本發(fā)明涉及獸醫(yī)學領域，尤其動物疾病的治療，并且更具體地說，涉及通過投與由來自預先用包含抗原、輕質(zhì)礦物油及由可生物降解聚合物粒子組成的粒狀佐劑的乳化疫苗調(diào)配物免疫接種的母雞的蛋黃獲得的禽類來源的免疫球蛋白濃縮調(diào)配物預防或治療豬繁殖與呼吸綜合癥(prrs)、豬流行性腹瀉(ped)、對蝦白斑綜合癥、牛乳腺炎、豬胸膜肺炎放線桿菌(actinobacilluspleuropneumoniae)源性感染、家禽球蟲病及真菌毒素源性中毒。

背景技術：

動物健康是獲得健康和高質(zhì)量食品的關鍵一環(huán)。因此，防治疾病及使用其所有可用手段至關重要。疫苗接種是除農(nóng)場中日常使用的所有手段、作為生物安全措施以避免來自其它利用的病原體的進入的現(xiàn)有其它手段、衛(wèi)生標準應用及用于減少疾病在具有相同利用的動物間傳播的動物管理、嚴格的飼喂控制或為農(nóng)場動物建立舒適的環(huán)境外的另一方式。

盡管如此，迄今為止仍有疾病未得到適當控制。在這些疾病當中，我們發(fā)現(xiàn)由病毒引起的疾病，例如由豬繁殖與呼吸綜合癥引起的疾病，這是豬的一種嚴重疾病，并且在1987年于美國報道，而且隨后在許多其它歐洲國家得到鑒別。1991年，在荷蘭報道分離出致病物并命名為萊利斯塔病毒(lelystadvirus)，而且由于在豬中觀察到癥狀，故其稱為豬呼吸和/或流行性流產(chǎn)。

尚未得到控制的另一病毒性疾病是豬流行性腹瀉(ped)，這是一種豬專有的病毒性疾病，極具傳染性并且在大多數(shù)情況下其會導致死亡。此疾病影響消化系統(tǒng)并且乳豬在3到5天內(nèi)由于腹瀉和脫水而死亡。

另一疾病是由白斑綜合癥病毒(wssv)引起的疾病，這種病毒是對蝦的主要病原體并且在全世界范圍內(nèi)引起農(nóng)場行業(yè)的較大生產(chǎn)和收入損失。到目前為止，尚無用于防治所述感染的有效治療。

由牛冠狀病毒(coronavirus)和輪狀病毒(rotavirus)引起的疾病的治療也很重要。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)由細菌引起的疾病，例如牛乳腺炎，這種疾病引起乳腺及其分泌組織炎癥，由此減少產(chǎn)奶量并改變牛奶組成，甚至是其味道，而且還增加其正常細菌負荷。根據(jù)其持續(xù)時間，其可以分類為急性或慢性疾病。就其臨床表現(xiàn)來說，其可以是臨床或亞臨床的。此疾病對乳制品行業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。

還發(fā)現(xiàn)由胸膜肺炎放線桿菌引起的疾病，這種細菌引起豬呼吸病癥并且在全世界分布，早在50年前就為人所知，并且從1980年代起越來越多地出現(xiàn)，在飼育場較為常見。其主要引起豬胸膜肺炎，并且是直接涉及豬呼吸復合征的致病物。這是一種高傳播性疾病，傳染性極高并且在多數(shù)情況下導致從斷奶到宰殺的豬死亡。其引起纖維性胸膜炎并在30％-50％的豬中存在極具特征性的肋骨粘連，并且在急性事件中具有較高死亡率，而在慢性事件中存在增加的生長延遲。此外，已發(fā)現(xiàn)在中耳炎、關節(jié)炎及骨髓炎情形中涉及胸膜肺炎放線桿菌。

由大腸桿菌(e.coli)、沙門氏菌屬(salmonellaspp)及產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)引起的疾病的治療對于動物健康也至關重要。

此外，還存在球蟲病，這是一種由嚴格在細胞內(nèi)生活的艾美爾球蟲屬(eimeriaspp.)和等孢子球蟲屬(isosporaspp.)寄生蟲引起的傳染病。球蟲無所不在，而且其存在于全世界大部分奶牛設施中。這些寄生蟲可以感染多種動物，包括人類、家禽、反芻動物、豬、狗、貓及其它家畜，不過在大多數(shù)情況下，球蟲是特定種類。

此外，奶牛行業(yè)所面臨的其它健康問題是由單端孢霉烯引起的那些，單端孢霉烯是由若干鐮孢菌屬(fusarium)真菌，尤其是禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)和擬枝孢鐮孢菌(fusariumsporotrichioides)產(chǎn)生的毒素。其在農(nóng)作物中產(chǎn)生并且其通過受污染的成分進入食品中。經(jīng)證實，單端孢霉烯是組織刺激物并且其攝入主要與口腔損傷、皮炎及腸刺激有關。對于這些真菌毒素的主要生理反應是食欲不振。單端孢霉烯是影響免疫細胞反應，并且直接影響骨髓、脾、淋巴組織、胸腺及腸黏膜，使其中活躍分裂的細胞受損的較強抑制性真菌毒素。

對于所有以上疾病的預防性防治，基本上存在兩種防護形式。可以使其暴露于感染物來源的抗原以刺激保護性免疫反應，或可以向其投與從免疫個體獲得的預先形成的抗體。

第一種形式的防護是通過疫苗實現(xiàn)，所述疫苗可以屬于不同種類：活微生物、凍干的微生物或在油性乳液中的死亡的微生物，以及近來產(chǎn)生的克隆和重組疫苗。其各自在防護、免疫反應及防護作用持續(xù)時間方面具有優(yōu)點和缺點。不過，已發(fā)現(xiàn)在一些情況下，宿主中存在由疫苗病毒引起的非所需損傷(迪乍得i.r.(tizard,i.r.)1998.疫苗接種與疫苗：免疫獸醫(yī)學(vacunaciónyvacunasin:inmunologíaveterinaria.)第5版,麥克格勞-希爾(mc.graw-hill).第285-305頁)。

第二種形式的防護又稱被動免疫并且涉及將針對感染物的特異性抗體傳遞給宿主。

傳統(tǒng)上，在研究水平上，這些抗體主要是在哺乳動物中產(chǎn)生，并且不常在家禽中產(chǎn)生。常在哺乳動物中產(chǎn)生的抗體的類型是單克隆抗體和多克隆抗體，而在家禽中產(chǎn)生的是多克隆抗體(拉森(larsson)等人,1993.雞抗體：利用進化(chickenantibodies:takingadvantageofevolution.),家禽科學評述(areviewpoultrysci.)72:1807-1812)。

就家禽來說，家養(yǎng)原雞(gallusgallusdomesticus)物種(公雞和母雞)是以較易使用的方式并且以非常確定的方式獲得抗體的唯一物種。存在于所述物種中的主要血清抗體是igg，不過igg以與哺乳動物igg通過胎盤轉(zhuǎn)移類似的方式運送至雞蛋中。

在雞蛋中，還在蛋黃中存在較高濃度的免疫球蛋白y(igy)，不過在蛋清中也存在少量igy。甚至還發(fā)現(xiàn)蛋黃中igy的量高于母雞血清中的量(拉森等人,1993.雞抗體：利用進化,家禽科學評述,72:1807-1212)。

為了解母雞產(chǎn)生的抗體的量，將能夠注意到，產(chǎn)蛋母雞每周產(chǎn)下大約5至6個蛋，其中蛋黃體積是約15ml，因此，在一周內(nèi)，母雞可以產(chǎn)生的蛋黃抗體相當于90至100ml血清或180至200ml全血。當與經(jīng)免疫接種的兔每周提供的20ml全血相比較時，此使得清楚地了解蛋黃中所述抗體的高效生產(chǎn)率。顯然，如果使用較大動物，例如馬或母牛，則血清和抗體的量將高于雞蛋中的量，但此程序很昂貴，而且給動物帶來較大痛苦。

在蛋黃抗體的優(yōu)點中，存在：

1.其不結(jié)合補體。

2.其不結(jié)合至金黃色葡萄球菌a蛋白。

3.其不與類風濕因子反應。

4.由于與哺乳動物抗體存在系統(tǒng)發(fā)育學差異，故igy不與哺乳動物抗體顯示交叉反應性。

5.低生產(chǎn)成本。

近年來，蛋黃抗體(免疫球蛋白)已經(jīng)被用作診斷和治療工具(施密特(schmidt)等人，1989)。因此，利用與哺乳動物抗體的系統(tǒng)發(fā)育學差異，ig當用于免疫診斷中時顯示出若干優(yōu)勢。舉例來說，已使用蛋黃ig，借助于elisa、免疫擴散、免疫熒光法及補體固定技術檢測若干病毒。由于其等電點低于人類ig，故其已被用于電泳分析以定量若干動物血清中的免疫球蛋白(奧奇d.(altschuh,d.)等人,1984.使用來自免疫接種的雞的蛋黃抗體通過火箭免疫電泳法測定血清中igg和igm水平(determinationofiggandigmlevelsinserumbyrocketimmunoelectrophoresisusingyolkantibodiesfromimmunizedchickens.),免疫方法雜志(j.immunolog.methods).69:1-7；拉森a.(larsson,a.)等人,1988.雞抗體：在膠乳凝集測試中避免由類風濕因子引起的假陽性的工具(chickenantibodies:atooltoavoidfalsepositiveresultsbyrheumatoidfactorinlatexfixationtests.),免疫方法雜志,108:205-208；拉森a.等人,1992.雞抗體：在elisa中避免補體活化的干擾的工具(chickenantibodies:atooltoavoidinterferencebycomplementactivationinelisa.),免疫方法雜志,156:79-83.；拉森等人,1993.雞抗體：利用進化(chickenantibodies:takingadvantageofevolution.),家禽科學評述,72:1807-1812；斯查特r.(schade,r.)等人,1996.禽類(蛋黃)抗體的產(chǎn)生：igy(theproductionofavian(eggyolk)antibodies:igy.)atla.24:925-934)。

就治療應用來說，igy已經(jīng)在不同科學領域中用作免疫療法，例如經(jīng)口投與蛋黃免疫球蛋白預防由輪狀病毒引起的小鼠、牛科動物及豬等的感染(池森y.(ikemori,y.)等人,1992,通過投與來自用1<99-pillated產(chǎn)腸毒大腸桿菌免疫接種的母雞的蛋黃來保護新生牛犢免受致死性腸型大腸桿菌癥影響(protectionofneonatalcalvesagainstfatalentericcolibacillosisbyadministrationofeggyolkpowderfromhensimmunizedwith1<99-pillatedenterotoxigenicescherichiacoli.),美國獸醫(yī)研究雜志(am.j.vet.res.)53:2005-2008；黑木m.(kuroki,m.)等人,1994.利用來自雞蛋黃的特異性免疫球蛋白針對牛輪狀病毒對牛犢進行被動保護(passiveprotectionagainstbovinerotavirusincalvesbyspecificimmunoglobulinsfromchickeneggyolk.),病毒學文獻(arch.virol.)138:143-148；馬奎特r.(marquart,r.)1998.用于小豬的載有抗體的禽蛋：防止小豬發(fā)生腹瀉(antibody-loadedeggsforpiglets:preventionofbabypigsfromdiarrhea.),第二屆國際禽蛋營養(yǎng)和新興禽蛋技術論壇文摘(proc.2^ndinternationalsymposiumoneggnutritionandnewlyemergingovo-technologies.),加拿大亞伯達省(alberta,canada))。

甚至蛋黃igy免疫球蛋白已經(jīng)被用作針對蛇和蝎子的抗蛇毒血清，其可以被注射用于中和毒素，同時沒有在馬中制備的抗蛇毒血清中所發(fā)現(xiàn)的常見過敏性反應的風險(拉森等人,1993.雞抗體：利用進化,家禽科學評述,72:1807-1812)。另一項應用是預防人類中由變形鏈球菌(streptococcusmutans)引起的蛀牙(哈塔h.(hatta,h.)等人,1997.針對人類中牙菌斑形成進行被動免疫接種：含變形鏈球菌特異性蛋黃抗體(igy)的漱口水的作用(passiveimmunizationagainstdentalplaqueformationinhumans:effectofamouthrinsecontainingeggyolkantibodies(igy)specifictostreptococcusmutans.),齲齒研究(caries.res.)31:268-274)。

就上述動物疾病來說，由于這些疾病的蔓延和經(jīng)濟影響，已經(jīng)隨時間開發(fā)出若干防治和預防措施。在對抗這些疾病的策略中，發(fā)現(xiàn)了滅活疫苗和活病毒疫苗。不過，這些策略都不是100％有效的。

在rna病毒，例如prrs病毒或ped病毒的特定情況下，防治方法的缺乏在很大程度上歸于其高突變指數(shù)。這是rna病毒中由rna聚合酶缺乏校正活性引起的常見特征。因此，這一失敗以及病毒快速復制動力學增加了突變的風險和準種的出現(xiàn)(馬雷特帕辛格巴爾(manreetpalsinghbrar)、史莽(mangshi)、雷蒙德金-?；?raymondkin-hihui)及弗雷德里克辛-常(frederickchi-ching)(2014),通過深度測序揭示的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(prrsv)分離株的leungmail基因組進化情況(leungmailgenomicevolutionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(prrsv)isolatesrevealeddeepsequencing.)plosone)。據(jù)報道，prrs病毒的遺傳變異在0.48％與1.32％之間(默托m.(murtaughm.),(2012)測序infprrsv防治計劃的應用和解釋(useandinterpretationofsequencinginfprrsvcontrolprograms.),艾倫d.李曼養(yǎng)豬大會(allend.lemanswaineconference.),獸醫(yī)繼續(xù)教育(veterinarycontinuingeducation))。prrs病毒的這些特征解釋了由疫苗獲得的不當保護的原因。

用于預防由這些病毒引起的疾病的策略之一是自體疫苗(autovaccine)，這表明疫苗的開發(fā)不僅要由國家，而且還要由地區(qū)進行，相反地，通過這些方式將不足以進行預防。

還觀察到，在引起prrs的病毒的情況下，使用來源于哺乳動物血清的免疫球蛋白中和所述病毒(is5,489,805)。這些結(jié)果教示，免疫球蛋白是治療arn病毒的替代方案。不過，此替代方案的缺點在于，由此獲得的抗體是無活力的。

應用自蛋黃獲得的免疫球蛋白(igy)已經(jīng)被用于若干動物以及人類健康和預防應用。秋田和中井進行的研究(秋田e.(akita,e.),中井s.(nakai,s.)(2000).禽蛋營養(yǎng)及生物技術(eggnutritionandbiotechnology),國際農(nóng)業(yè)與生物科學中心(cabinternational),紐約,第301頁)顯示，igy針對感染物的防護作用主要歸于其防止毒素定殖或中和毒素的能力。

因此，本發(fā)明的一個目的是獲得禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物，其有效并且安全地針對感染動物的若干感染物，包括例如prrs病毒、豬流行性腹瀉(ped)病毒、白斑綜合癥桿狀病毒復合體、引起牛乳腺炎的細菌、胸膜肺炎放線桿菌及球蟲病，以及由單端孢霉烯引起的中毒，而且其實行可以對疫苗接種程序相關費用的明顯降低帶來直接影響，并且更重要的是，將大幅降低與所述疾病有關的生產(chǎn)損失。

技術實現(xiàn)要素：

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，以實驗方式評估包含由來自預先用乳化疫苗調(diào)配物免疫接種的母雞的蛋黃獲得的濃縮igy免疫球蛋白的調(diào)配物特異性用于中和prrs病毒的能力，所述乳化疫苗調(diào)配物包含來源于一或多個prrs病毒株的抗原、輕質(zhì)礦物油及由可生物降解聚合物粒子、微米粒子或納米粒子組成的粒狀佐劑。

本申請案的發(fā)明人成功地達成本發(fā)明的目的并且意外地發(fā)現(xiàn)，利用小心選擇的prrs病毒的一或多個不同病毒株的抗原，可以產(chǎn)生預期的針對所述病毒的其它病毒株的交叉防護，并且誘導產(chǎn)生能夠中和在區(qū)域循環(huán)的較多prrs病毒的免疫球蛋白。另外，乳化疫苗調(diào)配物必須包括輕質(zhì)礦物油，例如瑪卡(marcol)，及由可生物降解聚合物粒子、微米粒子或納米粒子組成的粒狀佐劑，以便增進疫苗接種，優(yōu)選使用包含β-(1-4)d-葡糖胺(去乙?；瘑卧?和n-乙?；?d-葡糖胺(乙?；瘑卧?的隨機分配鏈的線性多糖，例如殼聚糖。

利用由此制備的乳化疫苗調(diào)配物，對產(chǎn)蛋家禽進行免疫接種以經(jīng)由蛋黃獲得中和感染物或毒素的igy免疫球蛋白，所述免疫球蛋白在提取、脫脂及濃縮方法之后，在極少量使用情況下，最終獲得能夠達成高達約100％的出人意料的防護作用，并且調(diào)整受感染農(nóng)場中的s/p水平的所述igy免疫球蛋白濃縮調(diào)配物。

本發(fā)明具有使獸群、畜群或群體(passel)穩(wěn)定，由此減少感染物循環(huán)的額外優(yōu)點。另外，使用本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物作為一個療程，使懷孕亞群的產(chǎn)生減少，并且延遲育肥動物在斷奶時的血清轉(zhuǎn)化。

迄今為止，所評估的免疫球蛋白都是哺乳動物血清來源的，并且其僅在用與其疫苗接種相同的病毒株攻擊的實驗模型中得到測試。這意味著，與本發(fā)明不同，現(xiàn)有技術的疫苗僅針對同源物防護作用進行測試(wo02/067985)。

另外，包含濃縮igy免疫球蛋白的本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物可以用于動物的任何繁殖階段，而不存在副作用或不希望的作用。

本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物是高度濃縮的并且針對感染物或毒素的較高攻擊進行防護。針對攻擊存在10⁷(10,000,000)的證據(jù)，其遠高于現(xiàn)有技術(wo2007/061281a2)所知的情形。

此外，利用本發(fā)明的方法，實現(xiàn)中和在區(qū)域循環(huán)的感染物的免疫球蛋白(igy)的濃度，其方式為所述濃度使得每劑僅應用1ml或3ml，而現(xiàn)有技術的疫苗和產(chǎn)品應用多達5ml并且甚至是多達10ml，并且甚至超過10ml(wo2007/061281a2)。

減小施用體積在若干方面都是有益的。第一個原因是易于應用，第二個原因是降低生產(chǎn)成本及第三個原因是向不同區(qū)域的運輸使用較小空間。

可以實現(xiàn)1ml或至多3ml的劑量歸功于本發(fā)明的濃縮免疫球蛋白(igy)調(diào)配物，顯然取決于嚴重程度，遵循免疫接種時程并且即使在其本身不是疫苗時，其仍可以如此使用并且防治受感染動物。本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物屬于被動免疫范圍，因為其含有中和感染物或毒素的免疫球蛋白。

附圖說明

圖1顯示從用不同疫苗免疫接種的家禽收集的不同禽蛋樣品的mnt滴定結(jié)果。第a組接種用礦物油制備的2種疫苗，其各自含有3個prrs病毒株并且每月交替地施用。第b組接種用礦物油和殼聚糖制備的1種疫苗，其含有prrs病毒的6個不同病毒株并且每月施用。第c組接種用瑪卡和殼聚糖制備的一種疫苗，其含有prrs病毒的6個不同病毒株并且每月施用。

這些結(jié)果指示，由含有六個prrs病毒株并且使用含瑪卡和殼聚糖的調(diào)配物的疫苗產(chǎn)生的igy抗體效價誘導最高量的針對豬繁殖與呼吸綜合癥的抗體。

圖2顯示在蛋黃中使用三類疫苗調(diào)配物的igy抗體平均效價。第a組接種用礦物油制備的2種疫苗，其各自含有3個prrs病毒株并且每月交替地施用。第b組接種用礦物油和殼聚糖制備的1種疫苗，其含有prrs病毒的6個不同病毒株并且每月施用。第c組接種用瑪卡和殼聚糖制備的一種疫苗，其含有prrs病毒的6個不同病毒株并且每月施用。

圖3顯示在應用濃縮方法之后免疫球蛋白的效價增加。提取蛋黃免疫球蛋白，通過mnt方法對一份進行定量，并且其余部分經(jīng)歷濃縮方法。第a組接種用礦物油制備的2種疫苗，其各自含有3個prrs病毒株并且每月交替地施用。第b組接種用礦物油和殼聚糖制備的1種疫苗，其含有prrs病毒的6個不同病毒株并且每月施用。第c組接種用瑪卡和殼聚糖制備的一種疫苗，其含有prrs病毒的5個不同病毒株并且每月施用。

圖4顯示在接受所述濃縮調(diào)配物之后繁殖獸群的雌性體內(nèi)抗體水平逐漸降低。

圖5顯示從第3周到第26周的死亡率監(jiān)測情況。用本發(fā)明的禽類來源的igy免疫球蛋白濃縮調(diào)配物治療的組突出顯示于較深藍色的框中(第7至16組)。

圖6顯示每一評估組的死亡率百分比的表格，其中突出顯示用本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物治療的組。

具體實施方式

對產(chǎn)蛋家禽免疫接種以獲得中和感染物或毒素的免疫球蛋白(igy)

制造一種乳化疫苗，其包含用于產(chǎn)生中和抗體的抗原，所述中和抗體不僅針對確定的感染物或毒素的單一株系，而且還針對在區(qū)域(流行病監(jiān)測)循環(huán)的若干株系或毒素。

以上涉及arn病毒情形，因為研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)病毒并非所有的病毒株都可以用來自特定株系的抗原產(chǎn)生的抗體中和。相同情形見于針對病毒的疫苗，因為當用異源株系進行接種時，防護作用是部分作用。

就微生物來說，株系是通過交叉mnt(微量中和)測試選擇。此測試在于測試使用含確定株系的疫苗獲得的免疫球蛋白針對新分離的感染物的中和水平。在實驗室研究中，已確定如果新分離株在mnt中的效價低于1:160，則認為所述株系是將包括在新疫苗中的候選物。因此，迄今為止，疫苗含有賦予針對在墨西哥循環(huán)的感染物的株系的較寬中和譜的一些株系。然而，此并不限制本發(fā)明并且不應理解為本發(fā)明是指僅包括選定株系的疫苗，因為隨著在區(qū)域中監(jiān)測到新株系循環(huán)，感染物的株系可以變化，其可以近期包括在用于維持在動物中的防護作用的疫苗中。本發(fā)明的中和譜還可以加寬并且適于針對在其它國家或其它地區(qū)中循環(huán)的感染物的其它株系。

感染物的株系可以是從患病動物的血清或組織獲得的區(qū)域分離株。如以上所引用，選擇是基于在不同分離株與由選定株系產(chǎn)生的產(chǎn)物中所含ig之間進行的交叉微量中和測試。

就prrs病毒來說，細胞系marc-145可以復制并且工作種子進行不超過五次傳代，以避免衰減。選定的抗原用0.01％福馬林(formalin)或利用現(xiàn)有技術中描述的任何其它方法滅活。在實驗室中，已確定抗原混合物必須各自具有最小die50％10⁴/ml效價。

鑒于上述，用于對家禽免疫接種的乳化疫苗調(diào)配物另外包含來自一或多個小心選擇的株系的抗原、輕質(zhì)礦物油以及由可生物降解聚合物粒子、微米粒子或納米粒子組成的粒狀佐劑以便增進接種，尤其優(yōu)選包含β-(1-4)d-葡糖胺(去乙?；瘑卧?和n-乙?；?d-葡糖胺(乙?；瘑卧?的隨機分配鏈的線性多糖，例如殼聚糖。

油包水型疫苗接種的調(diào)配物可以包含約50％至70％并且優(yōu)選約60％至67％的瑪卡、約20％至40％并且優(yōu)選約28％至35％的含prrs病毒抗原的水；約5％至15％的基于以上解釋的標準選擇的prrs病毒的每一病毒株、約2％至5％的聚氧乙烯單油酸酯脫水山梨糖醇(吐溫(tween)80)、約2％至8％的脫水山梨糖醇單油酸酯脫水山梨糖醇(斯潘(span)80)，以及佐劑，例如包含β-(1-4)d-葡糖胺(去乙酰化單元)和n-乙?；?d-葡糖胺(乙酰化單元)的隨機分配鏈的線性多糖，尤其4％至6％的殼聚糖。為了準備疫苗接種，在攪拌系統(tǒng)下，經(jīng)1至5分鐘逐一添加各組分，殼聚糖在結(jié)束時添加。

從8周齡開始并且直至第60周齡，每月一次將0.5ml疫苗皮下施用至無病原體的產(chǎn)蛋家禽，由此最終從蛋黃中獲得中和感染物或毒素的免疫球蛋白(igy)的調(diào)配物。

確切地說，通過微量中和(mnt)評估從經(jīng)過疫苗接種的畜群收集的蛋黃樣品中針對感染物每一株系的抗體水平。最小血清效價必須符合1:160標準。

在免疫接種之后，從經(jīng)免疫接種的家禽收集禽蛋，并且使其經(jīng)歷提取、脫脂及蛋黃中免疫球蛋白濃縮的方法。

提取、脫脂及免疫球蛋白igy濃縮方法

執(zhí)行以下步驟以從蛋黃提取和濃縮中和感染物或毒素的免疫球蛋白igy。

用0.01％疊氮化鈉以1:4或1:8稀釋蛋黃(不含蛋清)并且在冷藏下儲存至少整天，優(yōu)選12至24小時。接著，分離上清液并且以每100ml水0.25ml的比率添加1至15％的鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(hpmcp)。使其靜置至少24小時。分離在溶液上部部分中形成的脂質(zhì)層并過濾水溶液部分，接著以5-30％p/v比率添加peg，優(yōu)選peg8000，混合并使其靜置至少4小時，但優(yōu)選使其在4℃靜置過夜。接著，對其離心20至30分鐘并去除上清液。用體積相當于初始體積的10％的pbs1x或tris緩沖液溶解所得小塊。

利用本發(fā)明的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物的療法

通過由預先用乳化疫苗免疫接種的母雞的蛋黃獲得的中和感染物或毒素的igy免疫球蛋白的提取、脫脂及濃縮方法產(chǎn)生的調(diào)配物可以包含：約0.8％至5％本發(fā)明的針對病原體或毒素的濃縮igy免疫球蛋白，優(yōu)選約1％的濃縮免疫球蛋白；約80％至90％的水；及約0.001％至0.03％的防腐劑，所述乳化疫苗包含抗原、輕質(zhì)礦物油及由可生物降解聚合物粒子組成的粒狀佐劑，例如包含β-(1-4)d-葡糖胺(去乙?；瘑卧?和n-乙?；?d-葡糖胺(乙酰化單元)的隨機分配鏈的線性多糖(殼聚糖)。本發(fā)明的濃縮調(diào)配物的治療劑量可以是1ml并且至多3ml，由此達成本發(fā)明的針對區(qū)域感染物或毒素種類的中和作用，出乎意料地向動物提供高達100％的防護，而且還調(diào)整受感染農(nóng)場中的s/p水平，如下文所示。

鑒于上述，在第一實施例中，本發(fā)明是指一種乳化疫苗調(diào)配物，其包含抗原；輕質(zhì)礦物油，優(yōu)選瑪卡；及由可生物降解聚合物粒子組成的粒狀佐劑，例如包含β-(1-4)d-葡糖胺(去乙酰化單元)和n-乙?；?d-葡糖胺(乙?；瘑卧?的隨機分配鏈的線性多糖，優(yōu)選殼聚糖。另外，本發(fā)明的疫苗調(diào)配物包含一或多種乳化劑，例如聚氧乙烯單油酸酯脫水山梨糖醇(吐溫80)、脫水山梨糖醇單油酸酯脫水山梨糖醇(斯潘80)或其混合物。

抗原可以來自一或多種感染物或毒素，例如病毒、細菌或原蟲，更具體地說，來自prrs病毒、ped病毒、白斑綜合癥桿狀病毒復合體病毒、輪狀病毒屬或冠狀病毒屬，并且更具體地說，來自具有選自由seq.id.no:1、seq.id.no:2、seq.id.no:3、seq.id.no:4、seq.id.no:5、seq.id.no:6及seq.id.no:7組成的群組的orf5gen核苷酸序列的prrs病毒，以及來自豬流行性腹瀉(ped)病毒的一或多個不同株系。另外，抗原還可以來自一或多種細菌，例如沙門氏菌屬，來自選自由以下組成的群組的細菌：金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)、大腸桿菌、化膿棒狀桿菌(corynebacteriumpyogenes)及牛支原體，以及胸膜肺炎放線桿菌?？乖梢粤硗鈦碜赃x自由以下組成的群組的一或多種原蟲：柔嫩艾美爾球蟲(eimeriatenella)、堆型艾美爾球蟲(eimeriaacervulina)及巨型艾美爾球蟲(eimeriamaxima)，或來自由真菌產(chǎn)生的毒素，例如單端孢霉烯，并且更具體地說，來自4-去氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)。此外，抗原可以來自一或多種病毒、一或多種細菌或一或多種原蟲的一或多個不同株系，例如來自來源于大腸桿菌、沙門氏菌屬、產(chǎn)氣莢膜梭菌、輪狀病毒屬及冠狀病毒屬的抗原。確切地說，抗原還可以來自由大腸桿菌、輪狀病毒屬及冠狀病毒屬組成的群組。

本發(fā)明的乳化疫苗調(diào)配物可以含有通過使用以本發(fā)明疫苗獲得的免疫球蛋白池進行交叉微量中和所評估，具有低于1:160的血清效價而選擇的病毒株。

同樣，本發(fā)明的乳化疫苗調(diào)配物可以含有效價高于die50％10⁴/ml的抗原混合物。

根據(jù)一或多種選定的抗原，本發(fā)明還指乳化疫苗調(diào)配物的用途，其用于制備分別可用于治療豬繁殖與呼吸綜合癥(prrs)、治療豬流行性腹瀉(ped)、治療對蝦白斑綜合癥、治療牛乳腺炎、治療由胸膜肺炎放線桿菌引起的豬感染、治療家禽球蟲病、治療由單端孢霉烯引起的中毒的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物組合物，具體地說，其中所述單端孢霉烯是4-去氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)，其中乳化疫苗調(diào)配物可皮下投與產(chǎn)蛋家禽。

在另一個實施例中，本發(fā)明是指一種用于提取和濃縮來自預先用本發(fā)明的疫苗調(diào)配物免疫接種的母雞的蛋黃的免疫球蛋白的方法，其特征在于以下步驟：

a)用0.01％疊氮化鈉以1:4或1:8稀釋所述蛋黃(無蛋清)并在冷藏下儲存至少24小時。

b)分離上清液并以每100ml蛋黃0.25ml的比率添加1至15％的鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(hpmcp)。使其靜置至少24小時。

c)從所述溶液分離在上部部分中形成的脂質(zhì)層并過濾水溶液部分。

d)以5-30％p/v比率添加peg，優(yōu)選pet8000，混合并使其在4℃靜置至少4至12小時。

e)對其離心20至30分鐘并去除上清液；

f)用體積相當于初始體積的10％的pbs1x或tris緩沖液溶解所得小塊，ph值維持在7。

在另一個實施例中，本發(fā)明旨在一種禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物，其通過對來源于預先用本發(fā)明的乳化疫苗超免疫的母雞的蛋黃進行提取、脫脂及免疫球蛋白濃縮而獲得。所述本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物可進一步包含約70％至85％的水和/或約0.001％至0.03％的防腐劑。具體地說，所述濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物的特征在于，因為其包含0.8％至5％的中和引起prrs的病毒的濃縮igy免疫球蛋白。

另外，取決于一或多種選定的抗原，本發(fā)明還指本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物的用途，其用于制備供治療豬繁殖與呼吸綜合癥(prrs)、豬流行性腹瀉(ped)、對蝦白斑綜合癥、牛乳腺炎、由胸膜肺炎放線桿菌引起的豬感染、家禽球蟲病、由單端孢霉烯引起的中毒，尤其是由例如4-去氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)等單端孢霉烯引起的中毒用的藥物，其中在適當時，所述藥物可以不經(jīng)腸投與，優(yōu)選肌肉內(nèi)投與或與食物一起經(jīng)口投與。

以下實例顯示在豬中施用本發(fā)明的濃縮調(diào)配物的結(jié)果。不過，所述實例只是出于說明目的提供，并且不應視為限制。

實例1

使用不含瑪卡和殼聚糖的調(diào)配物制備兩種疫苗，其各自含有prrs病毒的三個病毒株。每月以交替方式將這些疫苗施用給家禽；這意味著，一個月投與一種疫苗，而下一個月投與另一種疫苗，諸如此類。

在免疫接種之后，從經(jīng)過免疫接種的家禽收集禽蛋，并如以上所描述，進行蛋黃中的免疫球蛋白提取方法。

作為以上免疫接種的結(jié)果，獲得具有中和prrs病毒的igy免疫球蛋白的調(diào)配物，但濃度較低。

圖1顯示此實驗的結(jié)果(第a組)，其中可以觀察到先前獲得的調(diào)配物中的中和prrs病毒的igy免疫球蛋白的性能較低，不能對罹患豬繁殖與呼吸綜合癥的豬進行有效治療，而且需要使用高于5ml的體積并且保持10⁴效價。另外，由于要處理兩種疫苗，故此實驗很復雜，而且麻煩。

實例2

使用不含瑪卡和殼聚糖的調(diào)配物制備含有prrs病毒的六個不同株系的一種疫苗，按每月免疫接種時程投與家禽。

在免疫接種之后，從經(jīng)過免疫接種的家禽收集禽蛋，并如以上所描述，進行蛋黃中免疫球蛋白的提取程序。

作為以上免疫接種的結(jié)果，性能相較于實例1的實驗有所改善，但仍不足夠(參見圖1，第b組)。

由此實驗的結(jié)果得知，igy免疫球蛋白中和prrs病毒的性能不適于對罹患繁殖與呼吸綜合癥的豬進行有效治療。

實例3

再次，調(diào)配一種疫苗，但現(xiàn)使用瑪卡作為輕質(zhì)礦物油并且使用殼聚糖作為粒狀佐劑。此時，在一種單一疫苗中包括prrs病毒的6個株系的抗原。

在免疫接種之后，從經(jīng)過免疫接種的家禽收集禽蛋，并如以上所描述，進行蛋黃中免疫球蛋白的提取程序。

結(jié)果指示，抗體效價關于用實例2中的實驗的調(diào)配物所獲得的效價增加多達2倍(參見圖2，第c組)。

圖1和2顯示此實驗的結(jié)果，其中可注意到，當使用含瑪卡和殼聚糖的調(diào)配物時，igy免疫球蛋白中和prrs病毒的性能相應地增加，由此適于對罹患繁殖與呼吸綜合癥的豬進行有效治療。

實例4

在本實例中，對免疫球蛋白成品進行分析。如上所描述，對產(chǎn)蛋家禽進行免疫接種，收集經(jīng)免疫接種的家禽的禽蛋，并且蛋黃經(jīng)歷提取和免疫球蛋白濃縮程序。用于對黜群進行免疫接種的疫苗與實例1到3中使用的相同，但在此情形中，批次的規(guī)模增加至每群10,000個蛋。

結(jié)果指示，上述濃縮程序使抗體效價相對于不用所述程序所獲得的效價有所增加。濃度從1.6增加至2.1倍(圖3)。作為此實驗的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)igy免疫球蛋白中和prrs病毒的性能適合于使用達到防護作用的較低體積來對罹患繁殖與呼吸綜合癥的豬進行有效治療。

實例5

在繁殖獸群的雌性中施用免疫球蛋白(igy型)

通過評估從位于西墨西哥的具有500頭大母豬的充分開發(fā)的循環(huán)農(nóng)場隨機選擇的30頭大母豬的血清對針對prrs病毒的抗體的存在進行縱向監(jiān)測。此農(nóng)場產(chǎn)生的乳豬對prrs病毒呈陰性并且病毒經(jīng)由乳豬的生產(chǎn)生活進行污染。

每4個月并且在15天內(nèi)重復一次，通過肌肉內(nèi)施用1ml本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物來治療繁殖獸群。接著，在妊娠第70天和第85天每周施用。

兩月一次監(jiān)測傳種用大母豬以確定病毒活動。從起初選擇的30只動物取得血液樣品。使用elisa技術進行評估(idexx，prrsx3)，此技術是測量用濃縮igy治療的有效性的間接方式。試劑盒測量由豬響應于病毒血癥而產(chǎn)生的igg型抗體的水平。因此，如果豬受感染，則其將產(chǎn)生igg型抗體作為反應并且將獲得高于截止點的s/p值，但如果不存在病毒血癥，則試劑盒將得到低于截止點的s/p值。elisa的截止點是0.4s/p。

圖4顯示，當兩月一次進行監(jiān)測時，施用至獸群的治療使抗體水平逐漸降低，并因此顯示，prrs病毒已被施用的免疫球蛋白(igy型)中和，由此限制感染。值得注意的是，意外地，所述產(chǎn)物中和病毒的方式使得在6個月之后，不存在prrs病毒再感染的記錄。此顯示為記錄的陰性與陽性農(nóng)場生產(chǎn)率參數(shù)之間的顯著差異。

實例6

在乳豬中施用濃縮免疫球蛋白(igy)

本實例中顯示臨床上感染prrs病毒的乳豬中病毒血癥減輕的評估結(jié)果。乳豬在懷孕階段期間(前3周)不顯示病毒血癥。不過，在約6至8周齡時有病毒血癥臨床跡象。此通過實時pcr技術得到證實，其中產(chǎn)生5組病毒血癥動物血清；每一組包含5頭不同豬的血清(總計評估25頭豬)。如表中所示，病毒負荷達到在6.16×10⁵與2.24×10⁷之間的效價。

在確定病毒血癥之后，立即對其施用本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物治療。肌肉內(nèi)施用3ml劑量。為了評估治療功效，觀察臨床數(shù)據(jù)并且對豬體內(nèi)循環(huán)病毒的量進行定量。

在施用本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物10天之后的監(jiān)測結(jié)果顯示，100％樣品對血清中prrs病毒基因材料的存在呈陰性。

獲得的結(jié)果顯示，在種豬中施用免疫球蛋白時程防止病毒循環(huán)并且可以中和負荷是10⁷個病毒粒子/ml的斷奶乳豬的病毒血癥。

實例7

使用濃縮igy免疫球蛋白降低乳豬死亡率

將本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物施用至旨在育肥的斷奶的豬。在生產(chǎn)時間期間，記錄根據(jù)不同治療系統(tǒng)的死亡率。

研究農(nóng)場位于墨西哥中西部地區(qū)并且在其繁殖獸群中具有1100頭大母豬，而且每周產(chǎn)生500頭乳豬。所述農(nóng)場有prrs地方性感染前例，即使在已經(jīng)部署若干防治策略時。存在一種自更新(auto-replace)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)考慮每四個月引入大母豬。種豬包括每三個月施用針對prrs的改良型活病毒疫苗。

在本實例中，每周進行監(jiān)測并計算斷奶期(第3周至第9周)和育肥期(第10周至第26周)中的死亡率百分比。

比較兩種治療。一種基于活疫苗，而另一種利用本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物，另外，還考慮未處理的對照組。每種治療包含獨立評估的不同組；第01至06組對應于常規(guī)治療的乳豬(活疫苗)并且第07至16組是接受兩劑本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物的那些，而第17、18及19組未經(jīng)治療。

圖5顯示從第3周開始直至第26周時的死亡率監(jiān)測。用本發(fā)明的禽類來源的igy免疫球蛋白濃縮調(diào)配物治療的組突出顯示于較深藍色的框中(第07至16組)。

未處理組的平均死亡率百分比最高(25.06)，隨后是接收常規(guī)治療的組(平均21.2％)，并且最佳治療是本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物之一，其中獲得10.27％的平均死亡率百分比。這意味著，使用本發(fā)明的igy免疫球蛋白，使幾乎90％的經(jīng)治療動物存活，此表示通過疫苗接種方法所達到的結(jié)果的10％。

圖6顯示每一評估組的累積死亡率百分比的表格，其中突出顯示用本發(fā)明的禽類來源的濃縮調(diào)配物治療的組。

由使用濃縮igy型免疫球蛋白得到的結(jié)果顯示與prrs病毒有關的死亡率百分比適當降低。此外，注意到這些動物的健康狀況和生產(chǎn)率也得到改善，不同于接受所述疫苗的組。重要的是，注意到這是首次證實禽類免疫球蛋白在治療乳豬方面的用途。

這些結(jié)果極有意義，因為包含本發(fā)明的禽類來源的濃縮igy免疫球蛋白調(diào)配物的療程不僅降低死亡率百分比，而且其還提供獲得生產(chǎn)參數(shù)的其它改善的可能性。

因此，應了解，盡管此處已出于說明性目的描述本發(fā)明的具體實施例，但在不脫離本發(fā)明的性質(zhì)和范圍的情況可以進行修改。因此，除受到所附權利要求書的限制外，本發(fā)明不受限制。