豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其包括：選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收獲豬脾臟；低溫保藏；解凍豬脾臟；去筋膜；絞碎；勻漿；裝瓶、儲存；反復(fù)凍融；離心；微濾；超濾；滅活；pH調(diào)節(jié)；滲透壓調(diào)節(jié)；除菌；質(zhì)量檢測。本發(fā)明在勻漿步驟中將注射用水的pH值調(diào)節(jié)至4-6，有利于提高核糖、多肽得率。本發(fā)明采用盒式膜包切向流過濾，系統(tǒng)殘留死體積小，易于線性放大生產(chǎn)。本發(fā)明將轉(zhuǎn)移因子粗制品經(jīng)1-3KD盒式膜包進(jìn)行切向流納濾，制得高濃度轉(zhuǎn)移因子，提高使用效果。本發(fā)明使用酚紅作酸堿指示劑，方便客戶觀察轉(zhuǎn)移因子的pH值。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子，使用β-丙內(nèi)酯替代傳統(tǒng)甲醛滅活，加入滲透壓調(diào)節(jié)工藝，有利于轉(zhuǎn)移因子與疫苗的聯(lián)合免疫。
【專利說明】豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)移因子，具體涉及豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)移因子(Transfer Factor, TF)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的物質(zhì)，它能夠特異地將供體的細(xì)胞免疫信息轉(zhuǎn)移給受體，從而增強(qiáng)受體的免疫功能。上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)TF至今，國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了大量研究，并于1979年將其引入獸醫(yī)免疫和臨床治療中，目前TF逐漸成為一種應(yīng)用廣泛的免疫增強(qiáng)劑。
[0003]TF無種屬特異性，因此TF來源廣泛，人類臨床上常見的有人TF、豬TF、牛TF、羊TF、鵝TF等，而畜禽養(yǎng)殖中常見的有牛TF、豬TF，雞TF。
[0004]TF的分子量大約介于3KD和5KD之間，是具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其內(nèi)含物包含游離氨基酸、核酸、多肽及K、Na、Ca、Mg、Zn等金屬元素。各種TF的理化特性、組成成分差異不大，但含量有較大差異。
[0005]從免疫學(xué)上，TF分為特異性TF和非特異性TF。特異性TF采用特定病原感染或免疫人群、動物后再提取含該抗原特異活性的TF，目前臨床己經(jīng)應(yīng)用有乙型肝炎病毒特異TF、各種腫瘤特異TF、流行性出血熱病毒TF、孢疹病毒TF、乙型腦炎TF、結(jié)核菌TF等。非特異性TF是指用自然人群或動物白細(xì)胞提取的具有多種免疫活性的TF，可非特異性調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能，提高機(jī)體的抵抗力及疫苗的免疫效果。
[0006]隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展及規(guī)?；⒓s化程度的不斷提高，目前疾病已成為困擾養(yǎng)殖業(yè)的難題?，F(xiàn)有的普遍的解決方法就是免疫，然而由于種種原因，有時(shí)難免造成免疫失敗，爆發(fā)非典型性傳染病，給診斷和治療帶來一定困難。在免疫失敗后往往依賴抗生素治療，造成了耐藥菌株的增加和交叉感染的產(chǎn)生。TF作為免疫增強(qiáng)劑，可提高機(jī)體的抵抗力及疫苗的免疫效果，減少免疫失敗，在疾病防治中可發(fā)揮重要作用。
[0007]脾臟是機(jī)體的免疫器官之一。豬脾TF含有游離氨基酸、多肽等40多種小分子物質(zhì)，等電點(diǎn)為4.48，分子量較低。豬脾TF與機(jī)體的免疫功能有著密切的關(guān)系，是一種免疫增強(qiáng)劑，且具有無抗原性、無致畸、無致突變等優(yōu)點(diǎn)。畜禽脾臟為加工過程中的廢物，有著極廣的應(yīng)用開發(fā)前景，己成為TF研究的熱點(diǎn)。
[0008]白扁豆，俗稱眉豆、南扁豆，含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、鈣、磷、鐵、鋅、植酸鈣鎂、泛酸、豆留醇、磷脂、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、淀粉及酪氨酸酶等。白扁豆氣味甘平，微溫，具有和中健脾、消暑化濕、補(bǔ)五臟之功?！侗静菥V目》中說，白扁豆“其性溫平，得乎中和，脾之谷也”；“止瀉痢，消暑，暖脾胃，除濕熱，止消渴”。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，白扁豆具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動及免疫功能、抑菌、抗病原微生物、解毒、抗凝血等作用。在我國，白扁豆資源豐富，價(jià)格便宜。
[0009]丙內(nèi)酯已用于多種疫苗的滅活，沸點(diǎn)155°C，常溫下是無色粘稠狀液體，對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用，滅活時(shí)間短，可提高生產(chǎn)效率。丙內(nèi)酯極易水解，37°C 2h即消失，無殘留，水解產(chǎn)物無毒無害，水解為無毒性的脂肪代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸。而甲醛是一種有強(qiáng)烈刺激性的致癌物質(zhì)，使用甲醛滅活時(shí)間長，殘留的甲醛不分解，注入機(jī)體后，會產(chǎn)生刺激性反應(yīng)。
[0010]微生物對所處的滲透壓要求等滲，等滲溶液的滲透壓值為280-320mosm/kg。滲透壓值低于此值的溶液稱低滲溶液，如蒸餾水等；滲透壓值高于此值的溶液稱高滲溶液，如10%的葡萄糖液或50%的葡萄糖液等。微生物處于高滲溶液中，易發(fā)生質(zhì)壁分離皺縮死亡；相反若處于低滲溶液中，易吸水膨脹破裂死亡。
[0011]豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒引起豬的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一。我國一直采取以防為主的防制方針，目前主要應(yīng)用豬瘟兔化疫苗(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)來防控豬瘟。豬瘟的急性發(fā)生和大面積流行在我國已經(jīng)得到有效的控制，但近年來豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，其流行形式從過去頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)橹芷谛浴⒉ɡ耸降牡貐^(qū)散發(fā)性流行，臨床癥狀和病理變化亦由典型性轉(zhuǎn)為非典型性。
[0012]偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒引起多種家畜的一種傳染病。豬是偽狂犬病病毒的天然宿主，該病是嚴(yán)重危害豬群的原發(fā)性疾病之一。
[0013]豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineR印roductive and Respiratory Syndrome,PRRS)于1987年首發(fā)于美國，現(xiàn)已遍布全世界。在我國1996年北京地區(qū)首次爆發(fā)PRRS，現(xiàn)己傳播到各省市，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。各國科研人員紛紛致力于PRRS疫苗研發(fā)，現(xiàn)已研制出多種疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，顯示出一定效果，但至今PRRS仍然是造成我國養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病。PRRS病毒(PRRSV)特異的免疫學(xué)特征給疫苗的設(shè)計(jì)與研制帶來一定困難，而免疫應(yīng)答機(jī)制的研究和疫苗免疫佐劑的研發(fā)是今后重要工作。
[0014]流行性乙型腦炎(Japanese Encephalitis, JE)是由日本腦炎病毒(JapaneseEncephalitis Virus, JEV)引起的一種人畜共患的蟲媒介導(dǎo)的自然疫源性的嗜神經(jīng)性急性傳染病。JEV感染豬稱為豬乙型`腦炎，屬于國家二類動物疫病，是引起豬繁殖障礙性綜合征的主要病毒性疾病之一。
[0015]豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙的一個(gè)非常重要的病原體。目前本病在我國乃至許多養(yǎng)豬國家都有流行。雖然近年來隨著豬細(xì)小病毒弱毒疫苗和滅活疫苗的廣泛使用，豬細(xì)小病毒的感染和流行得到了一定控制，但其在不少地區(qū)仍時(shí)有發(fā)生，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的損失。
[0016]口蹄疫(Food and Mouth Disease, FMD)是危害哺乳動物的一種高度接觸性傳染病，對易感偶蹄獸具有嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)危害。牛(黃牛、水牛、奶牛)、豬、羊、駱駝、鹿等均易感。
[0017]豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus, PCV)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員，是迄今已知最小的動物病毒之一。豬圓環(huán)病已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病。
[0018]豬傳染性胃腸炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)、豬流行性腹?寫(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)分別是由豬傳染性胃腸炎病毒(PorcineTransmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)和豬流行性腹?寫病毒(Porcine EpidemicDiarrhea Virus, PEDV)引起的病毒性高度接觸性傳染性腸道疾病，都屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員。
[0019]TGEV對各年齡段的豬均易感發(fā)病，但新生幾周內(nèi)的仔豬的發(fā)病率和死亡率最高，幾乎達(dá)到100%死亡。隨著日齡的增大，患病豬的死亡率有所降低，但感染該病的豬生產(chǎn)性能下降，飼料報(bào)酬率低下，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0020]PEDV在結(jié)構(gòu)、臨床癥狀及對機(jī)體產(chǎn)生的損傷等方面均與TGEV相似。7日齡內(nèi)哺乳仔豬感染發(fā)病最為多見，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全群發(fā)病，致使哺乳仔豬大量死亡，保育豬和育肥豬增重減慢，對養(yǎng)豬業(yè)造成很大的損失。[0021]目前國內(nèi)生產(chǎn)豬脾TF的廠家很多，提取工藝也不盡相同，有超離心、超濾、透析凍干、葡萄糖凝膠層析、冷乙醇抽提等方法?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)移因子技術(shù)，通常是將動物脾臟中的脂肪、大血管、表面筋膜等組織剔出后，進(jìn)行組織搗碎，反復(fù)凍融后，通過半透膜透析獲得。常規(guī)采用Lawrence方法，即利用兩次透析法回收轉(zhuǎn)移因子，此法操作簡單，但生產(chǎn)周期長、耗時(shí)長、浪費(fèi)大、效果不好且費(fèi)人力物力。另外，即使采用切向流過濾方法，大多采用中空纖維濾膜進(jìn)行切向流過濾，中空纖維濾膜清洗困難、膜損壞后要更換整個(gè)組件、系統(tǒng)殘留死體積較大、纖維管內(nèi)流動阻力很大、壓力損失較大、不宜處理黏稠液體、不易線性放大生產(chǎn)。這些方法較難進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)大生產(chǎn)來滿足市場的需要。
[0022]原有制備TF的方法因在滅活工藝中選用甲醛滅活及缺少滲透壓調(diào)節(jié)工藝，導(dǎo)致制備的TF不宜作為豬疫苗的稀釋液及免疫佐劑使用，即不能直接稀釋豬弱毒疫苗、不能與豬弱毒疫苗病毒液混合后凍干。
[0023]酚紅，別名苯酚磺酞，是一種酸堿指示劑。當(dāng)酚紅所處溶液的PH≥7時(shí)，顏色由紅變深紫色；若PH≤7時(shí)，顏色則由紅色逐漸變成黃色。酚紅的變色范圍很適合作轉(zhuǎn)移因子的酸堿度指示劑，酚紅會隨溶液的PH變化而改變顏色，成為觀察轉(zhuǎn)移因子pH的最直觀指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]本發(fā)明的目的為提供一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)且易線性放大的從動物脾臟中獲取豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的方法，及將其作為免疫增強(qiáng)劑及免疫佐劑科學(xué)使用的用途。
[0025]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0026]豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其包括以下步驟:
[0027]I)對健康豬免疫一種以上的豬疫苗，每種豬疫苗免疫2次以上，相鄰兩次免疫時(shí)間間隔為7天以上，最后一次免疫豬疫苗后14-28天，檢測豬疫苗抗體，選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收獲豬脾臟；
[0028]2)低溫保藏:收獲的豬脾臟立即保存于_40°C以下，保存時(shí)間不超過20天；
[0029]3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后用純化水洗3-5遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟；
[0030]4)去筋膜:解凍后去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經(jīng)注射用水洗3-5遍；
[0031]5)絞碎:將經(jīng)注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機(jī)初絞1-2遍；
[0032]6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調(diào)節(jié)至4-6，與絞碎后的豬脾臟按重量比1-2:1混合，經(jīng)膠體磨勻漿，得勻漿液；
[0033]7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝于無熱源的瓶子后，立即保存于-40°C以下，保存時(shí)間不超過20天；
[0034]8)反復(fù)凍融:將瓶裝勻漿液經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后立即于_40°C以下冷凍，反復(fù)凍融3-6次；[0035]9)離心:將反復(fù)凍融后的勻漿液于4°C、5500-8000r/min離心15_30min，收集上清液；
[0036]10)微濾:將步驟9)得到的上清液采用0.1-0.45 μ m盒式膜包進(jìn)行切向流微濾:當(dāng)微濾透過物體積達(dá)到上清液體積的2/3-3/4時(shí)，對微濾截留物進(jìn)行恒體積透析，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1-1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液；
[0037]11)超濾:將步驟10)得到的澄清液采用5-10KD盒式膜包進(jìn)行切向流超濾:當(dāng)超濾透過物體積達(dá)到澄清液體積的4/5-6/7時(shí)，對超濾截留物進(jìn)行恒體積透析，至超濾透過物體積增加了超濾截留物體積的1-2.5倍為止，收集超濾透過物即為豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品；
[0038]12)滅活:將丙內(nèi)酯與豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品，按體積比1:4000-100000混勻，在4°C下80_200r/min的轉(zhuǎn)速下滅活6_24h，滅活后置于37°C下水解2-8h ；
[0039]13)pH調(diào)節(jié):將滅活后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的pH值調(diào)節(jié)至6.8-7.2 ；
[0040]14)滲透壓調(diào)節(jié):將pH調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的滲透壓調(diào)節(jié)至 280_320mosm/kg ；
[0041]15)除菌:將滲透壓調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品采用0.1 μ m的除菌過濾器除菌，即得豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子；
[0042]16)質(zhì)量檢測:豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的性狀為微黃色或黃色透明液體，多肽含量不低于2.5mg/mL,核糖含量不低于50 μ g/mL,內(nèi)毒素含量不超過10EU/mL,按照《中國獸藥典》的要求進(jìn)行 檢測后應(yīng)無菌，pH值為6.8-7.2，滲透壓值為280-320mosm/kg,磺基水楊酸蛋白質(zhì)定性測定為陰性,鑒別檢驗(yàn)中在250-260nm的波長處有最大吸收、0D260nm/0D280nm的比值應(yīng)不低于1.9，脫E受體法效力檢驗(yàn)不低于10.0%，安全檢驗(yàn)合格，即為質(zhì)量檢測合格。
[0043]本發(fā)明步驟6)中pH值為4-6的注射用水與絞碎后的豬脾臟混勻后經(jīng)膠體磨勻漿，得勻漿液。因本發(fā)明在勻漿步驟中調(diào)節(jié)PH值，有利于蛋白絮凝、抑制細(xì)菌生長及內(nèi)毒素產(chǎn)生，提高后期離心的收率及微濾、超濾的速度，提高轉(zhuǎn)移因子核糖和多肽的得率。而現(xiàn)有技術(shù)一般在勻漿、反復(fù)凍融或細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞步驟后，在離心步驟前，將料液PH值調(diào)節(jié)至4-6，導(dǎo)致蛋白絮凝效果差，較難抑制細(xì)菌生長及內(nèi)毒素產(chǎn)生，核糖和多肽的得率較低。
[0044]本發(fā)明步驟10)及11)逐級采用0.1-0.45 μ m、5_10KD盒式膜包進(jìn)行切向流過濾，而現(xiàn)有技術(shù)一般采用中空纖維濾膜進(jìn)行切向流過濾。現(xiàn)有采用中空纖維濾膜進(jìn)行切向流過濾，系統(tǒng)殘留死體積大，使用后清洗困難，使用過程中薄膜易受損。特別是，采用中空纖維濾膜進(jìn)行切向流過濾從小試優(yōu)化、中試放大到生產(chǎn)規(guī)模，無法線性放大，不便于從研發(fā)到投入生產(chǎn)再到擴(kuò)大生產(chǎn)。而本發(fā)明采用的逐級盒式膜包進(jìn)行切向流過濾，系統(tǒng)殘留死體積小，使用后清洗方便，使用過程中薄膜不易受損。同時(shí)，本發(fā)明采用的逐級盒式膜包進(jìn)行切向流過濾方便從小試優(yōu)化、中試放大到生產(chǎn)規(guī)模，可線性放大，方便從研發(fā)到投入生產(chǎn)再到擴(kuò)大生產(chǎn)，加快產(chǎn)品上市過程，降低產(chǎn)品的研發(fā)成本。
[0045]本發(fā)明步驟12)中采用β -丙內(nèi)酯對豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品滅活。而現(xiàn)有技術(shù)轉(zhuǎn)移因子一般采用甲醛滅活，滅活后，由于殘留甲醛的存在，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移因子無法稀釋或混合豬弱毒疫苗，更無法與豬弱毒疫苗病毒液制成凍干苗，并且殘留甲醛導(dǎo)致轉(zhuǎn)移因子注射動物后，對動物造成較大應(yīng)激。
[0046]而本發(fā)明步驟12)中采用丙內(nèi)酯對豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品滅活，因丙內(nèi)酯極易水解，37°C2h即消失，無殘留，水解產(chǎn)物無毒無害，所以本發(fā)明制備的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子可稀釋或混合豬弱毒疫苗，還可與豬弱毒疫苗病毒液制成凍干苗，注射動物后，應(yīng)激很小。
[0047]在步驟14)中，對pH調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有技術(shù)中，沒有滲透壓調(diào)節(jié)工藝，制成的轉(zhuǎn)移因子一般為160-250mOsm/kg的低滲溶液。這樣的轉(zhuǎn)移因子不僅不能稀釋或混合豬弱毒疫苗，而且也不能與豬弱毒疫苗病毒液制成凍干苗(在低滲溶液中，豬弱毒疫苗病毒株易吸水膨脹破裂死亡，導(dǎo)致疫苗效價(jià)及免疫效果降低)。因此，這樣制備的轉(zhuǎn)移因子在使用過程中，弱毒疫苗與轉(zhuǎn)移因子必須分開使用，如:需要兩次注射，操作繁瑣。并且若采用低滲透壓的轉(zhuǎn)移因子注射，由于低滲溶液會導(dǎo)致豬局部組織細(xì)胞吸水膨脹甚至破裂，很容易使豬產(chǎn)生應(yīng)激。
[0048]而本發(fā)明步驟14)中，將pH調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的滲透壓調(diào)節(jié)至280-320mOsm/kg。由于本發(fā)明豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的滲透壓與血漿的滲透壓一致，所以為等滲溶液。因此，本發(fā)明制備的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子不僅可以稀釋或混合豬弱毒疫苗，而且也可以與豬弱毒疫苗病毒液制成凍干苗。使用過程中，本發(fā)明的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子可與弱毒疫苗同針免疫，實(shí)踐中操作方便。同時(shí)，采用本發(fā)明制備的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子注射后，豬無應(yīng)激。
[0049]所述步驟I)中，先用白扁豆飼喂健康豬，用量為每頭豬每天30_60g，飼喂15-30天，然后再用一種以上的豬疫苗免疫健康豬。本發(fā)明步驟I)中采用白扁豆飼喂健康豬，可和中健脾，提高豬的免疫力及豬疫苗抗體陽性率。經(jīng)白扁豆飼喂后的健康豬，提取的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子采用脫E受體法效力檢驗(yàn)大于`13.0%。而未采用白扁豆飼喂健康豬，豬疫苗抗體陽性率相對較低，脫E受體法效力檢驗(yàn)一般為12.0%左右。
[0050]進(jìn)一步，所述的豬疫苗為豬瘟疫苗、豬偽狂犬病疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗、豬乙型腦炎病疫苗、豬細(xì)小病毒病疫苗、豬口蹄疫疫苗、豬圓環(huán)病疫苗、豬傳染性胃腸炎疫苗、豬流行性腹瀉疫苗中一種或幾種。本發(fā)明能制備豬疫苗單特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子，亦能制備豬疫苗多特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子。而現(xiàn)有技術(shù)制備的豬脾臟轉(zhuǎn)移因子效果單一。
[0051]所述步驟13)中，將滅活后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的pH值調(diào)節(jié)至
6.8-7.2后，加入酚紅顯色；則步驟16)質(zhì)量檢測時(shí)，豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的性狀為紅色或淡紅色透明液體。本發(fā)明中，采用酚紅作為酸堿指示劑。因制備的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子在保存運(yùn)輸過程中，由于保存或運(yùn)輸環(huán)境不當(dāng)，或由于其他因素發(fā)生變質(zhì)，則豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子溶液的PH發(fā)生改變，從而通過酚紅可直接觀察保存的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子是否變質(zhì)，方便客戶判斷所持有的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子是否可使用，極大地方便了客戶。
[0052]進(jìn)一步，所述的步驟11)超濾后和步驟12)滅活前，將豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品經(jīng)1-3KD盒式膜包進(jìn)行切向流納濾，使納濾截留物體積達(dá)到轉(zhuǎn)移因子粗制品體積的1/6-1/1.1倍，收集納濾截留物即為高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品。由于本發(fā)明采用該步驟，使納濾后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子核糖含量大于60 μ g/mL，多肽含量大于3.0mg/mL,脫E受體法效力檢驗(yàn)大于13.0%，大大減少了轉(zhuǎn)移因子的使用體積，從而方便后期與豬弱毒疫苗病毒液混合制備凍干疫苗，大大減少了凍干體積，減少了凍干操作次數(shù)，采用小體積的凍干設(shè)備即可進(jìn)行凍干操作，降低生產(chǎn)成本。
[0053]所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的用途有以下幾種:
[0054]第一種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子l_6mL免疫每頭豬。
[0055]第二種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為稀釋液，用2_6mL稀釋液稀釋一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬弱毒疫苗1-3頭份，稀釋后的豬弱毒疫苗分別免疫每頭豬。
[0056]第三種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為免疫佐劑，用0.05-0.1mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬弱毒疫苗病毒液1-3頭份，加入凍干保護(hù)劑后凍干，制成凍干豬弱毒疫苗，使用前將其稀釋，分別免疫每頭豬。
[0057]該處加入的凍干保護(hù)劑可以是下列中的一種:明膠、脫脂奶粉、乳糖、海藻糖或蔗糖等。
[0058]第四種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為免疫佐劑，用0.1-0.5mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬滅活疫苗病毒液1-3頭份，再加入其他佐劑，制成豬滅活疫苗，分別免疫每頭豬。
[0059]該處加入的其他佐劑可以是下列中的一種:A1 (OH) 3>AlPO4, Ca3 (PO4) 2、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、礦物油白油等其他佐劑。
[0060]以上所述的免疫方式包括注射、飲水、拌料、滴鼻、噴霧等。
[0061]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，具有以下有益效果:通過提供一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)且易線性放大的從豬脾臟中獲取豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的方法，及將其作為免疫增強(qiáng)劑及免疫佐劑科學(xué)使用的用途。
[0062]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)具體為:1、本發(fā)明豬脾臟來源容易；白扁豆飼喂豬群，可和中健脾、提高豬的免疫力及豬疫苗的免疫效力。
[0063]2、本發(fā)明先后采用絞肉機(jī)、膠體磨破碎組織細(xì)胞，全機(jī)器化處理，有利于提高生產(chǎn)效率，節(jié)約成本。
[0064]3、本發(fā)明在勻漿步驟中將注射用水的pH值調(diào)節(jié)至4-6，有利于蛋白絮凝、抑制細(xì)菌生長及內(nèi)毒素產(chǎn)生，提高后期離心的收率及微濾、超濾的速度，提高核糖和多肽的得率。
[0065]4、本發(fā)明將勻漿液分裝于無熱源的瓶子后，立即保存于_40°C以下，保存時(shí)間不超過20天，之后將瓶裝勻漿液經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后立即于_40°C以下冷凍，反復(fù)凍融3-6次，使多肽、核糖含量大大提高，且節(jié)約成本。
[0066]5、本發(fā)明采用切向流逐級過濾的方式，依次經(jīng)0.1-0.4511111、5-101(0及1-31(0盒式
膜包微濾、超濾及納濾，工藝簡單，盒式膜包切向流裝置牢固且系統(tǒng)殘留死體積小，適合在廣泛的壓力范圍內(nèi)工作，流道間隙大小可調(diào)，流道不易被雜物堵塞，具有可拆性，清洗方便，通過增減膜及支撐板的數(shù)量可處理不同料液量，生產(chǎn)效率高、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低、易于線性放大生產(chǎn)。
[0067]6、本發(fā)明將豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品經(jīng)1-3KD盒式膜包進(jìn)行切向流納濾，制得高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子，可減少轉(zhuǎn)移因子的使用劑量，提高使用效果O[0068]7、本發(fā)明使用酚紅作為轉(zhuǎn)移因子的酸堿度指示劑，方便轉(zhuǎn)移因子pH值的直觀觀察。
[0069]8、本發(fā)明的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子，使用丙內(nèi)酯替代傳統(tǒng)的甲醛滅活，加入滲透壓調(diào)節(jié)工藝，有利于轉(zhuǎn)移因子與疫苗的聯(lián)合免疫，即:使轉(zhuǎn)移因子可作為稀釋液，稀釋一種豬弱毒疫苗，之后免疫每頭豬，不需與豬弱毒疫苗分針免疫，使用方便；此外轉(zhuǎn)移因子還可作為免疫佐劑，混合一種豬弱毒疫苗病毒液，加入凍干保護(hù)劑后凍干，制成凍干豬弱毒疫苗，方便保存運(yùn)輸。同時(shí)，等滲溶液有利于減少免疫應(yīng)激。[0070]9、轉(zhuǎn)移因子經(jīng)0.1um的除菌過濾器除菌，比采用0.22um的除菌過濾器，更有利于
去除支原體等微生物。
[0071]10、本發(fā)明生產(chǎn)的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子，生產(chǎn)周期短，并且節(jié)省了大量的人力物力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0072]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
[0073]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子與現(xiàn)有轉(zhuǎn)移因子增強(qiáng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗免疫保護(hù)力的對比實(shí)驗(yàn)中攻毒后各組實(shí)驗(yàn)豬的存活情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0074]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0075]豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其包括以下步驟:
[0076]I)用白扁豆飼喂健康豬，用量為每頭豬每天30_60g，飼喂15-30天，然后對飼喂白扁豆的健康豬免疫一種以上的豬疫苗，每種豬疫苗免疫2次以上，相鄰兩次免疫時(shí)間間隔為7天以上，最后一次免疫豬疫苗后14-28天，檢測豬疫苗抗體，選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收獲豬脾臟；
[0077]2)低溫保藏:收獲的豬脾臟立即保存于_40°C以下，保存時(shí)間不超過20天；
[0078]3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后用純化水洗3-5遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟；
[0079]4)去筋膜:解凍后去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經(jīng)注射用水洗3-5遍；
[0080]5)絞碎:將經(jīng)注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機(jī)初絞1-2遍；
[0081]6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調(diào)節(jié)至4-6，與絞碎后的豬脾臟按重量比
1-2:1混合，經(jīng)膠體磨勻漿，得勻漿液；
[0082]7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝于無熱源的瓶子后，立即保存于-40°C以下，保存時(shí)間不超過20天；
[0083]8)反復(fù)凍融:將瓶裝勻漿液經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后立即于_40°C以下冷凍，反復(fù)凍融3-6次；
[0084]9)離心:將反復(fù)凍融后的勻漿液于4°C、5500-8000r/min離心15_30min，收集上清液；
[0085]10)微濾:將步驟9)得到的上清液采用0.1-0.45 μ m盒式膜包進(jìn)行切向流微濾:當(dāng)微濾透過物體積達(dá)到上清液體積的2/3-3/4時(shí)，對微濾截留物進(jìn)行恒體積透析，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1-1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液；
[0086]11)超濾:將步驟10)得到的澄清液采用5-10KD盒式膜包進(jìn)行切向流超濾:當(dāng)超濾透過物體積達(dá)到澄清液體積的4/5-6/7時(shí)，對超濾截留物進(jìn)行恒體積透析，至超濾透過物體積增加了超濾截留物體積的1-2.5倍為止，收集超濾透過物即為豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品；
[0087] 12)滅活:將丙內(nèi)酯與豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品，按體積比1:4000-100000混勻，在4°C下80_200r/min的轉(zhuǎn)速下滅活6_24h，滅活后置于37°C下水解2-8h ；
[0088]13)pH調(diào)節(jié):將滅活后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的pH值調(diào)節(jié)至6.8-7.2 ；
[0089]14)滲透壓調(diào)節(jié):將pH調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的滲透壓調(diào)節(jié)至 280_320mosm/kg ；
[0090]15)除菌:將滲透壓調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品采用0.1 μ m的除菌過濾器除菌，即得豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子；
[0091]16)質(zhì)量檢測:豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的性狀為微黃色或黃色透明液體，多肽含量不低于2.5mg/mL,核糖含量不低于50 μ g/mL,內(nèi)毒素含量不超過10EU/mL,按照《中國獸藥典》的要求進(jìn)行檢測后應(yīng)無菌，pH值為6.8-7.2，滲透壓值為280-320mosm/kg,磺基水楊酸蛋白質(zhì)定性測定為陰性,鑒別檢驗(yàn)中在250-260nm的波長處有最大吸收、0D260nm/0D280nm的比值應(yīng)不低于1.9，脫E受體法效力檢驗(yàn)不低于10.0%，安全檢驗(yàn)合格，即為質(zhì)量檢測合格。
[0092]所述步驟16)質(zhì)量檢測的具體操作為:
[0093]A.性狀:豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的性狀為微黃色或淡黃色透明液體(若加入酚紅，豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的性狀為紅色或淡紅色透明液體)；
[0094]B.多肽含量測定:豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子按福林酚法進(jìn)行測定，每毫升多肽含量應(yīng)不低于2.5mg ；
[0095]福林酚法:
[0096]試劑:
[0097]a)堿性銅溶液:溶液I進(jìn)行5倍稀釋后與溶液II，以50:1的比例混合，混合后即為堿性銅溶液，此試劑只能用I天，過期失效；
[0098]b)酚溶液；
[0099]操作法:
[0100]a)對照品溶液的制備:取牛血清白蛋白對照品，加水制成每毫升中含250ug的溶液；
[0101]b)供試品溶液的制備:取豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子適量，用水進(jìn)行適當(dāng)稀釋作為供試品溶液；
[0102]c)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取7支試管，精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、
0.8,1.0mL，分別置帶塞刻度試管中，各加水至1.0mL，再分別加入堿性銅溶液5.0ml，搖勻，于室溫下放置IOmin,各加入酹溶液0.5mL,立即混勻，置室溫放置30min,然后于500nm的波長處測定吸收度；同時(shí)以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白試管(O管)中的溶液作為空白對照，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸；相關(guān)系數(shù)不低于0.99 ；
[0103]d)測定法:精密量取供試品溶液1.0mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“再分別加入堿性銅溶液”起，以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的O管為空白，依法測定吸收度；根據(jù)吸收度從回歸方程中求得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，求出供試品多肽含量；
[0104]C.核糖含量測定:豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子按核糖含量測定法進(jìn)行測定，每毫升核糖含量不應(yīng)低于50 μ g ;
[0105]核糖含量測定法:
[0106]試劑:
[0107]a) 5%三氯醋酸:稱取三氯醋酸5g，加蒸餾水溶解成IOOmL ；
[0108]b) 0.1%三氯化鐵-鹽酸溶液:稱取三氯化鐵(FeCl3.6Η20) 0.5g，加濃鹽酸溶解成500mL，可長期使用；
[0109]c) 1%3，5-二羥基甲苯(苔黑酚):稱取3，5-二羥基甲苯lg，溶于IOOmL0.1%三氯化鐵-鹽酸溶液中，臨用新配；
[0110]操作方法:
[0111]a)對照品溶液的制備:精密稱取D核糖對照品適量，用5%三氯醋酸制成每毫升含核糖20ug的溶液，搖勻；
[0112]b)供試品溶液的制備:取豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子適量，用5%三氯醋酸進(jìn)行適當(dāng)稀釋作為供試品溶液；·
[0113]c)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取對照品溶液0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mL,分
別置帶塞刻度試管中，各加入5%三氯醋酸溶液至2.0mL，再分別加入1%3，5- 二羥基甲苯溶液2.0mL，搖勻，置沸水浴中準(zhǔn)確加熱30min，迅速冷卻至室溫，以O(shè)號管為空白，照分光光度法(見現(xiàn)行《中國藥典》附錄)，在650nm的波長處測定吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸；相關(guān)系數(shù)不低于0.995 ；
[0114]d)測定法:精密量取供試品溶液2.0mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，自“再分別加入1%3，5- 二羥基甲苯溶液2.0mL”起，依法測定吸收度；根據(jù)吸收度從回歸方程中求得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，求出供試品核糖含量；
[0115]D.細(xì)菌內(nèi)毒素測定:按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，內(nèi)毒素含量不超過10EU/mL ；
[0116]E.無菌檢驗(yàn):按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無菌生長；
[0117]F.pH值測定:按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，pH值應(yīng)為6.8-7.2 ；
[0118]G.滲透壓值測定:按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，滲透壓值為280-320mOsm/kg ；
[0119]H.蛋白質(zhì)定性測定:將20%磺基水楊酸2mL與樣品2mL,混勻，反應(yīng)后無渾池沉淀，反應(yīng)為陰性；
[0120]1.鑒別檢驗(yàn):豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子做適當(dāng)稀釋后，按分光光度計(jì)法(按現(xiàn)行《中國獸醫(yī)典》附錄進(jìn)行)測定0D260nm、0D280nm，并掃描圖譜，在250_260nm的波長處有最大吸收，0D260nm/0D280nm的比值應(yīng)不低于1.9 ；
[0121]J.效力檢驗(yàn):按脫E受體法進(jìn)行檢驗(yàn)，樣品管淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)百分率與對照管之差應(yīng)不低于10.0% ；[0122]脫E受體法:
[0123]試劑:
[0124]a) Hank’ s液:將0.3%磷酸二氫鉀溶液、0.76%磷酸氫二鈉溶液、2%氯化鉀溶液及20%氯化鈉溶液依次按20:20:20:40比例混合，加葡萄糖lg，溶解后混勻，用水稀釋至1000ml，并用4%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.3 (臨用時(shí)配制)；
[0125]b)阿氏液:取氯化鈉0.420g、枸櫞酸0.055g、枸櫞酸鈉0.766g、葡萄糖2.05g，加水溶解并稀釋至1000mL,滅菌備 用；
[0126]c)分離液:為淋巴細(xì)胞分離液；
[0127]d)綿羊抗凝血:取綿羊靜脈血5mL，加入5mL阿氏液中，2_8°C冰箱保存；
[0128]e)固定液:用25%戊二醛溶液、3.5%碳酸氫鈉溶液及Hank’s液依次按1: 1:38比例混合；
[0129]f)姬姆薩染色液:取姬姆薩染料0.5g，加甘油33mL，55-60°C加熱至姬姆薩染料溶解，冷至室溫，加入甲醇33mL，室溫放置24h后，用濾紙過濾，濾液即為原液；取姬姆薩染色液原液2mL,加 Hank，s液6mL,搖勻，1500r/min離心10分鐘,取上清液即得；
[0130]操作方法:
[0131]a)脫E受體T淋巴細(xì)胞懸液的制備:取新鮮豬胸腺，去脂肪剪碎，加適量Hank’s液使成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目篩過濾，1500r/min離心3_5min,棄去上清液,加入少量Hank’ s液打勻，將此溶液加入已具等量分離液的離心管中，用水平離心機(jī)以2000r/min離心20min，小心吸出中間層的淋巴細(xì)胞，放入另一離心管中，加適量Hank’ s液洗漆,混勻，1500r/min離心3-5min，棄去上清液，洗滌一次后，在沉淀物中加入適量的Hank’ s液，混勻，45°C恒溫水浴保溫30min (每隔5min振搖一次)，1500r/min離心3_5min,棄去上清液；再加入適量的Hank’ s液，混勻后,45°C恒溫水浴保溫30min, 1500r/min離心3_5min,棄去上清液；用Hank’ s液洗滌3次(操作同前)，再用Hank’ s液適當(dāng)稀釋并計(jì)數(shù)，使最終濃度約為ImL中3X 106-5X 106個(gè)細(xì)胞，為脫E受體淋巴細(xì)胞懸液；
[0132]b)綿羊紅細(xì)胞懸液的制備:取適量綿羊抗凝血，用適量Hank’s液洗滌3次，1500r/min離心3-5min,棄上清,加Hank’s液稀釋并計(jì)數(shù)，使綿羊紅細(xì)胞最終濃度為脫E受體淋巴細(xì)胞懸液的8-10倍；
[0133]c)供試品的制備:取供試品，用Hank’ s液配成每1.0mL中含0.5mg多肽的溶液；
[0134]d)取6支小試管,其中3支各加Hank’ s液0.1ml作對照管，另3支各加供試品0.1mL作測定管，每管中各加脫E受體淋巴細(xì)胞懸液0.2mL，37°C保溫Ih后，加入綿羊紅細(xì)胞懸液0.2mL,搖勻，以500r/min離心3min，放入4°C冰箱過夜，次日取出，吸棄上清液，每管中各加入固定液I滴，輕輕搖勻，靜置IOmin,滴加染色液2滴并搖勻,靜置15min開始計(jì)數(shù)(采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)，共數(shù)計(jì)數(shù)板16大方格上所有淋巴細(xì)胞的個(gè)數(shù)(不少于200個(gè))，統(tǒng)計(jì)其中的E玫瑰花結(jié)形成的淋巴細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞)，求得結(jié)花百分率，取平均值，即為供試品管或?qū)φ展艿腅玫瑰花結(jié)百分率平均值；
[0135]樣品管淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)百分率與對照管之差應(yīng)不低于10.0% ；
[0136]K.安全檢驗(yàn)
[0137]a)熱原質(zhì)檢驗(yàn):采用體重1.7-3.0Kg健康家兔(雌兔應(yīng)無孕)3只,單獨(dú)飼養(yǎng)2日，無異常；每隔30min測體溫I次，測2次，兩次溫差不超過0.2°C，以此兩次的體溫的平均值作為該兔的正常體溫；當(dāng)日使用的家兔，正常體溫在38.0-39.6°C的范圍內(nèi)，且各兔間正常體溫之差不超過1°C;試驗(yàn)用的注射器、針頭及一切與本品接觸的器皿，應(yīng)滅熱原；家兔在測定其正常體溫15min內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量(注射量為每公斤體重0.5mL)溫?zé)嶂良s38°C的本品，然后每隔30min測溫一次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔升高的體溫(當(dāng)家兔升溫為負(fù)值時(shí)，均以0°C計(jì));3只家兔體溫升高的溫度均應(yīng)低于0.6°C，且3只家兔體溫升高總和應(yīng)低于1.40C ；
[0138]b)用雞檢驗(yàn):用I日齡SPF雛雞10只，將本品用無菌生理鹽水稀釋10倍后，每只雞口服lmL，24h重復(fù)口服一次，觀察5日；雛雞應(yīng)全部健活，且精神、采食、飲水、羽毛、糞便應(yīng)均無異常；
[0139]c)異常毒性檢驗(yàn):用體重18_22g健康小鼠5只，每只小鼠腹腔注射本品0.5mL，觀察7日；小鼠應(yīng)全部健活，且精神、采食、飲水、羽毛、糞便應(yīng)均無異常；
[0140]d)動物過敏檢驗(yàn):用體重250_350g健康豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射本品1.0mL,共3次，進(jìn)行致敏；然后將其均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日，由肌肉注射本品1.0mL進(jìn)行攻擊；每日觀察每只動物的行為和體征；觀察攻擊后30min內(nèi)，動物無豎毛、呼吸困難、抽搐等過敏反應(yīng)癥狀；肌肉注射本品2h內(nèi)，不得出現(xiàn)過敏反應(yīng)；如有豎毛、噴嚏、干嘔、連續(xù)咳嗽3聲或呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)抽搐、休克、死亡現(xiàn)象之一者,判本品不符合規(guī)定。
[0141]進(jìn)一步，本發(fā)明所述的豬疫苗為豬瘟疫苗、豬偽狂犬病疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗、豬乙型腦炎病疫苗、豬細(xì)小病毒病疫苗、豬口蹄疫疫苗、豬圓環(huán)病疫苗、豬傳染性胃腸炎疫苗、豬流行性腹瀉疫苗中一種或幾種。
[0142]進(jìn)一步，所述的步驟11)超濾后和步驟12)滅活前，將豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品經(jīng)1-3KD盒式膜包進(jìn)行切向流納濾，使納濾截留物體積達(dá)到轉(zhuǎn)移因子粗制品體積的1/6-1/1.1倍，收集納濾截留物即為高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品。
[0143]所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的用途有以下幾種:
[0144]第一種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子l_6mL免疫每頭豬。
[0145]第二種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為稀釋液，用2_6mL稀釋液稀釋一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相 對應(yīng)的豬弱毒疫苗1-3頭份，稀釋后的豬弱毒疫苗分別免疫每頭豬。
[0146]第三種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為免疫佐劑，用0.05-0.1mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬弱毒疫苗病毒液1-3頭份，加入凍干保護(hù)劑后凍干，制成凍干豬弱毒疫苗，使用前將其稀釋，分別免疫每頭豬。
[0147]第四種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為免疫佐劑，用0.1-0.5mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬滅活疫苗病毒液1-3頭份，再加入其他佐劑，制成豬滅活疫苗，分別免疫每頭豬。
[0148]實(shí)施例1
[0149]豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其包括以下步驟:
[0150]I)用白扁豆飼喂健康豬，用量為每頭豬每天30g，飼喂18天，然后對飼喂白扁豆的健康豬免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗3次以上，相鄰2次免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的時(shí)間間隔為7天，最后一次免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗后28天，檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體，選取豬繁殖與呼吸綜合征抗體陽性的豬屠宰，收獲豬脾臟；
[0151]2)低溫保藏:收獲的豬脾臟立即保存于_40°C，保存時(shí)間不超過20天；
[0152]3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后用純化水洗3遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟；
[0153]4)去筋膜:解凍后去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經(jīng)注射用水洗3遍；
[0154]5)絞碎:將經(jīng)注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機(jī)初絞I遍；
[0155]6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調(diào)節(jié)至4，與絞碎后的豬脾臟按重量比1:1混合，經(jīng)膠體磨勻漿，得勻漿液；
[0156]7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝于無熱源的瓶子后，立即保存于-40°C，保存時(shí)間不超過20天；
[0157]8)反復(fù)凍融:將瓶裝勻漿液經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后立即于_40°C冷凍，反復(fù)凍融3次；
[0158]9)離心:將反復(fù)凍融后的勻漿液于4°C、5500r/min離心30min，收集上清液；
[0159]10)微濾:將步驟9)得到的上清液采用0.1ym盒式膜包進(jìn)行切向流微濾:當(dāng)微濾透過物體積達(dá)到上清液體積的2/3時(shí)，對微濾截留物進(jìn)行0.1倍恒體積透析，為使微濾截留物體積恒定，以與透過端流速相同的速度向微濾截留物補(bǔ)入注射用水，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液；
[0160]0.1 μ m盒式膜包的平均參數(shù)為:
【權(quán)利要求】
1.豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于:其包括以下步驟: . 1)對健康豬免疫一種以上的豬疫苗，每種豬疫苗免疫2次以上，相鄰兩次免疫時(shí)間間隔為7天以上，最后一次免疫豬疫苗后14-28天，檢測豬疫苗抗體，選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收獲豬脾臟； . 2)低溫保藏:收獲的豬脾臟立即保存于_40°C以下，保存時(shí)間不超過20天； . 3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后用純化水洗3-5遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟； . 4)去筋膜:解凍后去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經(jīng)注射用水洗3-5遍； .5)絞碎:將經(jīng)注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機(jī)初絞1-2遍；. 6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調(diào)節(jié)至4-6，與絞碎后的豬脾臟按重量比. 1-2:1混合，經(jīng)膠體磨勻漿，得勻漿液； . 7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝于無熱源的瓶子后，立即保存于-40°C以下，保存時(shí)間不超過20天； . 8)反復(fù)凍融:將瓶裝勻漿液經(jīng)流水解凍，解凍溫度低于37°C，解凍后立即于-40°C以下冷凍，反復(fù)凍融3-6次； . 9)離心:將反復(fù)凍融后的勻衆(zhòng)液于4°C、5500-8000r/min離心15-30 min,收集上清液；. 10)微濾:將步驟9)得到的上清液采用0.1-0.45 μ m盒式膜包進(jìn)行切向流微濾:當(dāng)微濾透過物體積達(dá)到上清液體積的2/3-3/4時(shí)，對微濾截留物進(jìn)行恒體積透析，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1-1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液； . 11)超濾:將步驟10)得到的澄清液采用5-10KD盒式膜包進(jìn)行切向流超濾:當(dāng)超濾透過物體積達(dá)到澄清液體積的4/5-6/7時(shí)，對超濾截留物進(jìn)行恒體積透析，至超濾透過物體積增加了超濾截留物體積的1-2.5倍為止，收集超濾透過物即為豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品； .12)滅活:將丙內(nèi)酯與豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品，按體積比1:.4000-100000混勻，在4°C下80-200 r/min的轉(zhuǎn)速下滅活6-24 h，滅活后置于37°C下水解.2-8h ；. 13)pH調(diào)節(jié):將滅活后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的pH值調(diào)節(jié)至.6.8-7.2 ； . 14)滲透壓調(diào)節(jié):將pH調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的滲透壓調(diào)節(jié)至 280-320 mosm/kg ； . 15)除菌:將滲透壓調(diào)節(jié)后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品采用0.1 μ m的除菌過濾器除菌，即得豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子； . 16)質(zhì)量檢測:豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的性狀為微黃色或黃色透明液體，多肽含量不低于2.5 mg/mL,核糖含量不低于50 μ g/mL,內(nèi)毒素含量不超過10 EU/mL,按照《中國獸藥典》的要求進(jìn)行檢測后應(yīng)無菌，pH值為6.8-7.2，滲透壓值為280-320 mosm/kg，磺基水楊酸蛋白質(zhì)定性測定為陰性，鑒別檢驗(yàn)中在250-260 nm的波長處有最大吸收、0D260nm/.0D280nm的比值應(yīng)不低于1.9，脫E受體法效力檢驗(yàn)不低于10.0%，安全檢驗(yàn)合格，即為質(zhì)量檢測合格。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中，先用白扁豆飼喂健康豬，用量為每頭豬每天30-60 g，飼喂15-30天，然后再用一種以上的豬疫苗免疫健康豬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于:所述的豬疫苗為豬瘟疫苗、豬偽狂犬病疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗、豬乙型腦炎病疫苗、豬細(xì)小病毒病疫苗、豬口蹄疫疫苗、豬圓環(huán)病疫苗、豬傳染性胃腸炎疫苗、豬流行性腹瀉疫苗中一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于:所述步驟13 )中，將滅活后的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品的pH值調(diào)節(jié)至6.8-7.2后，加入酚紅顯色；則步驟16)質(zhì)量檢測時(shí)，豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的性狀為紅色或淡紅色透明液體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于:所述的步驟11)超濾后和步驟12)滅活前，將豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品經(jīng)1-3 KD盒式膜包進(jìn)行切向流納濾，使納濾截留物體積達(dá)到轉(zhuǎn)移因子粗制品體積的1/6-1/1.1倍，收集納濾截留物即為高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子粗制品。
6.一種如權(quán)利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的用途，其特征在于:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子1-6 mL免疫每頭豬。
7.—種如權(quán)利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的用途，其特征在于:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為稀釋液，用2-6 mL稀釋液稀釋一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬弱毒疫苗1-3頭份，稀釋后的豬弱毒疫苗分別免疫每頭豬。
8.—種如權(quán)利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的用途，其特征在于:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為免疫佐劑，用0.05-0.1 mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬弱毒疫苗病毒液1-3頭份，加入凍干保護(hù)劑后凍干，制成凍干豬弱毒疫苗，使用前將其稀釋，分別免疫每頭豬。
9.一種如權(quán)利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的用途，其特征在于:將所述的豬 疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子作為免疫佐劑，用0.1-0.5 mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內(nèi)豬疫苗抗體陽性相對應(yīng)的豬滅活疫苗病毒液1-3頭份,再加入其他佐劑，制成豬滅活疫苗，分別免疫每頭豬。
【文檔編號】A61K39/39GK103566370SQ201310506686
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】徐磊, 劉友霖 申請人:福州派生特生物科技有限公司