豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑及其制備方法，所述凍干粉針劑是由豬白細(xì)胞干擾素原液和保護(hù)劑按20∶4-3的體積比混合凍干制成，原液中包括以下成分：豬白細(xì)胞懸液、豬血清、啟動(dòng)干擾素、仙臺(tái)病毒病毒液和培養(yǎng)液。經(jīng)原料制備→混和→水浴攪拌誘導(dǎo)培養(yǎng)→離心收獲→滅活病毒→解凍除菌→加入保護(hù)劑→凍干工序制成。其功能是作為一種廣譜抗病毒藥物，治療豬瘟、豬病毒性腹瀉、豬病毒性感冒等病毒性疾病。田間控制和推廣治療試驗(yàn)總治愈率為94.57％，人工控制治療豬瘟和豬病毒性腹瀉總治愈率為83.3％和100％。
【專利說(shuō)明】豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]豬病毒性疾病是豬傳染病中危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病，豬病毒性疾病中，尤以豬瘟危害最大，其發(fā)病率和病死率都很高，而且無(wú)有效的治療方法。目前，主要以防疫手段控制豬毒性疾病的發(fā)生。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，干擾素除了具有抗病毒作用之外，還具有抗腫瘤作用，及對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用和抗細(xì)胞等一系列的生理活性，但在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，動(dòng)物干擾素未被廣泛應(yīng)用，主要原因在于目前所獲得的動(dòng)物干擾素安全性不高，制備工藝復(fù)雜，成本高，售價(jià)昂貴，效果不顯著，推廣受到限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種具有廣譜抗病毒功效，適用于治療豬瘟、豬病毒性腹瀉、豬病毒性感冒等病毒性疾病的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑。
[0004]本發(fā)明的另一目的是提供上述豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑的制備方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑，所述凍干粉針劑是由豬白細(xì)胞干擾素原液和保護(hù)劑按20:4-3的體積比混合凍干制成。
[0006]其中，所述豬白細(xì)胞干擾素原液包括以下組成成分:豬白細(xì)胞懸液、豬血清、啟動(dòng)干擾素、仙臺(tái)病毒病毒液和培養(yǎng)液；其中，豬血清、仙臺(tái)病毒病毒液和培養(yǎng)液的體積比為250-350: 350-400: 5000 ;豬白細(xì)胞懸液和啟動(dòng)干擾素是加入到培養(yǎng)液中的，每毫升培養(yǎng)液中含有4 X 17-1O X 17個(gè)豬白細(xì)胞，每毫升培養(yǎng)液中含有50-150單位的干擾素抗病毒活性；
[0007]所述豬白細(xì)胞懸液的制備方法為:無(wú)菌采集健康豬鮮血，于4°C 3000轉(zhuǎn)/分的無(wú)菌條件下離心20分鐘，吸取呈灰黃色的中間層白細(xì)胞至血漿瓶?jī)?nèi)，用0.85% NH4Cl處理兩次后離心，收集沉淀白細(xì)胞，用Hank' s液洗去殘余NH4Cl,用培養(yǎng)液將沉淀白細(xì)胞稀釋成懸液；
[0008]所述豬血清的制備方法為:無(wú)菌采集健康豬鮮血，自然析出，用0.2% CaCl2處理血漿，除去其中的纖維蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0009]所述啟動(dòng)干擾素的制備方法為:首次采用人白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素，以后各次選用前批次效價(jià)最高的豬白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素；
[0010]所述仙臺(tái)病毒病毒液的制備方法為:于36-38°C受精雞蛋孵化7-15天后，接種仙臺(tái)病毒，再孵化65-79小時(shí)后，收獲病毒液，該病毒液的血凝效價(jià)為1: 320-1280,置于-20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0011]所述培養(yǎng)液的制備方法為:向粉劑1640中加入蒸餾水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的濃度為3%，再加入青鏈霉素,使1640溶液中青鏈霉素達(dá)100-1000單位/暈升。
[0012]本發(fā)明中涉及的保護(hù)劑為蔗糖和脫脂牛奶溶于水制成的混合液，蔗糖和脫脂牛奶的濃度分別為0.356kg/L和0.711kg/L。
[0013]本發(fā)明還提供所述凍干粉針劑的制備方法，包括以下步驟:
[0014]步驟一、豬白細(xì)胞干擾素原液的制備
[0015](I)豬白細(xì)胞懸液的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，于4°C 3000轉(zhuǎn)/分的無(wú)菌條件下離心20分鐘，吸取呈灰黃色的中間層白細(xì)胞至血漿瓶?jī)?nèi)，用0.85% NH4Cl處理兩次后離心，收集沉淀白細(xì)胞，用Hank' s液洗去殘余NH4Cl,用培養(yǎng)液將沉淀白細(xì)胞稀釋成懸液；
[0016](2)豬血清的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，自然析出，用0.2% CaCl2處理血漿，除去其中的纖維蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0017](3)啟動(dòng)干擾素的制備:首次采用人白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素，以后各次選用前批次效價(jià)最高的豬白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素；
[0018](4)仙臺(tái)病毒病毒液的制備:于36_38°C受精雞蛋孵化7_15天后，接種仙臺(tái)病毒，再孵化65-79小時(shí)后，收獲病毒液，該病毒液的血凝效價(jià)為1: 320-1280，置于-20°C保存?zhèn)溆?
[0019](5)培養(yǎng)液的制備:向粉劑1640中加入蒸餾水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的濃度為3%，再加入青鏈霉素,使1640溶液中青鏈霉素達(dá)100-1000單位/毫升；
[0020](6)將豬白細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)液中，使每毫升培養(yǎng)液中含4X 17-1O X 17個(gè)豬白細(xì)胞，然后向每5000毫升培養(yǎng)液中加入豬血清250-350毫升，再加入啟動(dòng)干擾素，使每毫升培養(yǎng)液中含干擾素抗病毒活性50-150單位，最后加入仙臺(tái)病毒病毒液，每5000毫升培養(yǎng)液中加入病毒液350-400暈升；
[0021](7)將上述混合液置于水浴攪拌裝置中，以60-80轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)14小時(shí)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時(shí)后，用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值7.2-7.4，誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值7.2-7.4，在誘導(dǎo)培養(yǎng)開(kāi)始的第8小時(shí)，5分鐘內(nèi)通入無(wú)菌氧0.2升，每隔2小時(shí)通一次無(wú)菌氧，連續(xù)5次；
[0022](8)將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)后的液體于4°C，3000轉(zhuǎn)/分無(wú)菌條件下離心10_20分鐘，收集含干擾素的上清液，用甲醛溶液滅活病毒，上清液中甲醛的終濃度為1%。，然后置于-20°C凍存；
[0023](9)從_20°C解凍后，離心取上清，無(wú)菌條件下先用澄清濾器澄清，然后用除菌濾器除菌，即得豬白細(xì)胞干擾素原液，于4°C保存；
[0024]步驟二、保護(hù)劑的制備
[0025]將蔗糖和脫脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脫脂牛奶的濃度分別為0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目紗網(wǎng)過(guò)濾，濾液于100°C蒸汽滅菌45min，即得保護(hù)劑；
[0026]步驟三、豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑的制備
[0027]將上述制備的豬白細(xì)胞干擾素原液和保護(hù)劑按20:4-3的體積比混合后凍干，即得豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑，其中水份含量〈4 %。
[0028]凍干操作步驟如下:
[0029]真空冷凍干燥箱預(yù)凍至箱內(nèi)溫度_40°C ±2°C，保溫210min，抽真空至前后箱壓力(10pa，真空度達(dá)99%以上；
[0030]升華:第一次升華溫度設(shè)為_(kāi)2°C，時(shí)間為1380min ；
[0031]第二次升華溫度設(shè)為28°C，時(shí)間為60min ；
[0032]第三次升華溫度設(shè)為-35°C，時(shí)間為120min ；
[0033]第四次升華溫度設(shè)為48°C，時(shí)間為30min ；
[0034]保溫:最后保溫時(shí)間為240min，抽真空前壓力上升6.5-7.5pa時(shí)，保溫結(jié)束。
[0035]本發(fā)明提供的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑是一種廣譜抗病毒制劑，主治豬瘟、豬病毒性腹瀉、豬病毒性感冒等豬病毒性疾病。干擾素的抗病毒作用，不是直接抗病毒，而是與周圍的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，這種蛋白能改變病毒蛋白合成，使新病毒不能裝配，病毒繁殖受到抑制，從而起到抗病毒作用，豬白細(xì)胞干擾素注射劑注入豬體內(nèi)后，豬白細(xì)胞干擾素對(duì)豬病毒性疾病弱毒、強(qiáng)毒均有明顯的抑制增殖作用。
[0036]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0037](一)將本發(fā)明的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑配制成注射劑后，每毫升注射劑中干擾素的效價(jià)高達(dá)20000單位左右；
[0038]( 二)本品為凍干粉針劑形式，4_8°C貯存，有效期長(zhǎng)達(dá)30個(gè)月左右；
[0039](三)本品有利于在常溫下運(yùn)輸；
[0040](四)有效解決了液體注射劑型中容易出現(xiàn)的蛋白析出現(xiàn)象。

【具體實(shí)施方式】
[0041]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0042]實(shí)施例1豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑及其制備方法
[0043]本實(shí)施例的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑的制備方法包括以下步驟:
[0044]步驟一、豬白細(xì)胞干擾素原液的制備
[0045]1、豬白細(xì)胞懸液的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，于4°C 3000轉(zhuǎn)/分的無(wú)菌條件下離心20分鐘，先抽吸出血漿后，吸取呈灰黃色的中間層白細(xì)胞至血漿瓶?jī)?nèi)，用0.85% NH4Cl處理兩次后離心，收集沉淀白細(xì)胞，用Hank' s液洗去殘余NH4Cl,用培養(yǎng)液將沉淀白細(xì)胞稀釋成懸液。
[0046]2、豬血清的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，自然析出，用0.2% CaCl2處理血漿，除去其中的纖維蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0047]3、啟動(dòng)干擾素的制備:選用前批次效價(jià)最高的豬白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素。
[0048]4、仙臺(tái)病毒病毒液的制備:于36°C受精雞蛋孵化7天后，接種仙臺(tái)病毒，再孵化65小時(shí)后，收獲病毒液，該病毒液的血凝效價(jià)為1: 320,置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0049]5、培養(yǎng)液的制備:向粉劑1640中加入蒸餾水配制成1%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的濃度為3%，再加入青鏈霉素，使1640溶液中青鏈霉素達(dá)100單位/暈升。
[0050]6、將豬白細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)液中，使每毫升培養(yǎng)液中含約4X 17個(gè)豬白細(xì)胞，然后向每5000暈升培養(yǎng)液中加入豬血清250暈升,再加入啟動(dòng)干擾素，使每暈升培養(yǎng)液中含干擾素抗病毒活性50單位，最后加入仙臺(tái)病毒病毒液，每5000毫升培養(yǎng)液中加入病毒液350暈升。
[0051]7、將上述混合液置于水浴攪拌裝置中，以60-80轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)14小時(shí)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時(shí)后，用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值7.2，誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值7.2，在誘導(dǎo)培養(yǎng)開(kāi)始的第8小時(shí)，5分鐘內(nèi)通入無(wú)菌氧0.2升，每隔2小時(shí)通一次無(wú)菌氧，連續(xù)5次。
[0052]8、將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)后的液體于4°C，3000轉(zhuǎn)/分無(wú)菌條件下離心10分鐘，收集含干擾素的上清液，用甲醛溶液滅活病毒，上清液中甲醛的終濃度為1%。，然后置于-20°C凍存。
[0053]9、從-20°C解凍后，離心取上清，無(wú)菌條件下先用澄清濾器澄清，然后用除菌濾器除菌，即得豬白細(xì)胞干擾素原液，于4°C保存。
[0054]步驟二、保護(hù)劑的制備
[0055]將蔗糖和脫脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脫脂牛奶的濃度分別為0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目紗網(wǎng)過(guò)濾，濾液于100°C蒸汽滅菌45min，即得保護(hù)劑。
[0056]步驟三、豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑的制備
[0057]將上述制備的豬白細(xì)胞干擾素原液和保護(hù)劑按5:1的體積比混合后凍干，即得豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑，其中水份含量〈4%。
[0058]凍干操作步驟如下:
[0059](I)真空冷凍干燥箱預(yù)凍至箱內(nèi)溫度_40°C ±2°C，保溫210min，抽真空至前后箱壓力< 10pa，真空度達(dá)99%以上。
[0060](2)升華:第一次升華溫度設(shè)為-2 V，時(shí)間為1380min ；
[0061]第二次升華溫度設(shè)為28°C，時(shí)間為60min ；
[0062]第三次升華溫度設(shè)為-35°C，時(shí)間為120min ；
[0063]第四次升華溫度設(shè)為48°C，時(shí)間為30min。
[0064](3)保溫:最后保溫時(shí)間為240min，抽真空前壓力上升6.5-7.5pa時(shí)，保溫結(jié)束。
[0065]將上述制備的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑配制成注射劑后，每毫升注射劑中干擾素的效價(jià)約20000單位，4-8°C貯存有效期為30個(gè)月。
[0066]實(shí)施例2豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑及其制備方法
[0067]本實(shí)施例的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑的制備方法包括以下步驟:
[0068]步驟一、豬白細(xì)胞干擾素原液的制備
[0069]1、豬白細(xì)胞懸液的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，于4°C 3000轉(zhuǎn)/分的無(wú)菌條件下離心20分鐘，先抽吸出血漿后，吸取呈灰黃色的中間層白細(xì)胞至血漿瓶?jī)?nèi)，用0.85% NH4Cl處理兩次后離心，收集沉淀白細(xì)胞，用Hank' s液洗去殘余NH4Cl,用培養(yǎng)液將沉淀白細(xì)胞稀釋成懸液。
[0070]2、豬血清的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，自然析出，用0.2% CaCl2處理血漿，除去其中的纖維蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0071]3、啟動(dòng)干擾素的制備:選用前批次效價(jià)最高的豬白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素。
[0072]4、仙臺(tái)病毒病毒液的制備:于38°C受精雞蛋孵化15天后，接種仙臺(tái)病毒，再孵化79小時(shí)后,收獲病毒液,該病毒液的血凝效價(jià)為1: 1280,置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0073]5、培養(yǎng)液的制備:向粉劑1640中加入蒸餾水配制成2 %的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的濃度為3%，再加入青鏈霉素，使1640溶液中青鏈霉素達(dá)1000單位/毫升。
[0074]6、將豬白細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)液中，使每毫升培養(yǎng)液中含約1X 17個(gè)豬白細(xì)胞，然后向每5000暈升培養(yǎng)液中加入豬血清350暈升,再加入啟動(dòng)干擾素，使每暈升培養(yǎng)液中含干擾素抗病毒活性150單位，最后加入仙臺(tái)病毒病毒液，每5000毫升培養(yǎng)液中加入病毒液400毫升。
[0075]7、將上述混合液置于水浴攪拌裝置中，以60-80轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)14小時(shí)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時(shí)后，用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值
7.4，誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值7.4，在誘導(dǎo)培養(yǎng)開(kāi)始的第8小時(shí)，5分鐘通入無(wú)菌氧0.2升，每隔2小時(shí)通一次無(wú)菌氧，連續(xù)5次。
[0076]8、將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)后的液體于4°C，3000轉(zhuǎn)/分無(wú)菌條件下離心10分鐘，收集含干擾素的上清液，用甲醛溶液滅活病毒，上清液中甲醛的終濃度為1%。，然后置于-20°C凍存。
[0077]9、從-20°C解凍后，離心取上清，無(wú)菌條件下先用澄清濾器澄清，然后用除菌濾器除菌，即得豬白細(xì)胞干擾素原液，于4°C保存。
[0078]步驟二、保護(hù)劑的制備
[0079]將蔗糖和脫脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脫脂牛奶的濃度分別為0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目紗網(wǎng)過(guò)濾，濾液于100°C蒸汽滅菌45min,即得保護(hù)劑。
[0080]步驟三、豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑的制備
[0081]將上述制備的豬白細(xì)胞干擾素原液和保護(hù)劑按20:3的體積比混合后凍干，即得豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑，其中水份含量〈4 %。
[0082]凍干操作步驟同實(shí)施例1。
[0083]將上述制備的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑配制成注射劑后，每毫升注射劑中干擾素的效價(jià)約20000單位，4-8°C貯存有效期為30個(gè)月。
[0084]實(shí)施例1和2中制備的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑是一種廣譜抗病毒制劑，主治豬瘟、豬病毒性腹瀉、豬病毒性感冒等豬病毒性疾病，效果顯著，無(wú)毒副反應(yīng)。本品可與抗菌類藥物同時(shí)使用。
[0085]用法用量:凍干粉針劑配制成注射劑后，進(jìn)行肌肉注射，按豬體重用藥，每20公斤每天注射10000單位，每天注射一次，病重者加量使用，或遵醫(yī)囑，連續(xù)使用3-5天為一個(gè)療程。
[0086]實(shí)施例3田間控制治療試驗(yàn)和田間推廣治療試驗(yàn)
[0087]實(shí)施例1中制備的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑作為一種廣譜抗病毒藥物，對(duì)治療豬病毒性疾病療效顯著，共治療病毒性疾病病例9843例(表I)。
[0088]表I本發(fā)明的豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑治療豬病毒性疾病的療效
[0089]
療效例數(shù)治愈率

【權(quán)利要求】
1.豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑，其特征在于，所述凍干粉針劑是由豬白細(xì)胞干擾素原液和保護(hù)劑按20:4-3的體積比混合凍干制成； 其中，所述豬白細(xì)胞干擾素原液包括以下組成成分:豬白細(xì)胞懸液、豬血清、啟動(dòng)干擾素、仙臺(tái)病毒病毒液和培養(yǎng)液；其中，豬血清、仙臺(tái)病毒病毒液和培養(yǎng)液的體積比為.250-350: 350-400: 5000 ;豬白細(xì)胞懸液和啟動(dòng)干擾素是加入到培養(yǎng)液中的，每毫升培養(yǎng)液中含有4 X 17-1O X 17個(gè)豬白細(xì)胞，每毫升培養(yǎng)液中含有50-150單位的干擾素抗病毒活性； 所述豬白細(xì)胞懸液的制備方法為:無(wú)菌采集健康豬鮮血，于4°C 3000轉(zhuǎn)/分的無(wú)菌條件下離心20分鐘，吸取呈灰黃色的中間層白細(xì)胞至血漿瓶?jī)?nèi)，用0.85% NH4Cl處理兩次后離心，收集沉淀白細(xì)胞，用Hank' s液洗去殘余NH4Cl,用培養(yǎng)液將沉淀白細(xì)胞稀釋成懸液； 所述豬血清的制備方法為:無(wú)菌采集健康豬鮮血，自然析出，用0.2% CaCl2處理血漿，除去其中的纖維蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存?zhèn)溆茫? 所述啟動(dòng)干擾素的制備方法為:首次采用人白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素，以后各次選用前批次效價(jià)最高的豬白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素； 所述仙臺(tái)病毒病毒液的制備方法為:于36-38°C受精雞蛋孵化7-15天后，接種仙臺(tái)病毒，再孵化65-79小時(shí)后，收獲病毒液,該病毒液的血凝效價(jià)為1: 320-1280,置于-20°C保存?zhèn)溆茫? 所述培養(yǎng)液的制備方法為:向粉劑1640中加入蒸餾水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的濃度為3%，再加入青鏈霉素,使1640溶液中青鏈霉素達(dá)100-1000單位/暈升； 所述保護(hù)劑為蔗糖和脫脂牛奶溶于水制成的混合液，蔗糖和脫脂牛奶的濃度分別為.0.356kg/L 和 0.711kg/L。
2.權(quán)利要求1所述凍干粉針劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一、豬白細(xì)胞干擾素原液的制備 (1)豬白細(xì)胞懸液的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，于4°C3000轉(zhuǎn)/分的無(wú)菌條件下離心.20分鐘，吸取呈灰黃色的中間層白細(xì)胞至血漿瓶?jī)?nèi)，用0.85% NH4Cl處理兩次后離心，收集沉淀白細(xì)胞，用Hank' s液洗去殘余NH4Cl,用培養(yǎng)液將沉淀白細(xì)胞稀釋成懸液； (2)豬血清的制備:無(wú)菌采集健康豬鮮血，自然析出，用0.2% CaCl2處理血漿，除去其中的纖維蛋白，用澄清板K7板澄清，除菌板EKS板除菌，置于_20°C保存?zhèn)溆茫? (3)啟動(dòng)干擾素的制備:首次采用人白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素，以后各次選用前批次效價(jià)最高的豬白細(xì)胞干擾素作為啟動(dòng)干擾素； (4)仙臺(tái)病毒病毒液的制備:于36-38°C受精雞蛋孵化7-15天后，接種仙臺(tái)病毒，再孵化65-79小時(shí)后，收獲病毒液，該病毒液的血凝效價(jià)為1: 320-1280，置于-20°C保存?zhèn)溆茫? (5)培養(yǎng)液的制備:向粉劑1640中加入蒸餾水配制成1-2%的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液中谷氨酰胺的濃度為3%，再加入青鏈霉素，使1640溶液中青鏈霉素達(dá).100-1000單位/毫升； (6)將豬白細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)液中，使每毫升培養(yǎng)液中含4X 17-1O X 17個(gè)豬白細(xì)胞，然后向每5000暈升培養(yǎng)液中加入豬血清250-350暈升,再加入啟動(dòng)干擾素，使每暈升培養(yǎng)液中含干擾素抗病毒活性50-150單位，最后加入仙臺(tái)病毒病毒液，每5000毫升培養(yǎng)液中加入病毒液350-400暈升； (7)將上述混合液置于水浴攪拌裝置中，以60-80轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)14小時(shí)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時(shí)后，用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值.7.2-7.4，誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后，再用5% NaHCO3溶液調(diào)pH值7.2-7.4，在誘導(dǎo)培養(yǎng)開(kāi)始的第8小時(shí)，5分鐘內(nèi)通入無(wú)菌氧0.2升，每隔2小時(shí)通一次無(wú)菌氧，連續(xù)5次； (8)將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)后的液體于4°C，3000轉(zhuǎn)/分無(wú)菌條件下離心10-20分鐘，收集含干擾素的上清液，用甲醛溶液滅活病毒，上清液中甲醛的終濃度為1%。，然后置于-20°C凍存； (9)從-20°C解凍后，離心取上清，無(wú)菌條件下先用澄清濾器澄清，然后用除菌濾器除菌，即得豬白細(xì)胞干擾素原液，于4°C保存； 步驟二、保護(hù)劑的制備 將蔗糖和脫脂牛奶溶于注射用水配制成混合液，其中，蔗糖和脫脂牛奶的濃度分別為.0.356kg/L和0.711kg/L ;用200目紗網(wǎng)過(guò)濾，濾液于100°C蒸汽滅菌45min，即得保護(hù)劑； 步驟三、豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑的制備 將上述制備的豬白細(xì)胞干擾素原液和保護(hù)劑按20:4-3的體積比混合后凍干，即得豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針劑，其中水份含量〈4% ； 凍干操作步驟如下: 真空冷凍干燥箱預(yù)凍至箱內(nèi)溫度_40°C ±2°C，保溫210min，抽真空至前后箱壓力(10pa，真空度達(dá)99%以上； 升華:第一次升華溫度設(shè)為_(kāi)2°C，時(shí)間為1380min ； 第二次升華溫度設(shè)為28°C，時(shí)間為60min ； 第三次升華溫度設(shè)為_(kāi)35°C，時(shí)間為120min ； 第四次升華溫度設(shè)為48°C，時(shí)間為30min ； 保溫:最后保溫時(shí)間為240min，抽真空前壓力上升6.5-7.5pa時(shí)，保溫結(jié)束。
【文檔編號(hào)】A61K38/21GK104162149SQ201410367679
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】榮政 申請(qǐng)人:四川世紅生物技術(shù)有限公司