骨膜蛋白基因及骨膜蛋白抗體在藥物制備中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥制備領域，特別涉及骨膜蛋白基因及骨膜蛋白抗體在藥物制備中的應用，本發(fā)明通過高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟中，Periostin基因的表達顯著上調、脂肪肝病人的Periostin的表達顯著升高，且，Periostin與肝臟TG含量、血清TG含量呈現(xiàn)明顯的正相關，說明Periostin基因表達與NAFLD、高脂血癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系關系，可用于制備篩選NAFLD試劑和高脂血癥試劑。本發(fā)明制備的Periostin抗體可用于中和肥胖小鼠體內的Periostin，顯著降低肝臟/體重比、肝臟和血清TG含量，因而Periostin抗體具有顯著改善NAFLD發(fā)展和降低血清中TG含量的作用。
【專利說明】骨膜蛋白基因及骨膜蛋白抗體在藥物制備中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥制備領域，特別涉及骨膜蛋白基因及骨膜蛋白抗體在藥物制備中的應用。
【背景技術】
[0002]非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。在過去的十年內，西方國家NAFLD的患病率已上升到20-30%，而肥胖人群NAFLD的發(fā)病率甚至超過50%。近年來，隨著人們生活方式和飲食結構的改變，我國部分地區(qū)成人NAFLD的患病率也已超過15%，且漸趨低齡化，嚴重危害人們的健康。除了 NAFLD本身所造成的健康和心理問題外，其伴隨的多種相關疾病如2型糖尿病、心腦血管疾病、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等，如果不及時診斷和治療的話，該疾病會嚴重威脅人類身心健康和生活質量，也大大增加了家庭和社會的經(jīng)濟負擔。
[0003]NAFLD的實質是肝臟內甘油三酯(TG)的過量堆積。肝細胞內甘油三酯主要來自于肝細胞的攝取和自身的生物合成。另一方面，肝臟內甘油三酯的去路主要為氧化和合成VLDL釋放入血。上述任一環(huán)節(jié)的異常均可導致甘油三酯在肝臟內的過量堆積。
[0004]高脂血癥是指人體血脂水平過高，可直接引起一些嚴重危害人體健康的疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等。高脂血癥是一種常見病癥，在中老年人當中發(fā)病率高，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。原發(fā)性與先天性和遺傳有關，而繼發(fā)性多發(fā)生于代謝性紊亂疾病(糖尿病、高血壓、黏液性水腫、甲狀腺功`能低下、肥胖、肝腎疾病、腎上腺皮質功能亢進)，或與其他因素年齡、性別、季節(jié)、飲酒、吸煙、飲食、體力活動、精神緊張、情緒活動等有關。在通常情況下，多數(shù)患者并無明顯癥狀和異常體征，不少人是由于其他原因進行血液生化檢驗時才發(fā)現(xiàn)有血漿脂蛋白水平升高，所以如果能及時診斷出高脂血癥，可以讓患者得到更好的治療。
[0005]骨膜蛋白(Periostin)是由成骨細胞或成纖維細胞分泌的一種細胞外基質蛋白，屬于束蛋白(fasciclin)家族成員。根據(jù)目前的研究表明,Periostin在多種病理情況下表達上調，包括結腸癌、乳腺癌的骨轉移等，但是Periostin在NAFLD和高脂血癥中的作用尚未有相關報道。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供骨膜蛋白(Periostin)基因在制備篩選非酒精性脂肪肝病(NAFLD)試劑和高脂血癥試劑中的應用，通過該診斷試劑的臨床應用，能及時診斷出NAFLD患者，以便及時治療，提高患者的治愈率。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供一種Periostin抗體,該Periostin抗體具有顯著改善NAFLD進展和降低血清中甘油三酯(TG)含量的作用。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是提供上述Periostin抗體在制備治療NAFLD藥物中的應用。[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供上述Periostin抗體在制備治療高脂血癥藥物中的應用。
[0010]本發(fā)明通過基因表達譜芯片技術，比較了高脂和低脂飲食喂養(yǎng)的兩組C57BL/6小鼠肝臟基因的表達差異，從中發(fā)現(xiàn):在高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟中，Periostin基因的表達顯著上調(P〈0.05)。
[0011]進一步我們通過Real-time PCR和ELISA實驗,證實了 Periostin在肥胖小鼠肝臟中的異常表達。此外，在瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠和瘦素受體缺乏的ob/ob肥胖小鼠中也得到相同的結果，即:肥胖時，肝臟Periostin的表達顯著上調。
[0012]更進一步，我們發(fā)現(xiàn)脂肪肝病人的Periostin的表達顯著升高，且與肝臟TG含量呈現(xiàn)明顯的正相關。由此可見，Periostin的高表達是NAFLD的一個特征性變化。 [0013]為探討Periostin在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用，實驗通過腺病毒介導的過表達系統(tǒng)，在C57BL/6小鼠肝臟中特異性過表達Periostin。與過表達綠色熒光蛋白(GFP)組小鼠相比,Periostin過表達后肝臟TG含量增加，肝臟/體重比增加，血清中甘油三酯(TG)尤其是低密度脂蛋白-TG(VLDL-TG)含量升高。
[0014]肝臟組織石蠟切片的伊紅-蘇木精染色(H&E)和油紅染色(Oil Red O)也證實:Periostin過表達后，肝細胞呈現(xiàn)氣球樣變性。此外，體外培養(yǎng)的人源肝癌細胞株HepG2和小鼠原代肝細胞(MPH)中加入純化的Periostin蛋白，亦發(fā)現(xiàn):Periostin能促進細胞內甘油三酯的沉積。
[0015]我們制備了 Periostin抗體用于中和肥胖小鼠體內的Periostin。給予db/db小鼠尾靜脈注射抗體兩周后(5mg/kg),同對照組(注射IgG)相比，Periostin中和抗體并不影響肥胖小鼠的體重，但能顯著降低肝臟/體重比，降低肝臟和血清TG含量，升高血清β -羥丁酸水平，增加甘油三酯和脂肪酸β-氧化相關基因的表達。
[0016]本發(fā)明的小鼠的Periostin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0017]I mvpllplyal lllflcdinp anansyydkv lahsrirgrd qgpnvcalqq ilgtkkkyfs
[0018]61 scknwyqgai cgkkttvlye ccpgymrmeg mkgcpavmpi dhvygtlgiv gatttqhysd
[0019]121 vsklreeieg kgsytyfaps neawenldsd irrglennvn vellnalhsh mvnkrmltkd
[0020]181 lkhgmvipsm ynnlglfinh ypngvvtvnc arvihgnqia tngvvhvidr vltqigtsiq
[0021]241 dfleaeddls sfraaaitsd lleslgrdgh ftlfaptnea feklprgvle rimgdkvase
[0022]301 almkyhilnt lqcseaitgg avfetmegnt ieigcegdsi singikmvnk kdivtkngvi
[0023]361 hlidevlipd sakqvielag kqqttftdlv aqlglasslk pdgeytllap vnnafsddtl
[0024]421 smdqrllkli lqnhilkvkv glsdlyngqi letiggkqlr vfvyrtaici enscmvrgsk
[0025]481 qgrngaihif reiiqpaeks lhdklrqdkr fsiflsllea adlkdlltqp gdwtlfaptn
[0026]541 dafkgmtsee relligdkna lqniilyhlt pgvyigkgfe pgvtnilktt qgskiylkgv
[0027]601 netllvnelk skesdimttn gvihvvdkll ypadipvgnd qllellnkli kyiqikfvrg
[0028]661 stfkeipmtv yrpamtkiqi egdpdfrlik egetvtevih gepvikkytk iidgvpveit
[0029]721 ekqtreerii tgpeikytri stgggetget lqkflqkevs kvtkfieggd ghlfedeeik
[0030]781 rllqgdtpak kipankrvqg prrrsregrsq
[0031]然后將其中的第761位至790位氨基酸片段(wkvtkfieggdghlfedeeikrllqgdtpak)選定為抗原片段，然后進行抗原生產(chǎn)、動物免疫、融合和單體篩選、腹水制備等步驟得到Periostin抗體。
[0032]本發(fā)明的有益效果為:
[0033]1、本發(fā)明制備的Periostin抗體可用于中和肥胖小鼠體內的Periostin,顯著降低肝臟/體重比、肝臟和血清TG含量，所以，Periostin抗體具有顯著改善NAFLD發(fā)展和降低血清中TG含量的作用，可應用于制備治療NAFLD和高脂血癥藥物。
[0034]2、通過實驗，發(fā)現(xiàn)在高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟中，Periostin基因的表達顯著上調，脂肪肝病人的Periostin的表達顯著升高，且與肝臟TG含量、血清TG含量呈現(xiàn)明顯的正相關，說明Periostin基因可用于制備篩選NAFLD藥物。
[0035]3、本發(fā)明為臨床上更合理的應用Periostin及Periostin抗體提供更多的實驗數(shù)據(jù)和科學依據(jù)，為臨床上及早診斷和治療NAFLD和高脂血癥奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1是高脂喂養(yǎng)和低脂喂養(yǎng)的小鼠肝臟中的Periostin表達對比圖。
[0037]圖2是瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠和瘦素缺乏的ob/ob肥胖小鼠肝臟中的Periostin表達對比圖。
[0038]圖3是正常人和脂肪肝病人的Periostin的表達對比圖，且與肝臟甘油三酯含量呈現(xiàn)明顯的正相關。
[0039]圖4是通過腺病毒介導的過表達系統(tǒng)，在C57BL/6小鼠肝臟中特異性過表達Periostin，對照組小鼠肝臟中過表達綠色熒光蛋白對比圖，其中，A為肝臟甘油三酯含量對比圖，B為肝臟/體重比增加對比圖，C為血清甘油三酯對比圖。
[0040]圖5是通過腺病毒介導的過表達系統(tǒng)，在C57BL/6小鼠肝臟中特異性過表達Periostin,對照組小鼠肝臟中過表達綠色熒光蛋白，兩組小鼠的肝臟組織石蠟切片的伊紅-蘇木精染色和油紅染色對比圖。
[0041]圖6是在培養(yǎng)的人源肝癌細胞株HepG2和小鼠原代肝臟原代細胞中加入純化的Periostin蛋白，證明了 Periostin能促進細胞內甘油三酯的沉積。
[0042]圖7是制備的Periostin抗體用于中和肥胖小鼠的對比圖，其中，圖7A為三種基因型小鼠肝臟原代細胞的蛋白質免疫印跡實驗對比圖；7B為瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠給予Periostin抗體處理2周后，同對照組IgG組相比,血清Periostin含量對比圖。
[0043]圖8是給予瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠尾靜脈注射Periostin抗體和注射IgG兩周后的對比圖，其中，圖8A為肝臟/體重比對比圖，圖SB為肝臟甘油三酯含量對比圖，圖8C為血清甘油三酯含量對比圖，圖8D為血清β -羥丁酸水平對比圖。
[0044]圖9是給予瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠尾靜脈注射Periostin抗體和注射IgG兩周后的脂肪酸β_氧化相關基因的表達對比圖。
【具體實施方式】
[0045]下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步說明:
[0046]小鼠:C57BJ/6野生型雄性小鼠(8_12周齡)，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。db/db、ob/ob小鼠(8-12周齡)，購自南京大學模式生物中心。小鼠飼養(yǎng)在上海市內分泌代謝病研究所清潔級動物房，飼養(yǎng)溫度為21±1°C，濕度55±10%，光照時間為8:00AM-8:00PM。
[0047]普通飼料購自上海斯萊克實驗動物有限公司，含有10Kcal%脂肪，70Kcal%碳水化合物，20Kcal%蛋白質。
[0048]高脂飼料購自美國Research Diet公司(D12492)，60Kcal%脂肪，20Kcal%碳水化合物，20Kcal%蛋白質。
[0049]細胞:人源肝癌細胞株H印G2購自中科院上海生命科學院細胞庫，采用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培液中添加10%胎牛血清及100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素。細胞每2傳代一次。
[0050]實施例1
[0051]將C57BL/6小鼠分成兩組，一組是高脂喂養(yǎng)12周，另一組是低脂喂養(yǎng)12周，通過基因表達譜芯片技術，比較了高脂組和低脂喂養(yǎng)組的兩組小鼠肝臟基因的表達差異，從中發(fā)現(xiàn):在高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟中，表達顯著上調(P〈0.05)。通過Real-time PCR和ELISA實驗，檢測Periostin基因在高脂喂養(yǎng)組的肥胖小鼠、瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠、瘦素缺乏的ob/ob肥胖小鼠和脂肪肝病人中的表達，結果表明=Periostin基因在高脂喂養(yǎng)組的肥胖小鼠肝臟中的異常表達，具體如圖1所示；對于瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠和瘦素缺乏的ob/ob肥胖小鼠，兩組肥胖小鼠肝臟Periostin的表達顯著上調，具體如圖2所示；在脂肪肝病人中，Periostin的表達顯著升高，且與肝臟TG含量呈現(xiàn)明顯的正相關，具體見圖3所示。
[0052]實驗通過腺病毒介導的過表達系統(tǒng)，在C57BL/6小鼠肝臟中特異性過表達Periostin，同時，以C57BL/6小鼠肝臟中特異性過表達綠色熒光蛋白(GFP)作為對比實驗進行檢測，檢測結果為:與過表達綠色熒光蛋白(GFP)組小鼠相比，Periostin過表達后小鼠肝臟TG含量增加、肝臟/體重比增加，血清中TG含量增加，尤其是血清中低密度脂蛋白-TG(VLDL-TG)含量升高，具體見圖4A-4C所示。同時，將特異性過表達Periostin小鼠肝臟組織和特異性過表達GFP小鼠肝臟組織進行石蠟切片的伊紅-蘇木精染色(H&E)和油紅染色(Oil Red 0)實驗，實驗證實:Periostin過表達后，肝細胞呈現(xiàn)氣球樣變性，如圖5所示。
[0053]在體外培養(yǎng)的人源肝癌細胞株H印G2和小鼠原代肝細胞(MPH)中加入純化的Periostin蛋白，具體如圖6所示,發(fā)現(xiàn):Periostin能促進細胞內甘油三酯的沉積。
[0054]通過上述實驗，說明了 Periosin表達與NAFLD、高脂血癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系關系。
[0055]實施例2
[0056]Periostin抗體制作過程。
[0057]I)、小鼠Periostin蛋白的氨基酸序列(如SEQ IDN0.1所示)為:
[0058]I mvpllplyal lllflcdinp anansyydkv lahsrirgrd qgpnvcalqq ilgtkkkyfs
[0059]61 scknwyqgai cgkkttvlye ccpgymrmeg mkgcpavmpi dhvygtlgiv gatttqhysd
[0060]121 vsklreeieg kgsytyfaps neawenldsd irrglennvn vellnalhsh mvnkrmltkd
[0061]181 lkhgmvipsm ynnlglfinh ypngvvtvnc arvihgnqia tngvvhvidr vltqigtsiq
[0062]241 dfleaeddls sfraaaitsd lleslgrdgh ftlfaptnea feklprgvle rimgdkvase
[0063]301 almkyhilnt lqcseaitgg avfetmegnt ieigcegdsi singikmvnk kdivtkngvi[0064]361 hlidevlipd sakqvielag kqqttftdlv aqlglasslk pdgeytllap vnnafsddtl
[0065]421 smdqrllkli lqnhilkvkv glsdlyngqi letiggkqlr vfvyrtaici enscmvrgsk
[0066]481 qgrngaihif reiiqpaeks lhdklrqdkr fsiflsllea adlkdlltqp gdwtlfaptn
[0067]541 dafkgmtsee relligdkna lqniilyhlt pgvyigkgfe pgvtnilktt qgskiylkgv
[0068]601 netllvnelk skesdimttn gvihvvdkll ypadipvgnd qllellnkli kyiqikfvrg
[0069]661 stfkeipmtv yrpamtkiqi egdpdfrlik egetvtevih gepvikkytk iidgvpveit
[0070]721 ekqtreerii tgpeikytri stgggetget lqkflqkevs kvtkfieggd ghlfedeeik
[0071]781 rllqgdtpak kipankrvqg prrrsregrsq
[0072]2)、抗原片段的選取:
[0073]將其中的第761 位至 790 位氨基酸片段(wkvtkf ieggdghlfedeeikrlIqgdtpak)選定為抗原片段。
[0074]3)、抗原生產(chǎn):
[0075]通過基因片段合成、表達載體構建、陽性克隆鑒定、陽性克隆質粒提取及表達菌轉化、大量誘導蛋白表達產(chǎn)生、Ni柱親和純化步驟得到蛋白抗原用于免疫。
[0076]4)、動物免疫:
[0077]將步驟3)中獲得的抗原混合免疫鼠齡為8~12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，將3只小鼠的脾臟混合進行融合。
[0078]5)、融合和單抗篩選:
[0079]將免疫反應最好的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合,融合后的細胞經(jīng)過稀釋，分置于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)10-14天進行ELISA檢測，挑選OD值高的孔中的細胞進行有限稀釋法亞克隆，直至陽性孔比率為100%，得到建株成功的細胞株并進行擴大培養(yǎng)，細胞數(shù)按(1-2) XlO6/管進行凍存。
[0080]6)、腹水制備:
[0081]將步驟5)中的細胞株采用小鼠腹腔接種法制備腹水，10-14天收集腹水，采用Protein G柱純化腹水,得到Protein抗體。
[0082]在野生型小鼠原代肝細胞、Periostin敲除型小鼠原代肝細胞、Periostin敲除型小鼠原代肝細胞轉染Perisotin腺病毒36小時的肝細胞中，通過蛋白質免疫印跡實驗，驗證得到的Protein抗體的特異性,具體如圖7A所示；瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠尾靜脈注射給予Periostin抗體處理2周后，同對照組相比,血清Periostin水平下降,見圖7B所示。
[0083]實施例3
[0084]給予db/db小鼠尾靜脈注射實施例2中制備的Periostin抗體兩周，注射量為5mg/kg,給予另一 db/db小鼠尾靜脈注射IgG兩周,注射量為5mg/kg作為對照組進行比較，檢測結果如下=Periostin抗體注射小鼠組的肝臟/體重比顯著降低；肝臟和血清中的TG含量也明顯降低；血清b-羥丁酸水平也大大升高，具體如圖8A-圖8D所示。同時脂肪酸β -氧化相關基因的表達也增加了，如圖9所示。
[0085]通過上述實驗,說明Periostin抗體具有顯著改善NAFLD發(fā)展的作用，同時對于高脂血癥也有改善作用，可應用于制備治療NAFLD和高脂血癥的藥物。
【權利要求】
1.骨膜蛋白基因在制備篩選非酒精性脂肪肝病試劑中的應用。
2.骨膜蛋白基因在制備篩選高脂血癥試劑中的應用。
3.一種骨膜蛋白抗體，其特征在于:該抗體的抗原片段的氨基酸序列如SEQ IDN0.2~4所示。
4.如權利要求3所述的骨膜蛋白抗體在制備治療非酒精性脂肪肝病藥物中的應用。
5.如權利要求3所述的骨膜蛋白抗體在制備治療高脂血癥病藥物中的應用。
【文檔編號】A61K39/395GK103550790SQ201310539531
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權日:2013年11月4日
【發(fā)明者】李小英, 陸炎, 劉醒, 熊雪蓮 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院