一種納米脂質(zhì)超聲造影劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種納米脂質(zhì)超聲造影劑及制備方法，該方法采用脂質(zhì)薄膜分散加機(jī)械振蕩法制備了粒徑小、可穩(wěn)定顯像的納米脂質(zhì)造影劑，其外殼抗壓性好，在低機(jī)械指數(shù)條件下不易破裂，并且在溶液中的溶解度和擴(kuò)散率極低，可很好的進(jìn)行微循環(huán)灌注，在血液中可以持續(xù)較長時(shí)間，具有良好的聲學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性，通過體內(nèi)造影表明納米脂質(zhì)超聲造影劑可明顯增強(qiáng)心臟、腎臟、肝臟以及腫瘤顯像，且造影時(shí)間長，可持續(xù)30min以上。
【專利說明】一種納米脂質(zhì)超聲造影劑及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001]本發(fā)明屬于納米材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種納米脂質(zhì)超聲造影劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]超聲波成像技術(shù)是一個(gè)廣泛應(yīng)用的，非侵入性及成本低的醫(yī)療成像方式，然而，普通超聲成像如不借助造影劑，分辨率較低。與常規(guī)超聲檢查相比，超聲造影具有動態(tài)、實(shí)時(shí)、連續(xù)顯示臟器實(shí)質(zhì)和病灶血管構(gòu)架及組織灌注狀況等優(yōu)勢，更重要的是，與其他方法相比，超聲造影簡便、易重復(fù)、廉價(jià)、無放射性、無腎毒性、安全性高。如今，超聲造影已和增強(qiáng)CT、M一起列入肝臟的三種常規(guī)影像診斷方法，而且該技術(shù)也已推廣至多個(gè)臟器的應(yīng)用，如腎臟、胰腺、脾臟、甲狀腺、乳腺、血管等，極大地推動了臨床超聲診斷的發(fā)展。
[0003]腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成。腫瘤血管通過增加氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)快速增長、入侵和轉(zhuǎn)移，然而，腫瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差，很多惡性腫瘤的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞孔隙范圍約380~780nm，這取決于不同的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)，腫瘤組織淋巴回流差，造成大分子類物質(zhì)和脂質(zhì)顆粒具有選擇性高通透性和滯留性，這種現(xiàn)象被稱作實(shí)體瘤組織的增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(EPR, enhanced permeability andretention effect) ?腫瘤脈管系統(tǒng)的EPR效應(yīng)可允許脂質(zhì)體、高分子膠束等大分子藥物和基因傳遞到腫瘤組織當(dāng)中，可用于腫瘤組織影像診斷和治療。因此，顯像劑或抗癌治療劑可以通過腫瘤血管用以靶向成像和治療的基本要求就是要有一個(gè)小的粒徑。
[0004]然而，目前臨床上用的超聲造影劑主要是微氣泡造影劑，為包裹一定氣體形成的殼膜微氣泡結(jié)構(gòu)，殼膜可防止微氣泡之間的相互融合以及內(nèi)部氣體的釋放，從而增強(qiáng)了造影劑的穩(wěn)定性，微氣泡直徑1-8 μ m,不能透過血管壁到達(dá)位于超出毛細(xì)血管的細(xì)胞，如許多癌細(xì)胞，所以它們只能作為血池內(nèi)顯像劑，限制了對其血管外疾病的診斷與治療。隨著納米技術(shù)研究的進(jìn)一步深入，新型的亞微米級的超聲造影劑正逐漸出現(xiàn)，包括具有與組織不同聲學(xué)響應(yīng)性的脂質(zhì)體、微乳、納米乳和一些納米顆粒，這些納米粒子作為超聲造影劑，因?yàn)槠洫?dú)特的尺寸效應(yīng)可同時(shí)具有靶向和治療作用[Rapoport N, Gao Z&KennedyA.Multifunctional Nanoparticles for Combining Ultrasonic Tumor Imaging andTargeted Chemotherapy [J].J Natl Cancer Inst，2007，99 (14): 1095-1106]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，直徑小于900um的超聲造影劑具有良好的靶向性[Hughes M S，Marsh J N&Hall CS，et al.Acoustic Characterization in Whole Blood and Plasma of Site-TargetedNanoparticle Ultrasound Contrast Agent for Molecular Imaging[J].J Acoust SocAm，2005，117(2):964-972]。目前l(fā)_7um的超聲造影劑被認(rèn)為是顯影效果較好的尺寸，但如果造影劑的尺寸很小，則能夠穿過癌癥新生血管的不規(guī)則血管壁進(jìn)入腫瘤組織顯影成像。
[0005]近年來，發(fā)展了許多新的方法和技術(shù)制造以納米粒子為基礎(chǔ)的靶向腫瘤的超聲造影劑[Wheatley M A, Forsberg F&Dube N，et al.Surfactant-Stabilized ContrastAgent On the Nanoscale for Diagnostic Ultrasound Imaging[J].Ultrasound MedBiol, 2006, 32(1):83-93]。在幾個(gè)研究中，制備了各種殼膜(磷脂或聚合物)和核心(氣體，液體或固體)的納米級超聲造影劑，并且顯示出較好的對比度增強(qiáng)[Marxer EE，Brussler J&Becker A, et al.Development and Characterization of New NanoscaledUltrasound Active Lipid Dispersions as Contrast Agents[J].Eur J PharmBiopharm, 2011, 77 (3):430-437]。納米級造影劑用于腫瘤成像,主要是由于其高的組織外滲率，在腫瘤區(qū)域造影劑的增加可以達(dá)到令人滿意的成像。脂質(zhì)體因其具有如無毒，可生物降解，無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用做治療藥物或基因的運(yùn)送載體。這些類型的脂質(zhì)材料也被用于包裹具有聲反射的氣體，現(xiàn)在有幾種脂質(zhì)膜的造影劑被常規(guī)應(yīng)用于臨床超聲診斷當(dāng)中[Goertz D E, de Jong N&van der Steen A F.Attenuation and Size DistributionMeasurements of Definity and Manipulated Definity Populations[J].Ultrasound MedBiol, 2007, 33(9): 1376-1388]。理想的氣泡超聲造影劑的基本要求包括:可通過毛細(xì)血管，有類似紅細(xì)胞的血流動力學(xué)特征；穩(wěn)定性好，具有良好的滲透性以及適當(dāng)?shù)谋砻鎻埩?，且進(jìn)入人體后能夠持續(xù)足夠時(shí)間；能產(chǎn)生豐富的諧波；殼膜材料和包裹的氣體無刺激、損傷或毒副作用。目前，已有多種材料被用來作為微氣泡的包膜材料，主要分為以下幾類:脂質(zhì)類、表面活性劑類、蛋白質(zhì)類和聚合物類。隨著各種新型材料的出現(xiàn)和制備方法的提高，可制備同時(shí)裝載氣體、基因或藥物的微氣泡造影劑，實(shí)現(xiàn)超聲顯影增強(qiáng)進(jìn)行診斷的同時(shí)，還可進(jìn)一步達(dá)到傳輸藥物、靶向定位和疾病治療等多種功能，已經(jīng)逐漸成為超聲醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。氣泡造影劑內(nèi)的氣體成分主要包括氮?dú)?、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷等。包裹空氣的微氣泡造影劑靜脈注射進(jìn)入人體內(nèi)后，空氣能很快溶解到血液當(dāng)中，決定了它持續(xù)時(shí)間短，容易破裂，導(dǎo)致造影診斷還沒有結(jié)束，微氣泡已消失，從而限制了臨床應(yīng)用中觀察和診斷的時(shí)間，此外，超聲能量作用下由于氣泡的收縮和擴(kuò)展，會進(jìn)一步加速微氣泡的破壞。包裹高密度惰性氣體(不易溶于水或血液)為主的外膜薄而柔軟的氣泡,穩(wěn)定時(shí)間長，振動及回波特性好。[0006]隨著納米材料制備技術(shù)的發(fā)展，氣泡造影劑的尺寸和穩(wěn)定性已經(jīng)能夠得到控制，成為臨床超聲造影的有用工具。當(dāng)微泡的大小被減小到納米級時(shí)，造影劑的分子特性發(fā)生重大變化，出現(xiàn)了一些獨(dú)特的性質(zhì)，包括半衰期長，高表面反應(yīng)性，吸附力強(qiáng)，酶抗性退化等。所有這些屬性有利于新的納米級造影劑在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。研究顯示Pluronic嵌段共聚物可以穩(wěn)定納米粒子，控制它們的大小，與脂質(zhì)膜相互作用，改變脂質(zhì)的流動性或脂質(zhì)泡殼的彈性，防止粒子被網(wǎng)狀內(nèi)皮系吞曬等作用。Tianyi M等[Krupka T M, SolorioL&ffilson R E, et al.Formulation and Characterization of Echogenic Lipid-PluronicNanobubbles [J].Mol Pharm, 2010, 7(1):49-59]研究了分子量范圍 1100 ~4600 的 5種Pluronic嵌段共聚物(L31，L61，L81，L64和P85)加入到脂質(zhì)外殼脂質(zhì)膜中水合，后充入全氟化碳?xì)怏w，結(jié)果表明其余脂質(zhì)膜的相互作用可顯著減少氣泡的大小，最重要的是，研究結(jié)果表明雖然是一種納米尺度的氣泡，它們的穩(wěn)定性以及和在體外和體內(nèi)的回聲不受損害，由此產(chǎn)生的納米氣泡更適合用于腫瘤增強(qiáng)成像和后續(xù)治療基因或藥物的遞送。
[0007]超聲造影技術(shù)是將超聲造影劑經(jīng)靜脈注入人體內(nèi)后，利用造影劑使后散射回聲增強(qiáng)，從而明顯提高超聲診斷的分辨力、敏感性和特異性的技術(shù)。隨著超聲儀器性能的改進(jìn)和新型聲學(xué)造影劑的出現(xiàn)，超聲造影已經(jīng)在心肌、肝、膽、胰、脾、腎、盆腔臟器等疾病和腹腔腫瘤、乳腺腫瘤、甲狀腺及淺表淋巴結(jié)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。超聲造影在檢出占位性病變、定性診斷和判斷腫瘤活性方面，其所獲得的增強(qiáng)結(jié)果可與增強(qiáng)CT或MRI相媲美，并且其具有所使用劑量小，對人體無明顯毒副作用及過敏現(xiàn)象，無輻射，操作簡便，實(shí)時(shí)動態(tài)，可重復(fù)檢查的優(yōu)點(diǎn)。超聲造影技術(shù)除了常規(guī)的造影諧波成像外，還有低機(jī)械指數(shù)成像、間歇式超聲成像、能量對比諧波成像、造影劑爆破成像、受激聲波發(fā)射成像、反脈沖諧波成像等方法。低機(jī)械指數(shù)成像是指當(dāng)采用發(fā)射的超聲，其機(jī)械指數(shù)MI低于0.15時(shí)，稱為低機(jī)械指數(shù)。采用這種低于超聲造影劑被擊破時(shí)的能量的超聲波進(jìn)行的造影稱為低機(jī)械指數(shù)造影。這種方法可以實(shí)現(xiàn)血流連續(xù)諧波成像，也能減少組織諧波的干擾。本研究采用了實(shí)時(shí)造影匹配成像造影技術(shù)(CnTI)進(jìn)行納米超聲造影劑的體內(nèi)外超聲造影，CnTI使用頻域處理的方法，發(fā)射時(shí)，僅發(fā)射“純的”基波信號，接收時(shí)，主要處理二次諧波的信號，在提取造影劑諧波信號的同時(shí)并消除組織回波的線性基波成分，可增強(qiáng)造影劑的分辨力，提高信噪比、改善聲學(xué)圖像質(zhì)量和提升圖像的對比度，使得病灶的邊界及血管顯像比常規(guī)影像更加清晰[FrinkingP J, Bouakaz A&Kirkhorn J, et al.Ultrasound Contrast Imaging:Current and NewPotential Methods [J].Ultrasound Med Biol, 2000，26(6):965-975]。超聲造影劑對超聲波產(chǎn)生的回波信號是超聲造影診斷成像的物理基礎(chǔ)，其原理在于氣泡的可壓縮性，造影劑在超聲波作用下表現(xiàn)為“膨脹一壓縮一再膨脹一再壓縮”的非對稱共振運(yùn)動，氣體比軟組織等生物組織更易壓縮，因此當(dāng)微氣泡受到超聲脈沖波輻照時(shí)，微氣泡經(jīng)歷了交替的收縮和膨脹過程，出現(xiàn)基波、二次諧波、次諧波等各種復(fù)雜的回波響應(yīng)，導(dǎo)致復(fù)雜的微氣泡造影劑超聲成像機(jī)理，新型超聲造影劑及造影技術(shù)為超聲造影定量研究提供了有力手段。
[0008]目前臨床使用超聲造影劑平均直徑為數(shù)微米，而疾病狀態(tài)中的血管內(nèi)皮間隙至多允許直徑小于700nm的顆粒穿過，因此微米級超聲造影劑不能穿透血管內(nèi)皮間隙，大大減弱了其用于治療的能力。因此需要制備出不再局限于僅獲取組織的血流灌注信息，而是通過提高超聲顯像的特異性并向治療領(lǐng)域發(fā)展的造影劑。但隨著超聲造影劑從單一的診斷功能到結(jié)合基因或藥物進(jìn)行治療等多功能的實(shí)現(xiàn)，微氣泡的研究和應(yīng)用正變得越來越廣泛，因此，制備粒徑更小、性質(zhì)穩(wěn)定、回聲增強(qiáng)效果好的超聲造影劑十分重要。納米級造影劑粒徑更小，賦予它們極強(qiáng)的穿透力，因此近年來成為研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]技術(shù)問題:本發(fā)明提供了一種可實(shí)現(xiàn)腫瘤血管外靶向顯影，運(yùn)用于腫瘤組織影像診斷和治療中的納米脂質(zhì)超聲造影劑，同時(shí)提供了簡單、易行的制備上述納米脂質(zhì)超聲造影劑的方法。
[0010]技術(shù)方案:本發(fā)明的納米脂質(zhì)超聲造影劑的制備方法，包括下述步驟:
[0011](I)按照摩爾比80:12:8~85:10:5稱取二硬脂酰基卵磷脂、二苯基磷酰基疊氮化物、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000，混合后置于容器中；
[0012](2)向步驟(1)制得的混合物中加入氯仿和甲醇的混合液，混合物與混合液的質(zhì)量體積比為0.0005g/ml~0.001 g/ml,混合液中氯仿與甲醇的體積比為1:1~2:1,然后進(jìn)行超聲震蕩，直至容器中的上述混合物質(zhì)充分溶解；
[0013](3)將放置有步驟(2)制得混合物質(zhì)的容器安于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在50~55V、轉(zhuǎn)速80~lOOr/min、抽真空條件下運(yùn)行，使容器中的有機(jī)溶劑充分揮發(fā)，直至容器瓶壁形成一層白色、均勻的脂質(zhì)薄膜；
[0014](4)按照質(zhì)量體積比1.5~2毫克/毫升，向0.01~0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中加入嵌段式聚醚F-68，然后將其加入到步驟(2)得到的附著有脂質(zhì)薄膜的容器中，溶解脂質(zhì)薄膜后，超聲分散直至瓶壁薄膜完全脫落，使其形成磷脂濃度為3~5毫克/毫升的脂質(zhì)懸液；
[0015](5)將得到的脂質(zhì)懸液加入到容器中，充入六氟化硫氣體后，振蕩直至脂質(zhì)懸液呈乳白色，黏稠，不透明；
[0016](6)靜置后棄去上層泡沫，低速離心后使脂質(zhì)懸液分層，棄去上層粒徑較大的微氣泡，取下層的乳白色液體漂洗3至5次，重懸即得納米脂質(zhì)造影劑。
[0017]本發(fā)明的納米脂質(zhì)超聲造影劑，是按照上述方法制備得到的。
[0018]本發(fā)明的納米脂質(zhì)超聲造影劑，可在超聲成像、特別是腫瘤血管外靶向顯影以及治療、特別是腫瘤組織靶向和定位治療中的應(yīng)用。
[0019]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0020]本發(fā)明采用薄膜分散法加機(jī)械振蕩法制備了納米級脂質(zhì)超聲造影劑，并對制備的微氣泡進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征和穩(wěn)定性考察。通過對大鼠及荷瘤鼠進(jìn)行超聲造影，觀察大鼠心、肝、腎實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)情況以及腫瘤的顯像情況，并與普通微米級脂質(zhì)造影劑的顯影效果進(jìn)行了比較。采用機(jī)械振蕩法制備的納米級脂質(zhì)造影劑，電鏡下呈圓球形外觀，外包被一層脂質(zhì)膜，內(nèi)充有透亮的SF6氣體，分散度好，粒徑測量儀示平均粒徑為413.8nm, zeta電位值為-23.39mV。EDS分析結(jié)果示納米級脂質(zhì)泡中含有包裹的氣體成分氟和硫以及組成脂質(zhì)膜的碳、氮、氧和磷等元素。納米級脂質(zhì)造影劑對L-929細(xì)胞的細(xì)胞毒性為I級，屬對細(xì)胞無毒性范疇，無溶血發(fā)生。體外超聲顯影顯示納米級脂質(zhì)造影劑表現(xiàn)出與微米級脂質(zhì)造影劑以及聲諾維的微氣泡相類似的超聲對比增強(qiáng)能力。體內(nèi)造影靜脈注射納米級脂質(zhì)造影劑后，與造影前相比，大鼠心臟、肝臟和腎臟可見明顯、持續(xù)的增強(qiáng)顯像。移植瘤超聲造影的時(shí)間-強(qiáng)度曲線分析表明，納米級脂質(zhì)造影劑與普通脂質(zhì)微泡造影劑相比較，達(dá)峰時(shí)間晚，峰值強(qiáng)度略低，但造影增強(qiáng)持續(xù)時(shí)間更長`。在體循環(huán)15min后，普通微泡在腫瘤血管內(nèi)已基本被清除，而納米級脂質(zhì)泡仍有部分位于腫瘤組織區(qū)域。該納米脂質(zhì)超聲造影劑可實(shí)現(xiàn)腫瘤血管外靶向顯影，可運(yùn)用于腫瘤組織影像診斷和治療中。
[0021]本發(fā)明方法中采用采用薄膜分散加機(jī)械振蕩法成功制備了表面帶負(fù)電荷的納米級超聲造影劑，該方法簡單、易行。納米級超聲造影劑具有良好的生物相容性，無細(xì)胞毒性及溶血發(fā)生。體外超聲顯影評價(jià)實(shí)驗(yàn)表明，在相同超聲成像條件下，脂質(zhì)納泡表現(xiàn)出與微米級脂質(zhì)造影劑以及商品化的聲諾維微氣泡相類似的超聲對比增強(qiáng)能力。體內(nèi)造影，靜脈注射納米級造影劑后，與造影前相比，大鼠心臟、肝臟和腎臟可見明顯、持續(xù)的增強(qiáng)顯像。移植瘤超聲造影的時(shí)間-強(qiáng)度曲線分析表明，納米級脂質(zhì)泡與普通脂質(zhì)微泡造影劑相比較，達(dá)峰時(shí)間較晚，峰值強(qiáng)度略低，增強(qiáng)持續(xù)時(shí)間更長。在體循環(huán)15min后，普通微泡在腫瘤血管內(nèi)基本被清除，而納米級脂質(zhì)泡仍有部分位于腫瘤組織區(qū)域。該納米級超聲造影劑具有良好的影像增強(qiáng)作用，因其粒徑小，可穿過腫瘤新生毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙，可實(shí)現(xiàn)腫瘤血管外靶向顯影，可運(yùn)用于腫瘤組織影像診斷和治療中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是納米脂質(zhì)造影劑的透射電鏡圖。
[0023]圖2是超聲圖像ROI平均灰階計(jì)算結(jié)果。[0024]圖3是納米級超聲造影劑與微米級超聲造影劑腫瘤超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明方案做進(jìn)一步具體說明。
[0026]1主要試劑:二硬脂?；蚜字?DSPC) ;二苯基磷?；B氮化物(DPPA) ;二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000);六氟化硫氣體(SF6) ；PluronicF-68 ；RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清；噻唑藍(lán)(MTT，AMRESC0) ;二甲基亞砜(DMSO, Sigma公司)。
[0027]2納米脂質(zhì)造影劑的制備及檢測
[0028]2.1納米脂質(zhì)造影劑的制備
[0029]實(shí)施例1:
[0030]采用脂質(zhì)薄膜分散加機(jī)械振蕩法制備納米脂質(zhì)造影劑，包括下述步驟:
[0031](1)按照摩爾比80:12:8稱取二硬脂酰基卵磷脂、二苯基磷?；B氮化物、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000，混合后置于容器中；
[0032](2)向步驟(1)制得的混合物中加入氯仿和甲醇的混合液，混合物與混合液的質(zhì)量體積比為0.0005g/ml，混合液中氯仿與甲醇的體積比為2:1，然后進(jìn)行超聲震蕩，直至容器中的上述混合物質(zhì)充分溶解；
[0033](3)將放置有步驟(2)制得混合物質(zhì)的容器安于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在50°C、轉(zhuǎn)速lOOr/min、抽真空條件下運(yùn)行，使容器中的有機(jī)溶劑充分揮發(fā)，直至容器瓶壁形成一層白色、均勻的脂質(zhì)薄膜；
[0034](4)按照質(zhì)量體積比2毫克/毫升，向0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中加入嵌段式聚醚F-68，然后將其加入到步驟(2)得到的附著有脂質(zhì)薄膜的容器中，溶解脂質(zhì)薄膜后，超聲分散直至瓶壁薄膜完全脫落，使其形成磷脂濃度為3毫克/毫升的脂質(zhì)懸液；
[0035](5)將得到的脂質(zhì)懸液加入到容器中，充入六氟化硫氣體后，振蕩直至脂質(zhì)懸液呈乳白色，黏稠，不透明；
[0036](6)靜置后棄去上層泡沫，低速離心后使脂質(zhì)懸液分層，棄去上層粒徑較大的微氣泡，取下層的乳白色液體漂洗3至5次，重懸即得納米脂質(zhì)造影劑。
[0037]實(shí)施例2，基本流程步驟同實(shí)施例1，不同之處如下:
[0038]步驟(1)中按照摩爾比83:11:6稱取二硬脂?；蚜字⒍交柞；B氮化物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000制備納米脂質(zhì)造影劑；
[0039]步驟(2)中按照步驟(1)制得的混合物與氯仿甲醇混合液的質(zhì)量體積比為
0.0008g/ml制備納米脂質(zhì)造影劑，氯仿與甲醇的體積比為1.5:1。
[0040]步驟(3)中，將步驟(2)制得混合物安于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在51°C、轉(zhuǎn)速80r/min、抽真空條件下運(yùn)行。
[0041]步驟(4)中，按照質(zhì)量體積比1.5毫克/毫升，向0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中加入嵌段式聚醚F-68，然后將其加入到步驟(2)得到的附著有脂質(zhì)薄膜的容器中，溶解脂質(zhì)薄膜后，超聲分散形成磷脂濃度為4毫克/毫升的脂質(zhì)懸液。
[0042]本實(shí)施例中，其余操作和物質(zhì)成分之比，均與實(shí)施例1相同。
[0043]實(shí)施例3，基本流程步驟同實(shí)施例1，不同之處如下:
[0044]步驟(1)中按照摩爾比85:10:5稱取二硬脂?；蚜字?、二苯基磷酰基疊氮化物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000制備納米脂質(zhì)造影劑；
[0045]步驟(2)中按照步驟(1)制得的混合物與氯仿甲醇混合液的質(zhì)量體積比為
0.001g/ml制備納米脂質(zhì)造影劑，氯仿與甲醇的體積比為1:1。
[0046]步驟(3)中，將步驟(2)制得混合物安于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在55°C、轉(zhuǎn)速90r/min、抽真空條件下運(yùn)行。
[0047]步驟(4)中，按照質(zhì)量體積比1.8毫克/毫升，向0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液中加入嵌段式聚醚F-68，然后將其加入到步驟(2)得到的附著有脂質(zhì)薄膜的容器中，溶解脂質(zhì)薄膜后，超聲分散形成磷脂濃度為5毫克/毫升的脂質(zhì)懸液。
[0048]本實(shí)施例中，其余操作和物質(zhì)成分之比，均與實(shí)施例1相同。
[0049]2.2電鏡形態(tài)學(xué)檢測
[0050]取出少量制備的納米脂質(zhì)造影劑，滴有膜銅網(wǎng)，制得電鏡樣品，在H-600型透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)下觀察。自制納米脂質(zhì)造影劑為乳白色混懸液，透射電鏡下，納米脂質(zhì)造影劑呈圓球形外觀，外包被一層脂質(zhì)膜，內(nèi)充有透亮的SF6氣體，分散度好(圖1)。血球計(jì)數(shù)儀測納米微泡平均濃度為(1.19 ±0.11) X 109/ml。在-4°C冰箱保一周，造影劑粒徑、分布仍較均勻，未見明顯粘著成團(tuán)。
[0051 ] 2.3掃描電子顯 微鏡能譜儀(SEM-EDS)表征分析
[0052]取少量制備的納米脂質(zhì)造影劑，取適量懸液滴加在銅網(wǎng)上，在SEM視野下任意選幾個(gè)視野，用能譜儀對其成份進(jìn)行分析，可見其中含有包裹的氣體氟和硫以及組成脂質(zhì)膜的碳、氮、氧和磷等元素，證實(shí)納米脂質(zhì)造影劑已制備成功。
[0053]2.4粒徑及zeta電位分析
[0054]分別取2mL用PBS緩沖液(pH7.4)稀釋過的納米脂質(zhì)造影劑置于比色皿中，用激光粒度分析儀(Brookhaven儀器公司)進(jìn)行粒徑、Zeta電位測定,應(yīng)用動態(tài)光散射軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，記錄平均粒徑、多分散性指數(shù)及表面電位，每個(gè)樣本重復(fù)3次。由激光粒度分析儀檢測到納米脂質(zhì)造影劑平均直徑為413.8±12.0nm，呈單峰狀，粒徑分布窄；而微米脂質(zhì)造影劑的平均直徑1763.7± 185.4nm。在pH7.4中性環(huán)境中，納米脂質(zhì)造影劑的zeta電位值為-23.39 ±0.96mV，而微米脂質(zhì)造影劑的zeta電位為-1.6 ±3.09mV。
[0055]2.5納米脂質(zhì)造影劑的穩(wěn)定性及濃度測定
[0056]4°C冰箱保存，一周后觀察其穩(wěn)定性；應(yīng)用血球計(jì)數(shù)儀在光鏡下測定納米脂質(zhì)造影劑的濃度，計(jì)算計(jì)數(shù)板5個(gè)中格納泡總數(shù)，壓線納泡只計(jì)左側(cè)和上方的，按以下公式計(jì)算:納泡數(shù)/ ml= (5個(gè)中格納泡總數(shù)/ 5) X25X稀釋倍數(shù)XlO4 / ml。
[0057]3納米脂質(zhì)造影劑的細(xì)胞毒性試驗(yàn)一MTT法
[0058]3.1L-929細(xì)胞的培養(yǎng)
[0059]L-929細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37°C，飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞。
[0060]3.2納米脂質(zhì)造影劑的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT)
[0061]取對數(shù)生長期的L-929細(xì)胞，常規(guī)消化成細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度至5X 104/mL，以100 μ L/孔接種96孔培養(yǎng)板，置37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后棄去原液，加入各種不同磷脂濃度(I μ g/ml,5 μ g/ml、10 μ g/mL和15 μ g/mL) RPMI1640培養(yǎng)液，陰性對照為1640培養(yǎng)液，陽性對照為0.7%的聚丙烯酰胺單體溶液，每組設(shè)復(fù)孔8個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，用倒置顯微鏡觀察L929細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，接著每孔加入20 μ LMTT,原條件培養(yǎng)4小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，加入DMS0150 μ L/孔，震蕩十分鐘后，在免疫酶標(biāo)儀上測定492nm處的吸光度值。按下式計(jì)算細(xì)胞相對增殖率，計(jì)算公式如下(relative growth rate, RGR):RGR%=實(shí)驗(yàn)組OD均值/陰性對照組OD均值X 100%,并按表1規(guī)定把RGR值轉(zhuǎn)換成6級反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為O或I級反應(yīng)為合格，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2級反應(yīng)的結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3-5級反應(yīng)為不合格。
[0062]表1RGR與毒性分級轉(zhuǎn)換表
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種納米脂質(zhì)超聲造影劑的制備方法，該方法包括下述步驟: (1)按照摩爾比80:12:8^85:10:5稱取二硬脂?；蚜字?、二苯基磷?；B氮化物、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000，混合后置于容器中； (2)向所述步驟(1)制得的混合物中加入氯仿和甲醇的混合液，混合物與混合液的質(zhì)量體積比為0.0005 g/mf0.001g/ml，所述混合液中氯仿與甲醇的體積比為1:廣2:1，然后進(jìn)行超聲震蕩，直至容器中的上述混合物質(zhì)充分溶解； (3)將放置有所述步驟(2)制得混合物質(zhì)的容器安于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在5(T55°C、轉(zhuǎn)速8(Tl00r/min、抽真空條件下運(yùn)行，使容器中的有機(jī)溶劑充分揮發(fā)，直至容器瓶壁形成一層白色、均勻的脂質(zhì)薄膜； (4)按照質(zhì)量體積比1.5^2毫克/毫升，向0.01~0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中加入嵌段式聚醚F-68，然后將其加入到所述步驟(2)得到的附著有脂質(zhì)薄膜的容器中，溶解脂質(zhì)薄膜后，超聲分散直至瓶壁薄膜完全脫落，使其形成磷脂濃度為3飛毫克/毫升的脂質(zhì)懸液； (5)將得到的脂質(zhì)懸液加入到容器中，充入六氟化硫氣體后，振蕩直至脂質(zhì)懸液呈乳白色，黏稠，不透明； (6)靜置后棄去上層泡沫，低速離心后使脂質(zhì)懸液分層，棄去上層粒徑較大的微氣泡，取下層的乳白色液體漂洗3至5次，重懸即得納米脂質(zhì)造影劑。
2.—種納米脂質(zhì)超聲造影劑，其特征在于，該造影劑是根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備得到的。
【文檔編號】A61K49/22GK103638534SQ201310638162
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】張東生, 李宏波 申請人:東南大學(xué)