷，膽管病癥，包括膽管增生，炎癥性腎臟病癥，如多病灶(multifocal)炎癥性、非炎癥性腎臟病癥，如腎小管腎病，腎小管增生，腎小球囊腫，腎小球腎病，Alport綜合癥，腎小管液泡化，腎透明管型(kidney hyaline cast)，腎纖維變性和炎癥性肺病，本發(fā)明建立了 TWEAK分子與某些心臟、肝臟、腎臟和肺疾病之間的因果關(guān)系。在此公開的本發(fā)明還建立了 TWEAK與肝臟組織、腎小管、皮膚細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌、軟骨和骨的祖細(xì)胞，以及結(jié)締組織細(xì)胞類型，如骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞，以及成纖維細(xì)胞的行為之間的聯(lián)系。
[0016]在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療TWEAK相關(guān)病癥的方法，所述病癥即其中TWEAK的受體如FN14被表達(dá)的各種疾病，損傷情況或組織的其他病理狀況。這些病癥包括纖維變性，心肌病，和腎臟、肺、肝臟、皮膚、骨骼肌、脂肪代謝(如肥胖)、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經(jīng)組織(包括神經(jīng)退行性病變)，軟骨、骨和結(jié)締組織的疾病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，TWEAK相關(guān)病癥實(shí)質(zhì)上是非炎癥性的。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過干擾TffEAK與其分子受體之間的相互作用來治療TWEAK相關(guān)病癥的方法。
[0017]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及TWEAK激動劑或拮抗劑，和包含它們的用于治療TWEAK相關(guān)病癥的藥物組合物。這種TWEAK激動劑或拮抗劑(即抑制劑)可能是抗TffEAK抗體或其衍生物；抗TWEAK受體抗體或其衍生物；TWEAK多肽片段；TWEAK多肽類似物；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽片段；TWEAK受體多肽類似物；TWEAK受體突變蛋白；TWE AK受體模擬物；TWEAK受體融合蛋白；有機(jī)化合物；和無機(jī)化合物。
[0018]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及TWEAK激動劑或拮抗劑和用于治療需要組織再生或替換的宿主的藥物組合物。還涉及TWEAK激動劑或拮抗劑在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)祖細(xì)胞(progenitor)的群體的行為中的用途。該祖細(xì)胞可以是肝臟細(xì)胞類型、腎小管、心肌細(xì)胞、肺細(xì)胞類型、皮膚細(xì)胞類型、骨骼肌細(xì)胞類型、脂肪細(xì)胞、胃腸細(xì)胞類型、胰腺細(xì)胞類型、神經(jīng)組織細(xì)胞類型、軟骨和骨細(xì)胞類型、結(jié)締組織細(xì)胞類型的前體(precursor)細(xì)胞,包括骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。TWEAK激動劑或拮抗劑以及包含它們的藥物組合物可以被體內(nèi)施用來促進(jìn)在疾病或組織損傷狀況下的組織再生和替換，包括但不限于毒素、病毒、化學(xué)治療或放射物導(dǎo)致的損害，和遺傳性或退化性異常。在另一個實(shí)施方案中，TWEAK激動劑或拮抗劑和它們的藥物組合物可以與用干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞治療聯(lián)合，用于再生組織和器官系統(tǒng)。在另一個實(shí)施方案中，干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體可以在體外用TWEAK激動劑或拮抗劑以及它們的組合物擴(kuò)增。通過使用TWEAK激動劑或拮抗劑擴(kuò)增的祖細(xì)胞群體可以被移植到需要再生或替換組織的宿主中。
[0019]在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定用作TWEAK相關(guān)病癥治療的治療劑的TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及表達(dá)編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括TWEAK作為疾病的分子標(biāo)志的用途。
[0020]更具體地，本發(fā)明涉及
[0021 ] 1.一種用于治療機(jī)體中的TWEAK相關(guān)病癥的方法，包括將TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑施用給所述機(jī)體的步驟，其中所述TWEAK相關(guān)病癥選自纖維變性；心臟病；肝臟疾??；肺部疾??；腎臟疾病；皮膚病；骨骼肌疾?。恢窘M織疾?。晃改c道疾?。灰认偌膊。簧称鞴偌膊?；神經(jīng)疾病；軟骨疾??；骨??；結(jié)締組織疾??；細(xì)胞死亡；或表達(dá)TWEAK受體的組織的病理狀況。
[0022]2.項(xiàng)I的方法，其中所述TWEAK相關(guān)病癥是非炎癥的病癥。
[0023]3.項(xiàng)2的方法，其中所述TWEAK相關(guān)病癥是非炎癥性的心肌病。 [0024]4.項(xiàng)I或2的方法，其中所述表達(dá)TWEAK受體的組織的病理狀況選自:纖維變性；心肌病；腎臟病癥；肺部病癥；肝臟病癥；皮膚病癥；骨骼肌病癥；脂肪組織病癥；胃腸道病癥；胰腺病癥；生殖器官病癥神經(jīng)組織病癥；軟骨病癥；骨病癥；或結(jié)締組織病癥。
[0025]5.項(xiàng)I或2的方法，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑選自:抗TffEAK抗體；抗TWEAK受體的抗體；TWEAK多肽片段；TWEAK多肽類似物；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽片段；TWEAK受體多肽類似物；TWEAK受體突變蛋白；TWEAK受體模擬物；TWEAK受體融合蛋白；有機(jī)化合物；或無機(jī)化合物。
[0026]6.項(xiàng)I或2的方法，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑被施用給所述機(jī)體，給藥途徑選自:注射、經(jīng)粘膜、口服、吸入、眼部、直腸、支架植入、體表、胃腸外、長效植入、緩釋、基因治療或耳朵的路徑。
[0027]7.項(xiàng)I或2的方法，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑在呈遞的劑型中，該劑型選自片劑、藥丸、脂質(zhì)體、顆粒、球體、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、果汁、糖漿、懸浮液、支架包被或緩釋制劑。
[0028]8.一種用于治療機(jī)體中的TWEAK相關(guān)病癥的方法，包括將能夠干擾第一種TWEAK多肽與分子的作用的TWEAK拮抗劑施用給所述機(jī)體的步驟，所述分子選自:細(xì)胞受體、第二種TWEAK多肽和與TWEAK相互作用的配偶體。
[0029]9.用于鑒定作為TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑的化合物的方法，包括步驟:(a)將表達(dá)編碼TWEAK多肽、或其片段或突變蛋白的外源DNA的試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因動物暴露于所述化合物；(b)將來自所述試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、月旨肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經(jīng)、軟骨、骨或結(jié)締組織與來自表達(dá)外源DNA但是不被暴露于所述化合物的參比動物的相應(yīng)的器官或組織比較；和(c)確定該化合物是否影響所述試驗(yàn)動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經(jīng)、軟骨、骨或結(jié)締組織。
[0030]10.項(xiàng)9的方法，其中所述化合物選自=TWEAK多肽；TWEAK多肽片段；TWEAK多肽類似物；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽；TWEAK受體多肽片段；TWEAK受體多肽類似物；TWEAK受體突變蛋白；TWEAK受體模擬物；TWEAK受體融合蛋白；有機(jī)化合物；或無機(jī)化合物。
[0031]11.項(xiàng)9的方法，其中所述化合物是抗一種抗原的抗體，該抗原選自:TWEAK多肽；TffEAK多肽片段；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽；TWEAK受體片段；TWEAK受體突變蛋白；TWEAK受體模擬物；TWEAK受體融合蛋白；表達(dá)TWEAK多肽，其片段、突變蛋白或融合蛋白的細(xì)胞；和表達(dá)TWEAK受體多肽，其片段、突變蛋白或融合蛋白的細(xì)胞。
[0032]12.項(xiàng)9的方法，其中所述試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因動物和所述參比轉(zhuǎn)基因動物各選自:小鼠；大鼠；倉鼠；兔；狗；貓；牛；豬；山羊?’馬;綿羊；豚鼠；鳥；靈長類；魚；兩棲類；昆蟲；或無脊椎動物。[0033]13.項(xiàng)9的方法鑒定的化合物，其中所述化合物選自=TWEAK多肽；TWEAK多肽片段；TWEAK多肽類似物；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽；TffEAK受體多肽片段；TWEAK受體多肽類似物；TWEAK受體突變蛋白；TWEAK受體模擬物；TffEAK受體融合蛋白；抗TWEAK多肽的抗體，或其片段、類似物、突變蛋白、模擬物或融合蛋白；抗TWEAK受體多肽，或其片段、類似物、突變蛋白、模擬物或融合蛋白的抗體；有機(jī)化合物；或無機(jī)化合物。
[0034]14.項(xiàng)13的化合物，其中所述抗體是多克隆抗體。
[0035]15.項(xiàng)13的化合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
[0036]16.項(xiàng)15的化合物，其中所述單克隆抗體是人源化抗體。
[0037]17.項(xiàng)14或15的化合物，其中所述抗體是異種抗體。
[0038]18.一種表達(dá)編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述表達(dá)導(dǎo)致選自如下的病癥:纖維變 性；心肌?。荒I臟疾??；肝臟疾??；肺疾?。黄つw疾??；骨骼肌疾?。恢窘M織疾病；胃腸道疾??；胰腺疾病；生殖器官疾?。簧窠?jīng)疾??；軟骨疾??；骨病；結(jié)締組織疾??；或細(xì)胞死亡。
[0039]19.項(xiàng)18的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物選自:小鼠；大鼠；倉鼠；兔；狗；貓；牛;豬；山羊；馬；綿羊；豚鼠；鳥；靈長類；魚；兩棲類；昆蟲；或無脊椎動物。
[0040]20.項(xiàng)18的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA由組成型啟動子啟動表達(dá)。
[0041]21.項(xiàng)18的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA由誘導(dǎo)型啟動子啟動表達(dá)。
[0042]22.項(xiàng)18的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA由組織特異性啟動子啟動表達(dá)。
[0043]23.項(xiàng)18的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述TWEAK多肽選自:全長TWEAK多肽；可溶性TffEAK多肽；突變蛋白；或TWEAK多肽片段。
[0044]24.表達(dá)編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA在選自下面的器官或組織中被表達(dá):心臟；血管；肺；肝臟；腎臟；皮膚；神經(jīng)；胎盤；骨骼??；胰腺；脾；淋巴；胸腺；闌尾；外周血液淋巴細(xì)胞；生殖器官；脂肪組織；胃腸組織；軟骨；骨；或結(jié)締組織。
[0045]25.項(xiàng)24的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA由組成型啟動子啟動表達(dá)。
[0046]26.項(xiàng)24的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA由誘導(dǎo)型啟動子啟動表達(dá)。
[0047]27.項(xiàng)24的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA由組織特異性啟動子啟動表達(dá)。
[0048]28.用于在機(jī)體中鑒定充血性心肌病的方法，包含在所述機(jī)體中檢測TWEAK蛋白表達(dá)、TWEAK蛋白功能、TffEAKmRNA表達(dá)的變化或染色體改變的步驟。
[0049]29.項(xiàng)28的方法，其中所述TWEAK蛋白表達(dá)、TWEAK蛋白功能、TWEAKmRNA表達(dá)的變化或染色體改變通過選自下面的方法檢測:(a)免疫分析；(b)免疫組織化學(xué)分析；(c)酶的或其他蛋白功能的分析；(d)Northern印跡；(e) Southern印跡；(f)單核苷酸多形性分析；或(g)熒光原位雜交分析。
[0050]30.用于影響細(xì)胞增殖或分化的方法，包括將祖細(xì)胞暴露于TWEAK肽、TffEAK激動劑或TWEAK拮抗劑。
[0051]31.項(xiàng)30的方法，其中所述祖細(xì)胞選自:(a)干細(xì)胞；(b)全能細(xì)胞；(c)多潛能細(xì)胞；⑷多能細(xì)胞；(e)雙能細(xì)胞；(f)組織特異性細(xì)胞；(g)胚胎細(xì)胞；或(h)成體細(xì)胞。
[0052]32.項(xiàng)30的方法，其中所述祖細(xì)胞是未分化的脂肪細(xì)胞。[0053]33.項(xiàng)30的方法，其中所述祖細(xì)胞是未分化的生肌細(xì)胞。
[0054]34.促進(jìn)組織替換或再生的方法，包括給需要組織替換或再生的機(jī)體施用一種化合物，該化合物選自:(a)抗TWEAK抗體；(b)抗TWEAK受體抗體；(c) TffEAK多肽片段；(d)TffEAK多肽類似物；(e) TffEAK突變蛋白；(f) TffEAK模擬物；(g) TffEAK融合蛋白；(h) TffEAK受體多肽片段；(i) TffEAK受體多肽類似物；(J)TffEAK受體突變蛋白；(k) TWEAK受體模擬物；(I) TffEAK受體融合蛋白；(m)有機(jī)TWEAK激動劑；(η)有機(jī)TWEAK拮抗劑；(ο)無機(jī)TWEAK激動劑；或(P)無機(jī)TWEAK拮抗劑。
[0055]35.項(xiàng)1、30和34的任何一項(xiàng)的方法，其中所述方法與祖細(xì)胞或組織移植治療聯(lián)合應(yīng)用。
[0056]36.項(xiàng)35的方法，其中所述細(xì)胞或組織移植治療擴(kuò)增細(xì)胞群體。
[0057]37.項(xiàng)30的方法，其中所述祖細(xì)胞是未分化的軟骨細(xì)胞。
[0058]38.項(xiàng)30的方法，其中所述祖細(xì)胞是未分化的骨細(xì)胞。
[0059]39.項(xiàng)30的方法，其中所述祖細(xì)胞是未分化的結(jié)締組織細(xì)胞。
[0060]40.TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑在制備用于在機(jī)體中治療TWEAK相關(guān)病癥的藥物組合物中的用途，其中所述TWEAK相關(guān)病癥選自:(a)纖維變性；(b)心臟病；(c)肝臟疾??；(d)肺疾??；(e)腎臟疾病；(f)皮膚病；(g)骨骼肌疾??；(h)脂肪組織疾?。虎盼改c道疾??；(j)胰腺疾??；(k)生殖器官疾病；⑴神經(jīng)疾病；(m)軟骨疾病；(η)骨??；(ο)結(jié)締組織疾病；(P)細(xì)胞死亡；或(q)表達(dá)TWEAK受體的組織的病理狀況。
[0061]41.項(xiàng)40的用途，其中所述TWEAK激動劑或TWEAK拮抗劑選自:(a)抗TWEAK抗體；(b)抗TWEAK受體抗體；(c) TffEAK多肽片段；(d) TWEAK多肽類似物；(e) TffEAK突變蛋白；(f) TffEAK模擬物；(g) TffEAK融合蛋白；(h) TffEAK受體多肽片段；⑴TWEAK受體多肽類似物；(j) TWEAK受體突變蛋白；(k) TffEAK受體模擬物；⑴TWEAK受體融合蛋白；(m)有機(jī)化合物；或(η)無機(jī)化合物。
[0062]42.TffEAK拮抗劑在制備用于在機(jī)體中治療TWEAK相關(guān)病癥的藥物組合物中的用途，其中所述TWEAK拮抗劑能夠干擾第一種TWEAK多肽與一種分子的作用，該分子選自:細(xì)胞受體、第二種TWEAK多肽和與TWEAK相互作用的配偶體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0063]附圖1:顯示TWEAK在充血性心肌病中的作用。A.FL-TffEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠表現(xiàn)為右側(cè)心房和心室栓塞，并且嚴(yán)重?cái)U(kuò)張。B.顯示正常的心臟作為比較。
[0064]附圖2:TWEAK在心臟中過度表達(dá)導(dǎo)致心臟重塑(cardiac remodeling)。在用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染成年C57BL/6小鼠后第20天，在IOX放大倍數(shù)下觀察用蘇木精/曙紅染色的心臟的橫截面，與腺病毒一 GFP對照構(gòu)建體比較。
[0065]附圖3 =TWEAK誘導(dǎo)膽管和卵形細(xì)胞(oval cell)增生，如與2周齡和7月齡的非轉(zhuǎn)基因(NTg)同窩小鼠相比，F(xiàn)L-TWEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠中所顯示。
[0066]附圖4:在與非轉(zhuǎn)基因(NTg)同窩小鼠相比時，在FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠中，對膽管上皮和卵形細(xì)胞標(biāo)記特異的A6mAb的染色增加，這表明TWEAK誘導(dǎo)膽管和卵形細(xì)胞增生。
[0067]附圖5:在FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠的門脈區(qū)中存在大的、卵形細(xì)胞，這表明TWEAK誘導(dǎo)卵形細(xì)胞增生。
[0068]附圖6:與非轉(zhuǎn)基因(NTg)同窩小鼠相比，TffEAK在FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠中引起肝細(xì)胞液泡化。
[0069]附圖7:用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染的小鼠中的血清TWEAK水平。
[0070]附圖8 =TWEAK在肝臟中過度表達(dá)導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡和膽管增生。在用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染成年C57BL/6小鼠后第3和11天，在20X放大倍數(shù)下觀察用蘇木精/曙紅染色的肝臟的橫截面，與腺病毒一 GFP對照構(gòu)建體比較。
[0071]附圖9:在CC14引起肝臟損傷后，TffEAK受體Fnl4在小鼠中被誘導(dǎo)。在正常小鼠肝臟和CC14損傷的肝臟中原位雜交Fnl4mRNA，表明如果在正常的成年肝臟中有任何可檢測的表達(dá)，也是微弱的，而在損傷后顯著地誘導(dǎo)Fnl4表達(dá)。蘇木精/曙紅(H&E)染色的切片展示相應(yīng)的正常健康的肝臟和CC14損傷的肝臟組織。
[0072]附圖10:在膽管結(jié)扎的小鼠模型中，膽管上皮細(xì)胞中Fnl4表達(dá)被上調(diào)，用于原位雜交的直接抗Fnl4的反義mRNA探針的染色增加表明了這一點(diǎn)。蘇木精/曙紅(H&E)染色的切片展示在明視野顯微鏡下的相應(yīng)切片。
[0073]附圖11:在2周齡、8周齡和7月齡時，與非轉(zhuǎn)基因(NTg)小鼠的腎臟比較的FL-TffEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠腎臟的橫截面。這些結(jié)果表明在8周齡和7月齡的TWEAK Tg小鼠腎臟中腎小管嗜堿性，腎小球中的儲尿腔(urinary space)擴(kuò)張，即腎小球囊腫，在7月齡具有近端嗜堿性腎小管。
[0074]附圖12:具有H&E染色的FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠的腎臟的橫截面。A.表示鄰近的近端腎小管上皮嗜堿性的腎小球腎病。B.節(jié)段性腎小球膜的細(xì)胞過多(segmentalmesangial hypercellularity)、腎小囊上皮肥大、和腎小囊增厚。
[0075]附圖13:來自兩只FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠腎臟的連續(xù)切片，用H&E(上面)和擴(kuò)增的細(xì)胞核抗原(PCNA)(下面)染色。嗜堿性腎小管對應(yīng)于表達(dá)PCNA的腎小管，即增生的腎小管。
[0076]附圖14 =FL-TffEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠腎臟的連續(xù)切片，用H&E、得自T.Purpureas的凝集素(近端腎小管的 標(biāo)記)和得自A.Hypogaea的凝集素(遠(yuǎn)端腎小管的標(biāo)記)標(biāo)記。結(jié)果表明嗜堿性腎小管不表達(dá)任何上皮標(biāo)記。
[0077]附圖15 =TWEAK在腎臟中過度表達(dá)導(dǎo)致腎小管增生和腎小球腎病。在用包含小鼠TWEAK DNA的腺病毒載體感染成年C57BL/6小鼠后第11天，在20X和40X放大倍數(shù)下觀察用蘇木精/曙紅染色的腎臟的橫截面，與腺病毒一 GFP對照構(gòu)建體比較。
[0078]附圖16 =TffEAK mRNA在整個成年野生型小鼠腎臟中廣泛的表達(dá)。在5X倍數(shù)下觀察蘇木精染色的腎臟的橫截面，或在用正義或反義TWEAK探針原位雜交后，在暗視野顯微鏡下觀察。
[0079]附圖17:Fnl4mRNA在野生型小鼠腎臟的外層髓質(zhì)的近端腎小管中被表達(dá)。在5X倍數(shù)下觀察蘇木精染色的腎臟的橫截面，或在用正義或反義Fnl4探針原位雜交后，在暗視野顯微鏡下觀察。
[0080]附圖18 =TffEAK在腎臟纖維變性中的作用，得到Alports腎臟中的Fnl4mRNA上調(diào)的支持。Fnl4mRNA水平上升的倍數(shù)以兩只分別具有導(dǎo)致Alports疾病的突變的小鼠在4，5，6和7周齡與野生型動物比較來表示。mRNA水平通過與含有對應(yīng)于一部分Fnl4基因的核苷酸序列的基因芯片雜交來確定。在第4和7周，給出兩只小鼠中每只小鼠的重復(fù)結(jié)果(分別用小鼠I重復(fù)和小鼠2重復(fù)柱來表示)。在第7周，F(xiàn)nl4mRNA在疾病被抑制的兩種情況下降低，即sTGF R-Fc處理和在VLA-1敲除的小鼠中(在附圖18中或者用sTGFP R-Fc處理的兩只單個小鼠("sTGFbR處理")或者兩只單個的Alport/VLA-1KO小鼠("Alport/VLA-1KO")表示。[0081]附圖19:在一種腎臟纖維變性小鼠模型，單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)中用TWEAK拮抗劑處理顯著地降低腎臟纖維變性。三色一馬森(Trichrome-Masson)染色的石臘腎臟切片上的藍(lán)色染色區(qū)域(纖維變性區(qū)域)的結(jié)構(gòu)改變的量化表明，膠原質(zhì)含量在AB.Gll (抗TffEAK單克隆Ab)處理的腎臟樣本中下降到與在sTGF-β R-1g陽性對照樣本中觀察的水平相似的水平。相反，同種型對照倉鼠抗體(ΗΑ4/8)處理的腎臟沒有顯示出腎臟纖維變性降低，與載體(PBS)處理的腎臟類似。
[0082]附圖20 =TffEAK轉(zhuǎn)基因在肺中引起肉芽腫性和淋巴組織細(xì)胞炎癥。Α.用Η&Ε染色的來自FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠肺的橫截面。B.用Η&Ε染色的來自sTWEAK(Tg)小鼠肺的橫截面。
[0083]附圖21:TWEAK mRNA在成年野生型小鼠的內(nèi)襯于肺的支氣管和肺泡的細(xì)胞中被表達(dá)。在IOX放大倍數(shù)下用蘇木精染色觀察肺的橫截面，或者在用正義或反義TWEAK探針原位雜交后在暗視野顯微鏡下觀察。
[0084]附圖22:Fnl4 mRNA在成年野生型小鼠的支氣管和肺泡中被表達(dá)。在IOX放大倍數(shù)下用蘇木精染色觀察肺的橫截面，或者在用正義或反義Fnl4探針原位雜交后在暗視野顯微鏡下觀察。
[0085]附圖23 =TffEAK在體外對3T3-L1細(xì)胞脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。3T3-L1細(xì)胞被采用標(biāo)準(zhǔn)方法誘導(dǎo)來進(jìn)行分化。在第O天，細(xì)胞不被處理、用對照試劑(重組的可溶性人CD40L-FLAG100ng/ml)或100ng/ml各種形式的TWEAK (重組可溶性人TWEAK-FLAG、重組可溶性人TWEAK、Fe-人TWEAK)處理，以及地塞米松和胰島素，并且每天補(bǔ)充。在一個試驗(yàn)組中，阻斷性抗TWEAK mAb AB.Gll還與Fc_hTWEAK同時被加入。在第7天用Oil-red O染色細(xì)胞。
[0086]附圖24 =TffEAK在體外對肌細(xì)胞生成的抑制作用。C2C12成肌細(xì)胞在DMEM基礎(chǔ)生長培養(yǎng)液中生長到接近匯合，在第O天被轉(zhuǎn)移到含有2%馬血清的低血清分化培養(yǎng)液中來引發(fā)分化。細(xì)胞不被處理或在第O天用Fc-hTWEAK(100ng/ml)處理。使用相差顯微鏡來檢測肌管形成，在分化的第6天拍攝照片。在另一個試驗(yàn)組中，F(xiàn)nl4-Fc或中和性抗TNF抗體與Fc-hTWEAK同時被加入，從而證明Fc-hTWEAK的抑制作用是TWEAK特異的，不是通過TNF調(diào)節(jié)。
[0087]附圖25 =TWEAK能夠結(jié)合到人間充質(zhì)干細(xì)胞上。人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)用重組的的Fc-TWEAK蛋白培養(yǎng)，接著用PE-偶聯(lián)的山羊抗人Fe或山羊抗小鼠Fe第二抗體培養(yǎng)。Fc-TWEAK結(jié)合hMSCs的能力采用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析測定。背景染色通過單獨(dú)用第二抗體染色(僅用第二抗體)來提供。
[0088]發(fā)明詳述
[0089]除非本文特別指出，所用的與本發(fā)明有關(guān)的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解相同的含義。此外，除非上下文另有規(guī)定，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)形式，而復(fù)數(shù)術(shù)語包括單數(shù)形式。一般地，本文所描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)物、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、病毒和蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和雜交所用的相關(guān)命名和技術(shù)是本領(lǐng)域那些公知和常用的。除非特別指出，本發(fā)明的方法和技術(shù)通常按照本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法進(jìn)行，這些方法被描述在本說明書全文中所引用和討論的各種概括或特定參考文獻(xiàn)中。參見，如Sambrook等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor,紐約(1989)和 Ausubel 等，Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates (1992),以及 Harlow 和 Lane Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,紐約(1990)，在此引入作為參考。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行，如本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)或本文所描述。與分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、和醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)相關(guān)的所用命名，和實(shí)驗(yàn)室操作和技術(shù)，是本領(lǐng)域熟知和通常使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制和呈遞，以及治療患者。
[0090]為了本文所描述的發(fā)明被更加充分地理解，給出如下的詳細(xì)描述。在本說明書中使用如下術(shù)語:
[0091]“抗體”是指完整的免疫球蛋白，或指其抗原結(jié)合部分，該部分可與完整抗體競爭而與抗原特異性結(jié)合?？乖Y(jié)合部分可以通過重組DNA技術(shù)或通過酶促或化學(xué)裂解完整抗體來制備?？乖Y(jié)合部分包括，例如，F(xiàn)ab、Fab'、F(ab' )2、Fv、dAb和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗和含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，該部分免疫球蛋白足以賦予該多肽特異性結(jié)合抗原的能力。Fab片段是單價片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成；F(ab' ) 2片段是雙價片段，其包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個Fab片段；Fd片段由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段由VL和抗體的一個臂的VH結(jié)構(gòu)域組成；和dAb片段( Ward等，Nature341:544-546, 1989)由VH結(jié)構(gòu)域組成。單鏈抗體(scFv)是其中VL和VH區(qū)域通過合成接頭配對來形成單價分子的抗體，這使得它們可以作為單一的蛋白鏈被制備(Bird 等,Science242:423-426 (1988)和 Huston 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883, (1988))。雙抗(diabody)是二價的，雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單一多肽鏈上被表達(dá)，但是采用一個極短的接頭使得在同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域不能配對，從而迫使該結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，如 Holliger 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)，和 Poljak等，Structure〗: 1121-1123(1994))。一個或多個⑶Rs被共價地或非共價地結(jié)合到分子上來使之成為一種免疫粘附素。免疫粘附素可納入CDR(S)作為較大的多肽鏈的部分，可以共價地將⑶R(s)連接到另一個多肽鏈上，或者可以非共價地納入⑶R(s)。⑶R使得免疫粘附素特異性地結(jié)合到特定的目標(biāo)抗原上。
[0092]抗體可以具有一個或多個結(jié)合位點(diǎn)。如果存在一個以上結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)可以與另一個相同或不同。例如，天然的免疫球蛋白具有兩個相同的結(jié)合位點(diǎn)，單鏈抗體或Fab片段具有一個結(jié)合位點(diǎn)，而“雙特異性”或“雙功能”抗體具有兩個不同結(jié)合位點(diǎn)。
[0093]“抗體譜(antibody repertoire) ”是指動物或人中的每種不同的抗體種類的總和?？贵w譜的多樣性來自，例如，免疫球蛋白基因重組、免疫球蛋白基因結(jié)合多樣性、末端脫氧轉(zhuǎn)移酶活性和體細(xì)胞超變(somatic hypermutation)。
[0094]“嵌合抗體”是從其原始形式被改變來包含來自另一個蛋白質(zhì)的氨基酸序列的抗體。嵌合抗體保留至少一部分原始抗體氨基酸序列，通常是包含抗原結(jié)合區(qū)域(Fab)的那部分。嵌合抗體的例子包括但是不限于，雙特異性抗體和與其他非免疫球蛋白序列的融合。
[0095]“順式調(diào)控元件”通常是指在特定條件下或在特定細(xì)胞中調(diào)控基因序列的可誘導(dǎo)的或組成型表達(dá)。表達(dá)控制序列調(diào)控的細(xì)胞過程的例子包括但是不限于，基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、信使RNA剪接、免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)糖基化、蛋白質(zhì)裂解、蛋白質(zhì)分泌、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞外蛋白質(zhì)自歸巢(homing)。 [0096]“細(xì)胞因子”一般是指免疫系統(tǒng)的信號分子。細(xì)胞因子包括但是不限于白細(xì)胞介素(IL)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、淋巴毒素(LT)、干擾素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞CSF、粒細(xì)胞CSF和遷移抑制因子。
[0097]“胚胎干細(xì)胞(ES) ”是指多潛能(pluripotent)或多能(multipotent)細(xì)胞，當(dāng)被注射到胚泡中時，其能夠形成許多或所有出生前、出生后或成年動物的組織。從胚泡注射得到的動物通常被稱作“嵌合”動物，由于其體細(xì)胞和/或生殖細(xì)胞通常來源于胚泡供體和被注射的ES細(xì)胞。ES細(xì)胞的重要特性在于其能夠形成動物的生殖細(xì)胞系，產(chǎn)生被傳遞到嵌合動物后代的任何期望的可遺傳的特征。無限增生的ES細(xì)胞是生產(chǎn)具有靶向內(nèi)源基因序列破壞的動物或者生成具有外源基因的動物(轉(zhuǎn)基因)的有力工具。
[0098]“表達(dá)控制序列”是指在特定條件下或在特定細(xì)胞中組成型表達(dá)或可誘導(dǎo)表達(dá)基因序列的序列。表達(dá)控制序列調(diào)控的細(xì)胞過程的例子包括但是不限于，基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、信使RNA剪接、免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)糖基化、蛋白質(zhì)裂解、蛋白質(zhì)分泌、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞外蛋白質(zhì)自歸巢。
[0099]“融合蛋白”是指包含兩種或多種蛋白質(zhì)的氨基酸序列的嵌合蛋白。典型地，融合蛋白產(chǎn)生自本領(lǐng)域熟知的體外重組技術(shù)。但是，融合蛋白可以從體內(nèi)交換或其他重組事件中產(chǎn)生。
[0100]“人免疫球蛋白分子”是指由人免疫球蛋白基因序列編碼的免疫球蛋白。免疫球蛋白基因序列可以在任何細(xì)胞或動物，人或非人類中被表達(dá)。
[0101]“人源化抗體”是衍生自非人類的物種的抗體，其中重鏈和輕鏈的框架區(qū)和恒定區(qū)中特定的氨基酸被突變，以在人中避免或消除免疫反應(yīng)。可選擇地，人源化抗體可以通過將來自人抗體的恒定區(qū)融合到非人類物種的可變區(qū)上來制備。如何制備人源化抗體的實(shí)例可以在美國專利6，054，297,5, 886，152和5，877，293中發(fā)現(xiàn)。
[0102]“炎癥”或“炎癥性疾病”是指由細(xì)胞和組織反應(yīng)組成的基礎(chǔ)病理過程，在對損傷，異常刺激或生物學(xué)試劑響應(yīng)時在血管和鄰近組織中發(fā)生。同樣地，“非炎癥性病癥”或“非炎癥性疾病”是指實(shí)質(zhì)上是非炎癥的任何病癥或疾病，如本文所公開的。
[0103]“分離的蛋白質(zhì)”或“分離的多肽”一般是指蛋白質(zhì)或多肽，從其起源或來源來講:(I)不是天然地結(jié)合在天然狀態(tài)下與其相伴的相關(guān)成分上，(2)不含有來自同一物種的其他蛋白，(3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，(4)在天然條件下不存在。因此，嵌合地合成，在無細(xì)胞的生物系統(tǒng)中(如兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物)合成，或者在不同于其天然來源的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽可以從其天然相關(guān)的成分中“分離”。還可以采用本領(lǐng)域熟知的純化技術(shù)，通過分離以使蛋白基本上不含有天然相關(guān)的成分。
[0104]“模擬物”或“肽模擬物”是非肽的類似物，其通常被用于制藥工業(yè)作為具有與模板妝類似的性質(zhì)的藥物。Fauchere, J.Adv.Drug Res.15:29 (1986) ;Veber和Freidinger, TINS392 (1985)；和 Evans 等，J.Med.Chem.30:1229 (1987)，在此引入作為參考。模擬物通常借助計(jì)算機(jī)分子建模來開發(fā)。結(jié)構(gòu)上類似于治療上有用的肽的肽模擬物可以被用于產(chǎn)生等價的治療性或預(yù)防性作用。一般地，模擬物在結(jié)構(gòu)上類似于范例多肽(即，具有期望的生物化學(xué)性質(zhì)或藥學(xué)活性的多肽)，例如TWEAK，但是具有一種或多種肽鍵可選擇地通過本領(lǐng)域熟知的方法被一種鍵替換，該鍵選自一CH2NH—，—CH2S—, —CH2-CH2—,--CH=CH—(順式和反式)，一COCH2—,—CH (OH) CH2—,和-CH2S0—。用相同類型的D-氛基酸系統(tǒng)性地取代共有序列的一種或多種氨基酸(例如用D-賴氨酸取代L-賴氨酸)也可以被用于生產(chǎn)更加穩(wěn)定的肽。此外，包含共有序列或?qū)嵸|(zhì)上相同的共有序列變體的限定的肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法來生產(chǎn)(Rizo和Gierasch, Ann.Rev.Biochem.61:387 (1992),在此引入作為參考)；例如，通過增加能夠形成分子間二硫鍵的內(nèi)在半胱氨酸殘基，二硫鍵使肽環(huán)化。
[0105]“肽類似物”是指來自野生型多肽但是氨基酸序列不同的多肽。氨基酸序列改變的多肽可以是突變蛋白，融合蛋白和模擬物。多肽類似物還指與野生型多肽相比具有非氨基酸差別的多肽。這些差別可以是化學(xué)的和生物化學(xué)的，并且包括但是不限于特別在本文中公開的修飾類型。
[0106]“多肽片段”是指氨基末端和/或羧基末端被缺失但是剩下的氨基酸序列與天然序列的相應(yīng)部分相同的多肽。片段典型為長至少5，6，8或10個氨基酸，優(yōu)選至少14個氨基酸，更加優(yōu)選長至少20個氨基酸，通常至少長50個氨基酸，和甚至更加優(yōu)選長至少70個氨基酸。 [0107]“祖細(xì)胞”是指能夠產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞系的細(xì)胞。包括干細(xì)胞、全能細(xì)胞、多潛細(xì)胞、多能細(xì)胞、雙能細(xì)胞(bipotent cell),胚胎細(xì)胞或成體細(xì)胞(adult cell)。還包括組織特異性細(xì)胞，包括但是不限于，定向于能夠進(jìn)行終末分化的特定細(xì)胞系的細(xì)胞，來自于組織定居細(xì)胞(tissue resident cell)的細(xì)胞,和定向于特定組織的循環(huán)細(xì)胞。
[0108]“機(jī)體”是人或非人類機(jī)體。機(jī)體的例子是患者。
[0109]“TWEAK相關(guān)病癥”是指由異常TWEAK功能或調(diào)控產(chǎn)生的任何病癥。該術(shù)語還指不是直接從異常TWEAK功能或調(diào)控產(chǎn)生的任何病癥，而是產(chǎn)生自一些其他的機(jī)制，其中破壞、升高或另外改變TWEAK的活性對該病癥具有可檢測的結(jié)果。TWEAK相關(guān)病癥可以是炎癥性的或?qū)嵸|(zhì)上非炎癥性的，并且包括但是不限于本文特別公開的病癥和疾病。
[0110]“載體”是指使目標(biāo)DNA序列在其天然細(xì)胞之外被克隆、繁殖、重組、突變和表達(dá)的DNA分子。通常地，載體具有使基因序列在特定條件下或在特定細(xì)胞中可誘導(dǎo)地或組成型地表達(dá)的表達(dá)控制序列。載體的例子包括但是不限于質(zhì)粒，酵母人工染色體(YACs)，病毒，EB病毒，(EBV)來源的附加體，噬菌體、粘粒和噬菌粒。
[0111]“異種動物”是指攜帶人免疫球蛋白基因座實(shí)質(zhì)部分的動物。經(jīng)常地，異種動物攜帶同源靶向內(nèi)源免疫球蛋白基因座，使得它們不能表達(dá)其內(nèi)源免疫球蛋白基因。實(shí)例包括XenoMouseTM細(xì)胞系的小鼠(Abgenix, Inc., Fremont,加利福尼亞)，其能夠體內(nèi)重排轉(zhuǎn)基因的人免疫球蛋白基因，超變?nèi)丝勺兓?，免疫球蛋白基因的表達(dá)，和免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換。異種動物能夠利用人免疫球蛋白基因序列發(fā)動對抗原攻擊的有效體液應(yīng)答。在異種動物中產(chǎn)生的抗體完全是人的，并且可從動物本身或其后代中，從提取自動物或其后代的培養(yǎng)細(xì)胞中和從異種B淋巴細(xì)胞系或其后代中產(chǎn)生的雜交瘤中分離得到。而且，被重排的編碼免疫球蛋白的人基因序列可以通過常規(guī)的重組技術(shù)分離得到，該免疫球蛋白產(chǎn)生來抵抗特定抗原攻擊。
[0112]“異種抗體”是指通過外源免疫球蛋白基因座編碼的抗體。例如，在XenoMouse?系的小鼠中，人抗體基因座編碼異種抗體。
[0113]“異種單克隆抗體”是指在來自異種動物的克隆的、無限增生的細(xì)胞中如雜交瘤中產(chǎn)生的同源抗體群。例如從XenoMouse系小鼠中制備的雜交瘤產(chǎn)生異種抗體。 [0114]對疾病的理解和治療根本上朝向于確定闡明疾病的分子機(jī)制或生物化學(xué)路徑。因此，醫(yī)生和科研人員能夠制備治療劑和配制藥物組合物，它們特異性地靶向這些分子機(jī)制或生物化學(xué)路徑。
[0115]一些困擾人的最復(fù)雜且使人虛弱的疾病包括那些心臟、肝臟、腎臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪代謝、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、生殖器官、軟骨、骨、結(jié)締組織系統(tǒng)和祖細(xì)胞或干細(xì)胞的疾病。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供對這些疾病的了解的重要進(jìn)展。更加特別地，本發(fā)明提供表達(dá)外源TWEAK蛋白的轉(zhuǎn)基因動物，并首次證明TWEAK蛋白的表達(dá)與某些心臟、肝臟、腎臟和肺的病理狀況之間的相關(guān)關(guān)系。本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防這種病理狀況的方法，以及用于鑒定用于這些方法中的TWEAK激動劑或拮抗劑的方法?？梢园凑毡景l(fā)明的方法治療的病理狀況包括急性的心臟損傷、慢性心力衰竭、非炎癥性充血性心肌病、充血性心力衰竭、肝臟上皮細(xì)胞增生、肝細(xì)胞死亡、肝臟纖維變性、肝細(xì)胞液泡化、肝臟損傷、膽管病癥，包括膽管增生、炎癥性腎臟病癥，如腎臟多病灶炎癥，非炎癥性腎臟病癥，如腎小管腎病，腎小管增生，腎小球囊腫、腎肥大、腎小囊增厚、腎小球腎病、Alport綜合癥、腎小管液泡化、腎透明管型、腎臟纖維變性和炎癥性肺病癥。本發(fā)明還提供用于檢測TWEAK結(jié)構(gòu)或功能，作為疾病的分子標(biāo)記的方法，包括TWEAK蛋白或其功能，TffEAK抗體和TWEAK核酸。
[0116]本文所描述的TWEAK相關(guān)病癥采用TWEAK激動劑或拮抗劑處理，TffEAK激動劑或拮抗劑能夠改變TWEAK活性或者破壞膜結(jié)合或全長形式的TWEAK多肽與其分子受體之間的相互作用?？蛇x擇地，治療劑和治療方法破壞膜結(jié)合或全長形式的TWEAK多肽與另一種TWEAK多肽之間的相互作用。這種干涉可能發(fā)生在細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或體外結(jié)合到固相上或在溶液中。在另一種選擇中，治療劑和治療方法破壞膜結(jié)合或全長形式的TWEAK多肽與TWEAK相互作用的配偶體之間的相互作用。這種相互作用的配偶體可以是蛋白質(zhì)、核酸、糖、脂肪、脂肪酸和類固醇。
[0117]在一個本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，TWEAK相關(guān)的病癥實(shí)質(zhì)上是非炎癥的。
[0118]在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，TffEAK相關(guān)的病癥是纖維變性、心肌病、腎臟疾病、肺部疾病或肝臟疾病。
[0119]在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，TWEAK相關(guān)的病癥是骨骼肌疾病、脂肪組織疾病、胃腸道疾病、胰腺疾病、生殖器官疾病、神經(jīng)組織疾病、細(xì)胞死亡、皮膚疾病、軟骨疾病、骨病或結(jié)締組織疾病、
[0120]在另一個實(shí)施方案中，TWEAK激動劑或拮抗劑可以被用于在體內(nèi)通過影響祖細(xì)胞來治療患需要組織替換或再生的病癥、疾病或損傷的機(jī)體(如灼傷的或被放射的患者)。TWEAK激動劑或拮抗劑還可以被用于與祖細(xì)胞或組織移植治療結(jié)合來體內(nèi)治療機(jī)體。TWEAK激動劑或拮抗劑還可以被用于體內(nèi)擴(kuò)增細(xì)胞群或體外擴(kuò)增祖細(xì)胞群，用于隨后被移植到機(jī)體中，伴隨或不伴隨其他治療。用于體內(nèi)細(xì)胞治療或體外擴(kuò)增隨后用于移植的祖細(xì)胞群體可以是胚胎或成體來源的。成體(adult)來源的祖細(xì)胞可以是多能的或組織限制性的(Lagasse等,Immunity 14:425-436 (2001)；Jackson 等 J.Clin.1nvest.107:1355-402(2001) ；Anversa 和 Nadal-Ginard, Nature415:240-243 (2002) ；Gussoni 等，Nature401:390-394 (1999) ；Brazelton 等，Science290:1672-1674(2000) ；Peterson 等，Science284:1168-1170 (1999) ；Lagasse 等,NatureMedicine6:1229-1234(2000))。
[0121]心臟病在工業(yè)國家中是勞動力喪失和死亡的重要原因。在美國，心臟病約占全部死亡率的40%，每年引起約750，000人死亡。心臟功能中最基礎(chǔ)的是心肌，主要由分支和吻合的紋狀肌細(xì)胞(心肌細(xì)胞)組成。心肌細(xì)胞比介于其中的間質(zhì)細(xì)胞大得多，占心肌體積的90%以上。正常的心肌中炎癥性細(xì)胞極少并且膠原質(zhì)也很少。
[0122]心肌病很普遍，但是在不同心臟病癥中位于第二位。心肌病的例子包括炎癥性紊亂(如心肌病)，而非炎癥性心臟病癥如充血性心肌病、系統(tǒng)性代謝紊亂、肌肉營養(yǎng)失調(diào)和心肌細(xì)胞的遺傳異常。
[0123]心肌病的主要類型包括充血性的、肥大性的和限制性的心肌病。本發(fā)明的目的在于提供用于治療充 血性心肌病的方法，充血性心肌病通常實(shí)質(zhì)上是非炎癥性的。在非炎癥性充血性心肌病的情況下，其約占心肌病的臨床病例的90%，心臟表現(xiàn)為進(jìn)行性的心臟肥大、擴(kuò)張和收縮(心臟收縮)障礙。充血性心肌病可能發(fā)生在任何年齡段，但是最普遍發(fā)生在年齡在20 - 60歲的人中。通常通過非侵入性的心臟成像來診斷，特別是通過二維心回波描記術(shù)診斷。充血性心肌病的組織病理學(xué)的特征在于心肌細(xì)胞退行性變伴隨輕度到中度的肥大，不存在炎癥細(xì)胞和間質(zhì)纖維變性。
[0124]臨床的充血性心肌病出現(xiàn)緩慢的漸進(jìn)的充血性心力衰竭，但是患者可能迅速從代償狀態(tài)滑落到失代償狀態(tài)，通常需要進(jìn)行心臟移植。50%的患者在兩年之內(nèi)死亡，75%在五年之內(nèi)死亡。死亡的原因典型的是漸進(jìn)的心力衰竭或心率失常，但是可能出現(xiàn)由于心臟內(nèi)血栓脫落而引起的栓塞。
[0125]表現(xiàn)為充血性心肌病的心臟被擴(kuò)大、松弛，為正常心臟的2 - 3倍重。所有的腔室都擴(kuò)張，壁變薄，纖維變性，并且典型地為壁孔血栓癥。在少數(shù)充血性的心肌病中，由于左心室擴(kuò)張導(dǎo)致二尖瓣或三尖瓣回流。心肌細(xì)胞過度增生，核擴(kuò)大。一些充血性心肌病的病因包括心肌炎、濫用酒精或其他毒素、懷孕(圍產(chǎn)期心肌病)、缺血、冠心病、高血壓和遺傳影響。
[0126]特發(fā)性充血性心肌病(IDC)是一種未知病因的疾病，其特征在于一側(cè)或兩側(cè)心室擴(kuò)張、心臟收縮功能障礙，并且逐步發(fā)展為充血性心力衰竭。應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語“IDC”被本領(lǐng)域的技術(shù)人員與術(shù)語“充血性心肌病”交換使用，表明IDC實(shí)際上是充血性心肌病的一種廣義分類，不是濫用酒精、毒素?fù)p傷或心肌病的結(jié)果。
[0127]在顯微鏡下，IDC的特征為心肌細(xì)胞增生、核過大和間質(zhì)的和血管周圍的纖維變性。與心肌病不同，壞死和細(xì)胞浸潤通常不顯著出現(xiàn)在IDC患者中，這表明其病因是非炎癥性。與該病因?qū)W一致的是抗炎癥藥物如強(qiáng)的松在治療IDC中通常是無效的。
[0128]本發(fā)明的一個目的在于提供一種治療或預(yù)防與TWEAK活性相關(guān)的充血性心肌病的方法。由于充血性心肌病(如IDC)的病因在很大程度上是未知的，還沒有開發(fā)出特定的治療方法。通常采用物理的、飲食的和藥理學(xué)的干涉(如β_腎上腺素受體拮抗劑、鈣離子拮抗劑和抗凝血劑)治療患者的心力衰竭來控制該疾病的癥狀。此外，當(dāng)可能時，進(jìn)行心臟移植。
[0129]本領(lǐng)域的技術(shù)人員不能確定任何可以被用于診斷IDC的免疫學(xué)的、組織化學(xué)的、形態(tài)學(xué)的、超結(jié)構(gòu)的或微生物學(xué)的標(biāo)記。但是，流行病學(xué)證據(jù)表明易感IDC是有遺傳基礎(chǔ)的。在20%的IDC患者中，一度(first-degree)相關(guān)也顯示IDC跡象,表明頻繁的家族傳播。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已經(jīng)認(rèn)識到需要確定亞臨床和臨床心臟病患者中的IDC的分子遺傳標(biāo)記。[0130]迄今，與充血性心肌病相關(guān)的基因的列表包括心肌鈣蛋白T、d —肌聚糖(d-sarcoglycan)、心臟b肌球蛋白重鏈、心肌動蛋白、a_原肌球蛋白、核纖層蛋白A/C、肌間線蛋白、心斯里蘭卡肉桂咸受體(cardiac ryanodine recaptor)、橋粒斑蛋白、斑珠蛋白、肌營養(yǎng)不良蛋白和tafazzin。還需要尋找引起充血性心肌病的其他遺傳因子和設(shè)計(jì)靶向這些因子的治療劑。本發(fā)明首次證明了 TWEAK和充血性心肌病之間的因果聯(lián)系。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種在患者中鑒定充血性心肌病的方法，通過檢測TWEAK蛋白表達(dá)、TWEAK蛋白功能、TWEAK mRNA表達(dá)的變化或染色體改變。用于檢測疾病的分子標(biāo)記的方法和試劑在本領(lǐng)域是熟知的，包括免疫學(xué)或免疫組織化學(xué)分析，酶或其他蛋白功能分析，和標(biāo)準(zhǔn)的雜交分析，如northern印跡、Southern印跡、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析,和突光原位雜交(FISH)分析。
[0131]應(yīng)當(dāng)指出，非炎癥性充血性心肌病的特征在于漸進(jìn)的心臟肥大、擴(kuò)張和收縮障礙。相反，Chagas病是心肌病的一種罕見形式，是一種炎癥性的心臟病，在慢性Trypanosoma cruzi感染后，在人類和試驗(yàn)動物中產(chǎn)生。Chagas病在美國中部和南部流行，對Chagas病的研究已經(jīng)在Chagas病患者的血清中鑒定出抗自身的抗體。Joshua Wynne 和 Eugene Braunwald, Heart Disease, A Textbook of CardiovascularMedicine, 2，Ch.41，1442-1444 (第五版1997)。本文公開的方法被用于治療更加常見的、與TWEAK活性相關(guān)的非炎癥型的充血性心肌病。
[0132]一個成年人的腎臟每天處理超過1，700L血液，產(chǎn)生大約IL尿液。腎臟在廢物排泄、代謝，水、鹽和PH平衡中起作用，以及對內(nèi)分泌系統(tǒng)起作用。腎臟疾病更可能導(dǎo)致發(fā)病而不是死亡，美國每年死亡約35，000人。相反，每年有數(shù)百萬人遭受非致死性腎臟疾病，如感染、腎結(jié)石和尿路堵塞。
[0133]典型地，腎小球腎病由于免疫紊亂引起，而腎小管和腎間質(zhì)紊亂通常由毒素或感染劑引起。部分腎臟疾病包括急性腎病綜合癥、無病癥的血尿癥或蛋白尿癥、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、腎小管缺陷、尿路感染、腎結(jié)石、尿路阻塞和腎臟纖維變性。
[0134]包括腎小管損傷的腎臟損傷通常也包括間質(zhì)組織損傷。腎小管疾病可以是炎癥性的或?qū)嵸|(zhì)上非炎癥性的，包括局部缺血或中毒性的腎小管損傷。部分腎小管疾病的列表包括急性腎小管壞死和急性腎衰竭；腎小管的炎癥反應(yīng)和間質(zhì)組織炎癥反應(yīng)(腎小管間質(zhì)組織腎炎)；腎小管增生；腎小管間質(zhì)組織纖維變性(由腎小管上皮細(xì)胞與間質(zhì)組織成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、腎小球超濾液、細(xì)胞因子和化學(xué)因子成分引起的疤痕疾病)；和常染色體顯性的多囊性腎臟疾病(ADPKD)(—種由PKDl或PKD2基因突變引起的遺傳紊亂，特征為來自腎小管和集合管的大、充滿液體的囊腫)。
[0135]腎小球疾病是最令人恐懼的腎臟疾病。例如，慢性腎小球腎炎是人的慢性腎衰竭的最常見原因。在所謂的次級腎小球疾病中，腎小球可能通過免疫紊亂受損，免疫紊亂如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，以及血管疾病，如高血壓和結(jié)節(jié)性多動脈炎。此外，代謝疾病，如糖尿病(即糖尿病腎病)和遺傳性病癥，如Fabry病，影響腎小球。最主要的腎小球疾病包括主要的腎小球腎炎和腎小球腎病。
[0136]遺傳性腎炎包括主要與腎小球損傷相關(guān)的家族性腎臟疾病。Alports綜合癥是一種腎炎形式，伴隨著神經(jīng)性耳聾和各種眼病，包括晶狀體脫落、晚期白內(nèi)障和角膜營養(yǎng)失調(diào)。這些疾病由于其顯性X連鎖基因型，在男性中更加普遍。但是由于常染色體其中之一的顯性和隱性基因型，某些女性也患有此病。Alport腎臟的腎小球表現(xiàn)為節(jié)段性的增生或硬化。有時由于中性脂肪和粘多糖沉積，上皮細(xì)胞具有泡沫狀外觀。腎小球和腎小管基底膜表現(xiàn)為不規(guī)則的增厚或變薄，伴隨致密板的斷裂和疊片。
[0137]由于腎臟疾病具有極其重要的臨床意義，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到需要了解其生理的和遺傳的病因。本領(lǐng)域技術(shù)人員還意識到需要開發(fā)用于治療慢性和急性腎臟疾病的新治療試劑。本發(fā)明首次證明了 TWEAK和腎臟疾病之間的因果關(guān)系。
[0138]因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療腎臟疾病的方法。在一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，腎臟疾病可以是Alport綜合癥。在本發(fā)明的其他更加優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)腎臟疾病的特征為多病灶的炎癥、腎小管腎病、腎小管增生、囊腫、腎小球腎病、腎小管液泡化、纖維變性或透明管型。
[0139]肺部疾病曾經(jīng)并仍然是人類普遍罹患的疾病。主要的呼吸系統(tǒng)感染，如支氣管炎，支氣管肺炎和其他類型肺炎，通常必須由醫(yī)生治療。肺部疾病可能會因?yàn)榄h(huán)境因素如吸煙、空氣污染和其他吸入物惡化。慢性支氣管炎、肺氣腫、肺纖維變性和惡性腫瘤也是非常常見的。其次還涉及許多晚期疾病，在最嚴(yán)重的患者中存在肺水腫、肺腫漲不全，或支氣管肺炎。
[0140]哮喘是慢性復(fù)發(fā)的炎癥性疾病，表現(xiàn)為超反應(yīng)氣道。該綜合癥典型地表現(xiàn)為陣發(fā)性、可逆的支氣管狹窄。哮喘由氣管支氣管樹對各種刺激反應(yīng)增加引起，通常與IgE對外部變應(yīng)原反應(yīng)相關(guān)。
[0141]有兩種主要類型的哮喘。第一種類型為外源性哮喘，由暴露于外源性抗原引起的I型超敏性反應(yīng)起始。外源性哮喘病癥的列表包括特異反應(yīng)性(過敏性)哮喘、職業(yè)性哮喘和過敏性支氣管肺曲霉病。第二種類型是內(nèi)在哮喘，由非免疫性機(jī)制產(chǎn)生，被許多因素觸發(fā)，例如攝取阿司匹林、肺部感染、應(yīng)激、受冷、吸入刺激物和鍛煉。
[0142]本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到需要更加清楚了解肺部疾病，包括非炎癥性和炎癥性的疾病，如哮喘。更為深入的了解將方便開發(fā)用于治療肺部疾病的改進(jìn)的藥物制劑。本發(fā)明首次證明TWEAK與肺部疾病之間的因果關(guān)系，以及用于治療這些疾病的方法。在本發(fā)明的更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，肺部疾病的特征為炎癥，包括肉芽腫性和/或淋巴組織細(xì)胞性炎癥。
[0143]肝臟是消化和代謝平衡的主要調(diào)節(jié)器，包括食入的氨基酸、糖、脂肪和維生素的加工處理，以及血清蛋白的合成、解毒和將內(nèi)源性廢物和污染性生物異源物排泄到膽汁中。因此，肝臟疾病通常是非常嚴(yán)重的，有時威脅生命安全。
[0144]肝臟容易受到許多類型的疾病的攻擊，包括代謝性、毒性的、微生物的、循環(huán)的和腫瘤性轉(zhuǎn)化侵害。毒素或免疫紊亂可能引起肝細(xì)胞腫漲，外觀上變得水腫，具有不規(guī)則的叢生細(xì)胞質(zhì)和大片清澈的空間。此外，滯留的膽汁物質(zhì)可能引起肝臟細(xì)胞變?yōu)榕菽瓲詈湍[漲。物質(zhì)如鐵、銅和脂肪小滴(脂肪變性)的沉積物可在肝細(xì)胞內(nèi)集聚。在酒精性肝病和懷孕的急性脂肪肝的情況下，出現(xiàn)沒有轉(zhuǎn)移核的微滴(稱作微泡脂肪變性)。
[0145]肝細(xì)胞壞死從嚴(yán)重的肝臟損傷產(chǎn)生，表現(xiàn)為，其中，局部缺血性凝結(jié)物壞死。通常，毒性的或免疫學(xué)相關(guān)的病癥中的細(xì)胞死亡表現(xiàn)為聚集的肝細(xì)胞和收縮、固縮、強(qiáng)烈的嗜曙紅性的含有核片段的“聚集體”(Councilman bodies)(由凋亡產(chǎn)生)?？蛇x擇地，肝細(xì)胞可能滲透性腫漲和破裂(細(xì)胞溶解壞死)。[0146]肝炎由對肝臟的某些損傷引起，與急性或慢性炎癥細(xì)胞的流入相關(guān)。肝細(xì)胞壞死可能在炎癥開始之前，或者反之亦然。纖維變性，是肝臟損傷的一種不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)果，通常由炎癥或非炎癥性機(jī)制產(chǎn)生，例如直接毒性侵害。膠原的特征性沉積影響血流和肝細(xì)胞灌注。伴隨連續(xù)纖維變性，肝臟被細(xì)分為具有周圍疤痕組織的再生肝細(xì)胞結(jié)節(jié)(硬化)。
[0147]卵形細(xì)胞(oval cell)因其外形為小的、增生性的上皮細(xì)胞，具有卵圓形細(xì)胞核和稀疏的嗜堿性細(xì)胞質(zhì)而得名。卵形細(xì)胞通常定居在連接肝內(nèi)導(dǎo)管的末端膽管中，所述肝內(nèi)導(dǎo)管位于具有肝細(xì)胞索的肝門三聯(lián)中。這些細(xì)胞來源于定居的肝臟祖細(xì)胞，或來自循環(huán)或定向于肝臟的骨髓祖細(xì)胞。這些導(dǎo)管性祖細(xì)胞具有分化為膽汁導(dǎo)管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的潛能。本發(fā)明證明在小鼠中TWEAK轉(zhuǎn)基因的表達(dá)能夠擴(kuò)增導(dǎo)管祖細(xì)胞群體。
[0148]由于肝臟疾病引起的高水平發(fā)病率和死亡率，本領(lǐng)域認(rèn)識到必須闡明這種疾病的分子和遺傳基礎(chǔ)。確定因果關(guān)系因素便于發(fā)現(xiàn)用于治療慢性和急性肝臟疾病的治療試劑。本發(fā)明證明了 TWEAK與肝臟疾病之間的因果關(guān)系，并且有力地提供用于治療這些疾病的方法。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，肝臟疾病是上皮增生、肝細(xì)胞液泡化、導(dǎo)致纖維變性的膽管損傷、肝細(xì)胞死亡或肝臟損傷。
[0149]骨骼肌系統(tǒng)對于體態(tài)和運(yùn)動是非常重要的。停止使用會使骨骼肌萎縮，這可能亞于去除神經(jīng)或血液供應(yīng)和暴露于藥物如糖腎上腺皮質(zhì)激素的病癥。在遺傳或退化性病癥中骨骼肌也可能萎縮。這些病癥或疾病可以是炎癥性的或?qū)嵸|(zhì)上非炎癥性的。肌肉營養(yǎng)失調(diào)組成了大量的遺傳性肌病，在不是神經(jīng)疾病時表現(xiàn)為萎縮和丟失肌纖維；該病中包括的一種常見形式是Duchenne肌肉營養(yǎng)失調(diào)。先天性肌肉疾病還可能發(fā)生在糖原儲存疾病的情況下，如酸性麥芽糖酶缺乏癥，在肌無力、運(yùn)動差、心臟擴(kuò)大，并且通常早年死于心力衰竭的嬰兒中發(fā)生。導(dǎo)致肌肉萎縮的先天性疾病還包括但是不限于線粒體肌病、脂肪肌病、中心管肌病和橫紋肌溶解。肌病病癥還在成年人中產(chǎn)生，最為常見的是酒精性肌病。骨骼肌萎縮還可以作為神經(jīng)性疾病的一部分，包括但是不限于肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。此外，骨骼肌萎縮還被稱為惡病質(zhì)，是最末期的癌癥患者中存在的重要病理狀況，并且通常直接導(dǎo)致患者死亡。在炎癥或自體免疫中發(fā)生的骨骼肌疾病包括多肌炎，炎癥性肌病，和腎上腺糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的萎縮。本發(fā)明建立了 TWEAK與成肌細(xì)胞分化為肌管的能力之間的聯(lián)系。因此，本發(fā)明的目的在于提供通過采用體內(nèi)或體外方法促進(jìn)骨骼肌再生來治療骨骼肌疾病的方法。
[0150]在肥胖病癥中發(fā)生脂肪細(xì)胞聚積，這些病癥包括與代謝紊亂相關(guān)的肥胖癥如II型糖尿病。脂肪細(xì)胞內(nèi)生到器官中，稱作脂肪浸潤，發(fā)生在各種條件下，是肌肉營養(yǎng)失調(diào)的病理構(gòu)成。本發(fā)明已經(jīng)證明了 TWEAK與前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的能力之間的聯(lián)系。因此，本發(fā)明的目的在于提供通過用TWEAK激動劑或拮抗劑或它們的藥物組合物調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化來治療與脂肪細(xì)胞沉積或脂肪細(xì)胞缺乏相關(guān)的疾病的方法。
[0151]按照本發(fā)明的治療TWEAK相關(guān)病癥的方法采用TWEAK激動劑或拮抗劑或包含它們的藥物組合物。本發(fā)明的治療TWEAK相關(guān)病癥的TWEAK激動劑或拮抗劑在本文被描述，并且是本領(lǐng)域已知的。這些試劑包括那些公開在如PCT國際公開W098/05783，W098/35061, W099/19490, W000/42073和W001/45730中，全部在此引入作為參考。用于本發(fā)明的方法中的TffEAK拮抗劑包括抗TWEAK的抗體，如人的、非人類的、人源化的或異種的抗體，如本文所描述，并且是單克隆的、多克隆的或合成的。而且，抗體可以是全長的，其片段，或者包含抗原識別序列的融合蛋白。
[0152]用于本發(fā)明的方法的TWEAK拮抗劑還包括抗TWEAK受體的抗體。在此，TWEAK受體可以是FN14或者被TWEAK結(jié)合的TNF-R家族的其他成員?？筎WEAK受體的抗體可以人的、非人類的、人源化的或異種的抗體，如本文所描述，并且是單克隆的、多克隆的或合成的。而且，抗體可以是全長的，其片段，或者包含抗原識別序列的融合蛋白。
[0153]用TWEAK或TWEAK受體抗原免疫動物可以通過本領(lǐng)域知曉的任何方法進(jìn)行。參見如 Harlow 和 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,紐約:Cold Spring HarborPress, 1990。用于免疫非人動物的方法在本領(lǐng)域是已知的，參見如Harlow和Lane以及美國專利5，994，619，動物如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛、馬等。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原與或不與佐劑一起被施用，來刺激免疫反應(yīng)。這種佐劑包括，其中，完全或不完全的Freund佐劑、RIBI (胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)。 [0154]被選擇用于免疫的抗原可以是如下任何之一 =TWEAK多肽=TWEAK多肽片段；TWEAK突變蛋白；TWEAK模擬物；TWEAK融合蛋白；TWEAK受體多肽；TWEAK受體片段；TWEAK受體突變蛋白；TWEAK受體模擬物；TWEAK受體融合蛋白；表達(dá)TWEAK多肽、片段、突變蛋白或其融合蛋白的細(xì)胞；表達(dá)TWEAK受體多肽、片段、突變蛋白或其融合蛋白的細(xì)胞。通過免疫在動物中產(chǎn)生的免疫球蛋白從各種組織或動物的體液中收集，包括血清、乳汁、腹水、脾臟、胸腺、外周血液細(xì)胞、胎兒肝臟、骨髓、腹膜和任何其他具有高免疫球蛋白濃度的組織或體液。此外，可以制備和分離雜交瘤，其將單克隆抗體分泌到培養(yǎng)液中。
[0155]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體、單克隆抗體或人源化抗體。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化抗體包含人抗體恒定區(qū)和/或構(gòu)架區(qū)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是異種抗體。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，異種抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0156]異種抗體是一種物種的完整抗體，其在一個完全不同的物種中被表達(dá)。例如，如果小鼠表達(dá)用于制備完整的人抗體所需的DNA，那么生成的抗體是異種的(即在小鼠中制備的人抗體)。靶向滅活(敲除)技術(shù)提供破壞動物正常表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白基因的可能。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)提供了制備生產(chǎn)異種免疫球蛋白的非人類動物的機(jī)會。這種異種動物可以與上述免疫球蛋白敲除的動物交配，生成僅生產(chǎn)異種免疫球蛋白而不是內(nèi)源免疫球蛋白的動物。
[0157]異種免疫球蛋白基因的表達(dá)使得可以產(chǎn)生極度多樣化的人抗體譜，包括單克隆抗體。這是因?yàn)?I)外源免疫球蛋白基因保留其順式調(diào)控元件，并且經(jīng)受宿主動物的正常的變化(V)、多樣(D)和連接(J)重組事件；(2)外源免疫球蛋白基因以與內(nèi)源免疫球蛋白基因座相似的方式被表達(dá)；和(3)生成的抗體顯然支持正常的B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和體液反應(yīng)。
[0158]外源免疫球蛋白基因可以被導(dǎo)入到動物中，作為完整的免疫球蛋白基因座，免疫球蛋白基因座的一部分，或作為“微小的基因座(minilocus) ”，其中比較完整的外源Ig基因座通過包含來自該Ig基因座的少量單個基因來模擬。此外，轉(zhuǎn)基因動物可以被加工來表達(dá)編碼改進(jìn)的抗體的轉(zhuǎn)基因，如單鏈抗體或嵌合抗體。[0159]用于本發(fā)明的方法的TWEAK激動劑或拮抗劑還可以是如本文所描述的TWEAK多肽或其片段、類似物、突變蛋白或模擬物。類似物區(qū)別于天然的TWEAK氨基酸序列，或以不涉及該序列的形式存在，或兩者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，TWEAK多肽類似物是突變蛋白。制備突變蛋白的方法在分子生物學(xué)領(lǐng)域是熟知的，包括通過隨機(jī)突變、定點(diǎn)突變、缺失和截?cái)鄟砀淖僁NA分子。用于突變DNA的技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的，并且包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)突變、飽和(即化學(xué)的或放射的)突變、DNA化學(xué)合成、丙氨酸掃描突變、寡核苷酸介導(dǎo)的突變(體外與DNA模板雜交隨后通過酶催化延長)、表達(dá)盒(重組的)突變，和組合突變(將隨機(jī)降解的序列導(dǎo)入TWEAK DNA中)。
[0160]TffEAK多肽結(jié)合到TWEAK受體上，結(jié)合到其他TWEAK多肽上，或結(jié)合到其他TWEAK作用的配偶體上。TWEAK片段可以是膜結(jié)合的，并且可以在藥物組合物中被傳遞，該組合物中包含脂質(zhì)體或其他細(xì)胞的或擬細(xì)胞的傳遞系統(tǒng)。TWEAK片段還可以是可溶性的TWEAK多肽，其含有去除跨膜結(jié)構(gòu)域的截?cái)嗷騼?nèi)部缺失。此外，用于本發(fā)明的方法的TWEAK多肽可能不產(chǎn)生TWEAK反應(yīng)，或者導(dǎo)致改變的TWEAK反應(yīng)。這種TWEAK多肽的例子是TWEAK蛋白類似物，包括缺失或截?cái)嗟耐蛔凅w、含有一個或多個氨基酸取代的肽、TWEAK模擬物，以及非氨基酸序列改進(jìn)的TWEAK多肽。
[0161]用于本發(fā)明的方法的TWEAK激動劑或拮抗劑還可以是如本文描述的TWEAK受體多肽，或其片段、類似物、突變蛋白或模擬物。TWEAK受體多肽可以被TWEAK多肽結(jié)合，或結(jié)合到其他TWEAK受體多肽 ，或結(jié)合到其他TWEAK受體作用配偶體上。TffEAK受體片段可以是膜結(jié)合的，并且可以在藥物組合物中被呈遞，該組合物包含脂質(zhì)體或其他細(xì)胞的或擬細(xì)胞的呈遞系統(tǒng)。TffEAK受體片段還可以是可溶性的TWEAK受體多肽，其含有去除跨膜結(jié)構(gòu)域的截?cái)嗷騼?nèi)部缺失。此外，用于本發(fā)明的方法的TWEAK受體多肽可能不產(chǎn)生TWEAK反應(yīng)，或者產(chǎn)生改變的TWEAK反應(yīng)。這種TWEAK受體多肽的例子是TWEAK受體蛋白類似物，包括缺失或截?cái)嗟耐蛔凅w、含有一個或多個氨基酸取代的肽、TWEAK受體模擬物，以及非氨基酸序列改進(jìn)的TWEAK受體多肽。
[0162]此外，用于本發(fā)明的方法中的TWEAK激動劑或拮抗劑可以是有機(jī)或無機(jī)的化合物。有機(jī)化合物可以是小的有機(jī)化合物，如在本領(lǐng)域熟知的化學(xué)文庫中發(fā)現(xiàn)的化合物。其他有機(jī)化合物包括但是不限于核酸、多肽、糖、脂質(zhì)和脂肪酸、類固醇，或者它們的衍生物。無機(jī)化合物可以是基于硅石(silica)的或其他礦物質(zhì)和鹽的。有機(jī)或無機(jī)的化合物可以結(jié)合到如本文描述的TWEAK多肽、TffEAK受體多肽或其他與TWEAK相互作用的配偶體上。
[0163]對TWEAK或TWEAK受體的非序列修飾可以從體內(nèi)或體外化學(xué)衍生該多肽中產(chǎn)生，包括但是不限于，乙?；⒓谆?、磷酸化、羧化、氧化態(tài)或糖基化的改變。此外，化學(xué)衍生可以包括偶聯(lián)到有機(jī)多聚物上，如聚乙二醇(PEG)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已知的其他多聚物上。因此，TWEAK多肽類似物可以從非氨基酸序列修飾中產(chǎn)生。
[0164]TWEAK或TWEAK多肽可以作為融合蛋白被表達(dá)。融合蛋白在本領(lǐng)域是熟知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從大量不同融合配偶體成分中選擇，包括那些來自原核生物和真核生物的。
[0165]按照本發(fā)明，任何個體包括人和動物可以以藥學(xué)上可接受的方式用藥學(xué)上有效量的TWEAK激動劑或拮抗劑或包含這種試劑的組合物處理一段時間，足以在被施用一段時間的個體中治療TWEAK相關(guān)病癥?？蛇x擇地，個體可以接受預(yù)防有效量的TWEAK激動劑或拮抗劑或者含有這種試劑的組合物，足以在被施用一段時間的個體中預(yù)防TWEAK相關(guān)病癥?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的TWEAK激動劑或拮抗劑可以通過本文公開的方法被配制在藥物組合物中，并且可以通過胃腸外路徑、注射、經(jīng)粘膜、口服、吸入、眼部、直腸、長效埋植、體表、緩釋或支架包被(stent coating)的方法。TWEAK激動劑或拮抗劑可以是各種用于施用的常規(guī)方式。包括例如固體、半固體的和液體的劑量形式，例如液體溶液和懸浮液、漿液、凝膠、面霜、香膏、乳劑、洗液、粉末、噴霧劑、泡沫、貼劑、油膏、藥膏和滴劑。
[0166]此外，TWEAK激動劑或拮抗劑可以通過基因治療路徑來呈遞。簡而言之，編碼蛋白或表達(dá)反義分子的核酸分子可以采用任何本領(lǐng)域知曉的適合將核酸分子呈遞到靶向組織或器官的載體呈遞給機(jī)體。典型的載體包括脂質(zhì)體、質(zhì)粒和病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
[0167]TffEAK激動劑或拮抗劑或包含它們的組合物的最有效的施用模式和劑量方案將取決于期望的效果、先前的治療方法，如果有的話，個體健康狀況、病癥本身的狀況、對TWEAK激動劑或拮抗劑的反應(yīng)以及治療醫(yī)生的判斷。TffEAK激動劑或拮抗劑,或者包含它們的組合物可以以醫(yī)藥或獸醫(yī)制備物可接受的任何劑量形式一次或在一系列治療中被施用。
[0168]提供單一劑量時，TWEAK激動劑或拮抗劑，或者包含它們的組合物的量將依賴于特定的施用模式，特定TWEAK激動劑或拮抗劑，或組合物，劑量水平和劑量頻率。典型的制備物將含有在約0.01%和約99%之間的，優(yōu)選在約1%和約50%之間的TWEAK激動劑或拮抗劑或者它們的組合物(w/w)。
[0169]治療的或預(yù)防的有效量的 TWEAK激動劑或拮抗劑的示例性的、非限定的范圍在約
0.005-10.00mg/kg體重之間，更加優(yōu)選在約0.05-1.0mg/kg體重之間。
[0170]TffEAK激動劑或拮抗劑，或者包含它們的組合物可以被單獨(dú)施用，或者作為制藥的或獸醫(yī)的制備物的一部分，或者作為預(yù)防性制備物的一部分，含有或不含佐劑。它們通過胃腸外或口服路徑被施用。例如，可以通過口腔、肺、鼻腔、耳朵、肛門、真皮、眼部、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、粘膜、舌下、皮下、經(jīng)皮、體表或顱骨內(nèi)路徑施用，或者被施用到口腔內(nèi)。在醫(yī)藥或獸醫(yī)上應(yīng)用，TWEAK激動劑或拮抗劑可以被局部施用到任何上皮表面。這種表面包括口腔、眼部、耳朵、肛門和鼻腔表面。藥物組合物可以通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制備糖衣、粉碎、乳化、裝入膠囊、包載或凍干方法來制備。
[0171]用于按照本發(fā)明的用途的藥物組合物可以以常規(guī)的方式被配制，采用一種或多種生理上可接受的載體，包括賦形劑和輔劑，其方便將活性化合物加工到可以被藥學(xué)上使用的制備物中。合適的制劑將取決于特定的施用路徑。
[0172]對于經(jīng)粘膜的施用，在制劑中使用適合透過屏障的滲透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域通常是已知的。對于眼部施用，使用在適當(dāng)?shù)柠}水溶液中的懸浮液，這在本領(lǐng)域是已知的。
[0173]對于口服使用，TWEAK激動劑或拮抗劑很容易通過將活性試劑與常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合來配制。TWEAK激動劑或拮抗劑可以被配制成藥片、藥丸、脂質(zhì)體、顆粒、球體、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、果汁、糖漿、懸浮液等，給被處理的患者口服攝取。
[0174]TWEAK激動劑或拮抗劑或包含它們的組合物，還可以包含任何用于醫(yī)藥品或獸醫(yī)制備物的常規(guī)載體或佐劑。這些載體或佐劑包括如Freund佐劑、離子交換物、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、緩沖物質(zhì)，如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物性脂肪酸的不完全甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)，例如魚精蛋白硫酸鹽、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、鎂、三硅酸鹽、纖維素物質(zhì)和聚乙二醇。用于體表或凝膠形式的佐劑可以包括，例如，羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鹽、聚氧乙烯-聚氧丙烯-阻斷的聚合體、聚乙二醇和木臘酒精(wood waxalcohol)。
[0175]用于口服使用的藥物組合物可以作為固體賦形劑獲得，可選擇地碾磨生成的混合物，并加工顆?；旌衔?，如果需要在加入合適的輔劑后進(jìn)行，來獲得片劑或糖衣丸的核心。合適的賦形劑包括填充物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制備物如，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入分解劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或褐藻酸或其鹽，如藻酸鈉。
[0176]糖衣丸核心用合適的包被提供。為此，采用濃縮的糖溶液，其可選擇地含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol膠、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液(lacquersolution)、和合適的有機(jī)溶劑和溶劑混合物。染料或色素可以被加入到片劑或糖衣丸包被中來用于辨認(rèn)或者用于表征不同的活性化合物劑量的組合。
[0177]可以口服使用的藥物組合物包括由明膠制備的推入式(push-fit)膠囊，以及由明膠和可塑劑制備的軟的密封膠囊，可塑劑如甘油和山梨醇。推入式的膠囊可以含有活性成分，其與填充物如乳糖、粘合劑如淀粉，和/或滑潤劑如滑石粉或硬酯酸鎂，以及可選擇地，穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性化合物可以被溶解或懸浮在合適的液體中，如脂肪性油、液體石蠟、或者液體聚乙二醇。此外，可以加入穩(wěn)定劑。用于口服施用的所有組合物應(yīng)當(dāng)為適合這種施用的劑量。
[0178]對于口腔施用，組合物采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。
[0179]對于通過吸入施用，TffEAK激動劑或拮抗劑通常以從加壓包裝或噴霧器中產(chǎn)生的氣霧噴霧的方式方便遞送，使用合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在為加壓的氣霧劑時，劑量單位可以通過提供用于呈遞測定量的閥門來決定。用于吸入器或吹入器中的膠囊和藥筒如明膠的，可以配制成含有化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末狀混合物。
[0180]TWEAK激動劑或拮抗劑可以被配制來用于通過注射的胃腸外施用，如通過大藥丸注射，或連續(xù)灌注。該試劑可以被配制在水溶液中，水溶性懸浮液中，油性懸浮液中，或者乳狀液中，并且可能含有配制試劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于注射的劑型可以單位劑量的形式呈遞，如在安瓿中或在多劑量容器中，加入防腐劑。
[0181]典型的水溶液制劑包括生理相容的緩沖液，如Hanks溶液、Ringer溶液或者生理鹽水緩沖液。典型的油性懸浮液可以包括親脂性溶劑或賦形劑，包括脂肪酸如芝麻油、或合成的脂肪酸酯，如乙基油酸酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水溶液注射懸浮液可以還有提高懸浮液粘度的物質(zhì)，如羥甲基纖維素鈉，山梨醇或葡聚糖?？蛇x擇地，懸浮液還可以含有合適的穩(wěn)定劑或提高化合物溶解性的試劑，以制備高濃度的溶液?？蛇x擇地，在使用前，TWEAK激動劑或拮抗劑可以粉末的形式來與合適的賦形劑配制，例如滅菌的無致熱原水。
[0182]TffEAK激動劑或拮抗劑還可以配制成直腸組合物，如栓劑或滯留灌腸劑，如含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可油或其他甘油酯。
[0183]除了所描述的劑型，TWEAK激動劑或拮抗劑還可以配制成存儲制備物。這種長效制劑可以通過植入(例如皮下地或肌肉內(nèi)地)或者通過肌肉內(nèi)注射施用。因此，例如，該化合物可以與合適的聚合的或疏水的物質(zhì)(例如作為可接受的油中的乳劑)或者離子交換樹脂一起配制，或者配制成難溶(sparingly soluble)的衍生物,作為難溶的鹽。
[0184]TffEAK激動劑或拮抗劑的藥學(xué)上載體是疏水性的，是包含苯甲醇、非極性表面活性劑、易溶于水的有機(jī)聚合物和水相的共溶劑系統(tǒng)。共溶劑系統(tǒng)可以是VPD共溶劑系統(tǒng)。VPD是具有3%w/v苯甲醇、8%w/v非極性表面活性劑聚山梨醇酯80和65%w/v聚乙二醇300的溶液，加入無水乙醇到總體積。VPD共溶劑系統(tǒng)(VPD:5ff)由VPD與5%葡聚糖水溶液以1:1稀釋組成。這種共溶劑系統(tǒng)對疏水性化合物的溶解性高，并且其本身在系統(tǒng)施用時產(chǎn)生的毒性低。自然地，共溶劑系統(tǒng)的組成可以極大地改變而不破壞其溶解性和毒性特性。此外，對共溶劑成分的確定也是變化的:例如，其他的低毒性非極性表面活性劑可以被用來替代聚山梨醇酯80 ;聚乙二醇的含量多少也是可以變化的；其他生物相容的聚合物可以替換聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；并且其他糖或多糖可以用于替代葡聚糖。
[0185]可選擇地，可以采用其他用于疏水性藥物組合物的呈遞系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是用于疏水性藥物的呈遞賦形劑或載體的例子。某些有機(jī)溶劑，如二甲基亞砜也可以被使用，雖然它們具有較大的毒性。
[0186]此外，TWEAK激動劑或拮抗劑可以采用緩釋系統(tǒng)來呈遞，如含有治療劑的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)。各種緩釋物質(zhì)是可以獲得的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，緩釋膠囊可以釋放化合物數(shù)周到超過100天。
[0187]根據(jù)TWEAK激動劑或拮抗劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，還可以采用其他用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定的策略。
[0188]藥物組合物還可以包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的例子包括但是不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物如聚乙二
醇。
[0189]TWEAK激動劑或拮抗劑作為具有藥學(xué)上相容的平衡離子的鹽被提供。藥學(xué)上相容的鹽可以用許多酸加工形成，包括但是不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽傾向于更容易溶解在水或其他質(zhì)子溶劑中，是相應(yīng)的無堿基形式。
[0190]TWEAK激動劑或拮抗劑還可以被配制成用于包被支架的藥物組合物，來治療與TWEAK相關(guān)的心臟病癥。
[0191]本發(fā)明還涉及用于鑒定TWEAK激動劑或拮抗劑的方法。這種TWEAK激動劑或拮抗劑可用于治療TWEAK相關(guān)病癥，即疾病，損傷狀況或組織的其他病理狀況，其中TWEAK受體如FN14被表達(dá)。這些病癥包括纖維變性和心臟(如心肌病)、腎臟、肺部、肝臟、皮膚、骨骼肌、脂肪代謝(如肥胖癥)、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經(jīng)組織(包括神經(jīng)退行性病變)、軟骨、骨和結(jié)締組織的疾病。這種TWEAK激動劑或拮抗劑還可以用于按照本發(fā)明通過體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)祖細(xì)胞的行為來促進(jìn)組織替換。
[0192]用于鑒定TWEAK拮抗劑的方法的一個實(shí)施例包括步驟:1)將表達(dá)編碼TWEAK多肽或其片段、類似物、突變蛋白或模擬物的外源DNA轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)動物暴露于候選的TWEAK拮抗劑的化合物；2)將來自轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)動物的纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經(jīng)、軟骨、骨或結(jié)締組織與來自表達(dá)外源DNA但是不暴露于該化合物的參比動物的相同器官或組織相比較；和3)確定該化合物是否影響纖維變性的、心臟、腎臟、肝臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經(jīng)、軟骨、骨或結(jié)締組織。在另一個實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)動物是哺乳動物或非哺乳動物，如本文所述。
[0193]本文公開的轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)編碼TWEAK多肽的外源DNA，其中該表達(dá)導(dǎo)致TWEAK相關(guān)病癥。在該實(shí)施例中，產(chǎn)生表達(dá)截?cái)嗟?、可溶性形式或全長的、膜結(jié)合形式的外源TWEAK蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。表達(dá)外源TWEAK蛋白的小鼠具有表型，該表型包括非炎癥性充血性心肌病，充血性心力衰竭，肝臟上皮細(xì)胞增生，肝細(xì)胞液泡化，肝臟損傷和炎癥性腎臟病癥，如多病灶炎癥，非炎癥性腎臟病癥，如腎小管腎病、囊腫、腎小球腎病、腎小管增生、腎臟纖維變性和炎癥性肺病。此外，用表達(dá)外源TWEAK蛋白的各種病毒載體感染的野生型小鼠表現(xiàn)為腎小管增生、肝細(xì)胞死亡、肝臟纖維變性和肝臟損傷等。
[0194]有了這些動物，本領(lǐng)域技術(shù)人員便擁有用于發(fā)現(xiàn)藥物的有力工具。特別地，表達(dá)外源TWEAK蛋白的動物可作為實(shí)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)用于預(yù)防或治療本文公開的TWEAK相關(guān)病癥的TWEAK激動劑或拮抗劑的方法的模型系統(tǒng)。
[0195]在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于動物模型系統(tǒng)的單位是哺乳動物或非哺乳動物。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動物是小鼠、大鼠、倉鼠、兔、狗、貓、奶牛、豬、山羊、馬、綿羊、豚鼠和靈長類。在更加優(yōu) 選的實(shí)施方案中，非哺乳動物的動物是鳥、魚、兩棲類、昆蟲和無脊椎動物。
[0196]編碼TWEAK多肽的外源DNA在轉(zhuǎn)基因動物中通過表達(dá)控制序列被表達(dá)，表達(dá)控制序列在動物中控制外源DNA的表達(dá)?？刂妻D(zhuǎn)錄的表達(dá)控制序列包括，如啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、基因座控制區(qū)、RNA聚合酶持續(xù)合成信號和染色質(zhì)重塑元件。控制轉(zhuǎn)錄后事件的表達(dá)控制序列包括剪接供體和受體位點(diǎn)和改變被轉(zhuǎn)錄的RNA的半衰期的序列，如指導(dǎo)poly (A)的添加序列或RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)?？刂品g的表達(dá)控制序列包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)，指引多肽靶向表達(dá)到或在特定細(xì)胞區(qū)室中的序列，和改進(jìn)翻譯速率和效率的5’和3’非翻譯區(qū)中的序列。
[0197]在轉(zhuǎn)基因動物中TWEAK表達(dá)的優(yōu)選表達(dá)控制序列包括指導(dǎo)高水平蛋白表達(dá)的病毒元件，如來自反轉(zhuǎn)錄病毒LTR的、巨細(xì)胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強(qiáng)子)的、猿猴病毒40 (SV40)(如SV40啟動子/增強(qiáng)子)、腺病毒(如腺病毒晚期啟動子(AdMLP))的、多瘤病毒的啟動子和/或增強(qiáng)子，以及強(qiáng)大的哺乳動物啟動子如天然的免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子。在一個實(shí)施方案中，編碼TWEAK多肽的DNA由α抗胰蛋白酶(AAT)啟動子起始。對病毒表達(dá)控制元件及其序列的進(jìn)一步描述，參見如美國專利5，168,062 ;4，510，245和 4，968，615。
[0198]外源DNA還可以在轉(zhuǎn)基因動物中從組織特異性表達(dá)控制元件包括啟動子中被表達(dá)。組織特異性表達(dá)控制元件在本領(lǐng)域是已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性例子包括肝臟特異性白蛋白啟動子(Pinkert等，Genes Dev.1:268-277(1987))、淋巴特異性啟動子(如 Calame 和 Eaton, Adv.Tmmunol.43:235-275 (1988) ；ffinoto 和Baltimore, EMBO J.8:729-733 (1989) ；Banerji 等，Cell33:729-740 (1983)；以及 Queen和 Baltimore, Cell33:741-748 (1983))、神經(jīng)細(xì)胞特異性啟動子(如 Byrne 和 RuddleProc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:5473-5477 (1989))、胰腺特異性啟動子(如 Edlund 等，Science230:912-916 (1985))、乳腺特異性啟動子(如美國專利4，873，316和歐洲專利申請264，166)，和發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子(如 Kessel 和 Gruss, Science249:374-379 (1990) ；CampesTilghman, Genes Dev.3:537-546 (1989))。組織特異性啟動子的其他非限制性例子包括心臟組織啟動子α肌漿球蛋白重鏈啟動子(MHC)、皮膚組織啟動子角蛋白-14(Κ14)、肺組織啟動子表面活性蛋白C(SPC)，以及腎臟組織啟動子Ksp鈣粘著蛋白和腎臟雄激素調(diào)控蛋白(KAP)。外源DNA還可以從可誘導(dǎo)的真核啟動子中被表達(dá)，如金屬硫蛋白(MT)啟動子，或本領(lǐng)域已知的其他可誘導(dǎo)的真核啟動子。
[0199]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物中被表達(dá)的TWEAK多肽可以是全長的TWEAK多肽。在另一個實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)的多肽是TWEAK多肽片段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，TffEAK多肽片段是可溶性TWEAK多肽。 [0200]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在組織中表達(dá)編碼TWEAK多肽的外源DNA的轉(zhuǎn)基因動物，該組織選自:心臟；血液、血管；肺；肝臟；腎臟；腦；胎盤；骨骼?。灰认?；脾；淋巴；胸腺；闌尾；外周血液淋巴細(xì)胞；胃腸道；神經(jīng)元；皮膚；脂肪細(xì)胞；軟骨；骨；結(jié)締組織。在一個實(shí)施方案中，TWEAK DNA由組成型啟動子啟動表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，該DNA由誘導(dǎo)型啟動子啟動表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，DNA由組織特異性啟動子啟動表達(dá)。
[0201]本發(fā)明還涉及鑒定TWEAK激動劑化合物的方法，該化合物作為治療劑來治療TffEAK相關(guān)病癥或用于按照本發(fā)明通過體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)祖細(xì)胞行為來促進(jìn)組織替換。激動劑候選化合物可以被施用給正常的動物中，并且評價它們對器官系統(tǒng)的作用。然后，來自被處理的動物的纖維變性的、心臟、肝臟、腎臟、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、胃腸道、胰腺、生殖器官、神經(jīng)、軟骨、骨或結(jié)締組織與未處理的動物的相同組織比較；從而確定該化合物是否已經(jīng)在任何所述組織中產(chǎn)生生物學(xué)作用。
[0202]本發(fā)明還涉及用于調(diào)控TWEAK的基因的鑒定方法，這種基因可能作為治療靶點(diǎn)來治療TWEAK相關(guān)病癥。例如，可以在TWEAK轉(zhuǎn)基因動物的各種組織中確定RNA模式，并且與正常動物比較，從而確定藥物靶點(diǎn)。
[0203]本發(fā)明的另一個目的是提供影響祖先干細(xì)胞增生或分化的方法，包括產(chǎn)生肌肉細(xì)胞、軟骨、骨或結(jié)締組織細(xì)胞類型的間質(zhì)干細(xì)胞類型，例如基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和真皮細(xì)胞。本發(fā)明的還有一個目的是提供影響卵形細(xì)胞的增生或分化能力的方法，卵形細(xì)胞產(chǎn)生膽汁上皮細(xì)胞或肝細(xì)胞和腎臟祖細(xì)胞，其產(chǎn)生小管的上皮。
實(shí)施例
[0204]為了更好地理解本發(fā)明，給出如下的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是用于闡述目的，而無論如何不被解釋為限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0205]實(shí)施例1
[0206]制備TWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠
[0207]為了鑒定TWEAK活性的靶向器官和TWEAK體內(nèi)信號的生物學(xué)結(jié)果，構(gòu)建兩種小鼠TWEAK表達(dá)構(gòu)建體，并采用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于在正常(C57Bl/6xDBA/2)Fl和(C57Bl/6xSJL/J)F2 小鼠中過度表達(dá) TffEAK0 R.S.Williams 和 P.D.Wagner, J.AppliedPhysiology88:1119-1126(2000)。所用的 TWEAK 表達(dá)構(gòu)建體如下:(I)來自 SEQ ID NO:1的氨基酸101-249的TWEAK cDNA編碼可溶性形式的鼠TWEAK(命名為sTWEAK)，位于小鼠IgG信號序列的下游，被插入到CH269表達(dá)載體(載體P⑶EP4衍生物(Invitrogen)，含有SV40poly A附加序列)，位于人α抗胰蛋白酶(AAT)啟動子和球蛋白內(nèi)含子的下游，位于人生長激素(hGH)poly A序列的上游；和⑵編碼全長的、跨膜形式的蛋白質(zhì)(命名為FL-TWEAK)的cDNA，對應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸1_249，被插入到pBlueScript表達(dá)載體上(如 Desplat-Jego 等,J.Neuroimmunology 133:116-123 (2002)所描述)，含有SV40poly A添加位點(diǎn)。然后FL-TWEAK序列加上poly A添加位點(diǎn)被分離，并克隆到另一個載體上；然后，含有ApoE增強(qiáng)子-人AAT啟動子調(diào)控區(qū)域的片段被插入到上游來構(gòu)建表達(dá)載體CA300。已經(jīng)證明AAT啟動子主要在肝臟中引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，而在其他組織中水平較低，包括腎臟。P.Koopman 等，Genes Dev.3:16-25 (1989)。
[0208]對于sTWEAK轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，采用對應(yīng)于SEQ ID NO:2的核苷酸468 — 488(5'引物)和核苷酸693 - 713的互補(bǔ)鏈序列(3'引物)的探針通過尾(tail)DNA PCR確定23種獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因建立者(founder)。此外，TffEAK的血清ELISA顯示這23只建立者動物中的10只在其血清中具有可檢測的TWEAK，范圍在0.06-3.0mg/ml。剩下的13只建立者不具有可檢測的血清TWEAK，即〈10ng/ml。10只PCR+中的9只，血清TWEAK+的建立者在約4_5月齡時開始發(fā)病。表現(xiàn)為體重下降，弓背，毛皮蓬亂和眼鏡凸出。這些建立者中的5只意外地死亡，具有發(fā)病病癥的剩下的4只被處死。相反，13只PCR+而血清陰性的建立者中僅I只發(fā)病或死亡。此外，4只PCR陰性的同窩仔畜中沒有一只發(fā)病/死亡。
[0209]對于FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，通過尾DNA PCR和Northern印跡分析肝臟組織中的TWEAK mRNA的表達(dá)來確定兩只獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因建立者。此外，檢測TWEAK的血清ELISA顯示這兩只建立者動物在其血清中都沒有可檢測水平的TWEAK，即少于10ng/ml。FL-TffEAK Tg建立者小鼠都沒有顯示臨床可觀察到的表型。 [0210]實(shí)施例2
[0211]用傳遞編碼aTWEAK的外源DNA的腺病毒載體感染的小鼠中TWEAK的過度表達(dá)
[0212]為了體內(nèi)確定過度表達(dá)TWEAK的生物學(xué)作用，采用如在Tao等，MolecularTherapy3:28-35 (2001)中描述的標(biāo)準(zhǔn)腺病毒技術(shù)用復(fù)制缺陷的腺病毒載體感染8_10周齡的C57BL/6雌性成年小鼠，該腺病毒具有驅(qū)動小鼠TWEAK ( “Adeno-TWEAK”)或水母綠色熒光蛋白(“GFP”)的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子。包含GFP的腺病毒載體(“Adeno-GFP”)用作陰性對照。為了確定小鼠是否成功地用Adeno-TWEAK構(gòu)建體感染，血清中的TWEAK蛋白質(zhì)水平被測定，并且采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測在不同時間點(diǎn)監(jiān)控。
[0213]在成年小鼠中系統(tǒng)地過度表達(dá)小鼠sTWEAK至少在三種主要器官:肝臟、腎臟和心臟中導(dǎo)致組織變化。參見表1。這些表達(dá)腺病毒構(gòu)建體的小鼠的表型與表1中來自實(shí)施例1的TWEAK Tg小鼠的表型比較。這些觀察值將在如下實(shí)施例中被更加詳細(xì)地討論。
[0214]表1:在成年小鼠中TWEAK過度表達(dá)導(dǎo)致組織重塑
[0215]u?.t , 成年小鼠中的成年小鼠(中的器f 表型 TWEAKTg___e Adeno-TWEAK Adeno-GFP
肝臟膽管增生__+__+__二_
肝細(xì)胞死亡_+-
腎臟腎小管增生++-
、 充血性心肌
心臟++- _ 病 ___
[0216]實(shí)施例3
[0217]sTWEAK和FL-TWEAK導(dǎo)致充血性心肌病
[0218]來自實(shí)施例1的4只存活的PCR+血清TWEAK+的建立者被處死，并檢測大體的形態(tài)異常。參見，表2。尸檢時肉眼觀察的結(jié)果表明心臟擴(kuò)大，與正常動物的心臟相比擴(kuò)大約2-3倍。由于擴(kuò)大的心臟表型出現(xiàn)在多個獨(dú)立的sTWEAK轉(zhuǎn)基因建立者中，這極不可能是由于個別的插入事件。而且，對sTWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠的血清化學(xué)的分析表明心臟特異性肌酸激
酶升高。
[0219]表2:sTWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠
[0220]
—[A^fTWEAK 表型_I
9/10在4_5月死亡j
10P€R+ °,06"3,° μΕ/Μ 4/5進(jìn)行組織病理分析檢查具有擴(kuò)大的心臟I13 PCR.<10 ng/ml 1/13在6個月時死亡，具有擴(kuò)大的心臟 I4 PCR- ]—..........................................................................................................0/4在6個月死亡j
[0221 ] 擴(kuò)大的心臟的表型還在來自一個FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠品系的個別小鼠中觀察到，該品系通過連續(xù)與C57BL/6品系回交建立。參見，表3。FL-TWEAK陰性的同窩小鼠不表現(xiàn)心臟異常。
[0222]表3 =FL-TffEAK轉(zhuǎn)基因小鼠
[0223]
TwI血清TWEAKI表型
7PCR+ ~7/7在5個月時表現(xiàn)為擴(kuò)大的心臟~
4PCR- 〈10ng/ml0/4在5個月時死亡
[0224]總之，這些數(shù)據(jù)有力地表明，擴(kuò)大的心臟表型是TWEAK依賴的。
[0225]對來自sTWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠和FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟的組織病理學(xué)分析具有相似的結(jié)果。低倍顯微鏡觀察FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因心臟("Tg")與來自轉(zhuǎn)基因陰性("NTg")的同窩小鼠的正常心臟比較，結(jié)果顯示在附圖1中。所示的FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因心臟還代表了來自sTWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠的TWEAK轉(zhuǎn)基因心臟(PCR+，血清TWEAK+)。轉(zhuǎn)基因心臟顯示充血性心肌病，表現(xiàn)為心室和心房擴(kuò)張。與這種缺陷一致，在許多這些動物中觀察到心房和心室血栓癥(附圖1)。對肺和肝臟的分析表明在一些動物中的血管充血。
[0226]高倍顯微鏡觀察結(jié)果顯示了心臟中的其他組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，包括心肌細(xì)胞增生和核過大。特別地，在TWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠中對心室的組織病理學(xué)分析表明沒有炎癥跡象。因此，觀察到的TWEAK相關(guān)心肌病實(shí)質(zhì)上是非炎癥性的。
[0227]對從sTWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠(3只建立者和I只后代小鼠)的末端采血的血清化學(xué)分析表明，肌酸激酶(CK)水平異常高，特別在心臟中(即MB型的CK)，證明高水平的心臟應(yīng)激/損傷。
[0228]8-10周齡的感染Adeno-TWEAK的C57BL/6雌性小鼠(參見實(shí)施例2)表現(xiàn)為充血性心肌病，與用陰性對照Adeno-GFP病毒感染的小鼠相比，其在感染3周后明顯。在TWEAK感染的小鼠中，心臟表現(xiàn)為腔室擴(kuò)張，如組織病理學(xué)所示(附圖2)。
[0229]總之，TWEAK被證明在心肌病中起重要作用，包括充血性心肌病和充血性心力衰竭(CHF) ο
[0230]實(shí)施 例4
[0231]TffEAK引起肝臟上皮細(xì)胞增生、肝細(xì)胞液泡化、肝細(xì)胞死亡
[0232]膽管增生、肝臟纖維變性和肝臟損傷
[0233]TWEAK在肝臟上皮增生和肝細(xì)胞液泡化中的作用在TWEAK和FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠以及用含有表達(dá)sTWEAK多肽的DNA的腺病毒感染的野生型小鼠的損傷中被顯示。
[0234]與NTg小鼠相比，來自實(shí)施例1的TWEAK Tg小鼠的肝臟在2周齡時表現(xiàn)出大量的膽管和卵形細(xì)胞增生。參見，附圖3、如表4所示，甚至在血清TWEAK水平〈10ng/ml時，兩只FL-TffEAK轉(zhuǎn)基因小鼠建立者的肝臟表現(xiàn)出輕微的膽管和卵形細(xì)胞增生。FL-TWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠回交C57BL/6背景顯示出大量的膽管和卵形細(xì)胞增生(表4)。
[0235]表4 =FL-TffEAK轉(zhuǎn)基因小鼠
[0236]
I血清 TWEAK (?
2只建立者<10ng/ml輕微的膽管和卵形細(xì)胞增生^
I只建立者回交C57BL/6 ~顯著的膽管和卵形細(xì)胞增生^
[0237]
[0238]類似地，TffEAK血清水平在0.2和3.0 μ g/ml之間的sTWEAK轉(zhuǎn)基因建立者表現(xiàn)出顯著的膽管和卵形細(xì)胞增生(表5)。
[0239]表5: sTWEAK轉(zhuǎn)基因小鼠
[0240]

I血清 TWEAK(--
9只建立者0.2 — 3.0 μ g/ml顯著的膽管和卵形細(xì)胞增生
I只建立者0.06 μ g/ml 輕微的膽管和卵形細(xì)胞增生[0241]這些膽汁和卵形的導(dǎo)管增生通過用A6mAb免疫組織化學(xué)(IHC)染色FL-TWEAK Tg肝臟切片來證實(shí)，這些切片取自實(shí)施例1的Tg小鼠，A6mAb將膽管上皮細(xì)胞和卵形細(xì)胞與月干細(xì)胞區(qū)別開(Engelhardt 等，Differentiation 45:29-37(1990))。附圖 4 表明，A6 陽性細(xì)胞增加， 其與門區(qū)相關(guān)，并且與NTg小鼠相比，其延伸到FL-TWEAK Tg的肝實(shí)質(zhì)。較高的放大倍數(shù)的來自FL-TWEAK Tg的小鼠的蘇木精和曙紅染色切片表明，在門區(qū)鄰近膽管的卵形細(xì)胞顯著增加(附圖5)。擴(kuò)增細(xì)胞核抗原(PCNA)的免疫組織化學(xué)證實(shí)，早在2周齡時，與NTg小鼠相比，TWEAK Tg小鼠中膽管和卵形細(xì)胞的擴(kuò)增頻率升高。在較晚的時間點(diǎn)上，即在8周齡到7月齡之間，也觀察到TWEAKTg小鼠中肝細(xì)胞的擴(kuò)增頻率與NTg小鼠相比升高了(未顯示)。此外，與NTg同窩小鼠相比，F(xiàn)L-TffEAK和sTWEAK都在來自實(shí)施例1的7月齡Tg小鼠中誘導(dǎo)肝細(xì)胞液泡化(附圖6)。
[0242]使用如實(shí)施例2的Adeno-TWEAK病毒的過度表達(dá)sTWEAK的8_10周齡的C57BL/6和BALB/c SCID小鼠顯示相當(dāng)高的血清TWEAK水平。參見，附圖7，其展示呈遞不同劑量的腺病毒對測定的血清TWEAK水平的影響。小鼠用IO11腺病毒顆粒/只小鼠靜脈內(nèi)感染(用“B”線表示)、用IOltl腺病毒顆粒/只小鼠靜脈內(nèi)感染(用“J”線表示)，或者用IO11腺病毒顆粒/只小鼠肌肉內(nèi)感染(用“H”線表示)。Adeno-sTWEAK感染的小鼠表現(xiàn)為肝臟損傷，在第3天和第7天在C57BL/6小鼠背景中觀察到血清黃疸，在第3天和第4天在BALB/c SCID小鼠背景中觀察到血清黃疸。一些BALB/c SCID小鼠在第4天死亡。
[0243]此外，如實(shí)施例2所述的Adeno-sTWEAK感染的小鼠還發(fā)生肝細(xì)胞死亡，早在施用后的2-3天就出現(xiàn)，這通過在第3天與對照GFP感染的肝臟(Adeno-GFP)相比，在TWEAK-感染的肝臟(Adeno-sTWEAK)中存在高水平的天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶("AST")和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶("ALT")的肝臟酶標(biāo)記得到證實(shí)(參見，表6和附圖8)。在感染后7天，在Adeno-GFP處理的小鼠中兩種肝臟酶也升高，這是可預(yù)期的，由于單獨(dú)由腺病毒載體引起炎癥。肝細(xì)胞死亡也出現(xiàn)在TWEAK感染的肝臟中，這通過組織形態(tài)學(xué)證實(shí)，表現(xiàn)為集聚的肝細(xì)胞和收縮、固縮、強(qiáng)烈的嗜曙紅的含有核碎片的“聚集體”(附圖8)。Adeno-sTWEAK處理的小鼠還產(chǎn)生強(qiáng)烈的增生性膽管反應(yīng)，在感染后的7天達(dá)到峰值，在第11天還很明顯(附圖8)。在TWEAK感染的肝臟中，還觀察到增生性的結(jié)構(gòu)，其表達(dá)特異于膽管上皮和卵形細(xì)胞的A6標(biāo)記，這通過亮視野顯微鏡確定。
[0244]表6:Ad-TWEAK和Ad-GFP動物中的肝臟酶數(shù)值
[0245]
【權(quán)利要求】
1.TWEAK拮抗劑在制備用于在機(jī)體內(nèi)治療或預(yù)防與TWEAK活性相關(guān)的充血性心肌病的藥劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述TWEAK拮抗劑能夠干擾TWEAK與其細(xì)胞受體之間的相互作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述TWEAK拮抗劑包含:(a)抗TWEAK抗體；(b)抗TffEAK受體抗體，或(c) TffEAK受體多肽片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述TWEAK拮抗劑包含F(xiàn)nl4-Fc。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述TWEAK拮抗劑包含抗TWEAK抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述TWEAK拮抗劑包含抗TWEAK受體的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其中所述抗體是人的或人源化的。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其中所述抗體是單克隆的或合成的。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其中所述抗體是全長的。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其中所述抗體是抗體片段，或包含抗體的抗原識別序列的融合蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述藥劑是制備用于經(jīng)由腸胃外途徑給予機(jī)體的藥劑。
12.根據(jù)權(quán)利 要求1的用途，其中所述機(jī)體是人。
【文檔編號】A61P17/00GK103536916SQ201310506714
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2002年4月9日
【發(fā)明者】琳達(dá).伯克利, 阿尼拉.賈庫博夫斯基, 蒂莫西.鄭, 咸庚旼 申請人:比奧根艾迪克Ma公司