本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)豬初乳中pedv特異性iga抗體的夾心elisa試劑盒。
背景技術(shù)：
：豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)引起的豬的一種急性腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征，病理變化主要表現(xiàn)在豬的空腸和回腸部分的腸絨毛的萎縮和脫落。pedv對(duì)豬的危害很大，各種年齡的豬均可發(fā)病，對(duì)哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，20日齡以內(nèi)仔豬死亡率達(dá)95％以上，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。仔豬出生時(shí)體內(nèi)無免疫球蛋白，出生后通過吮吸初乳的方式獲得母源抗體。初乳中含有大量的igg和較多的iga。igg的分子量較大，不容易穿過腸壁進(jìn)入腸腔，對(duì)胃酸和消化酶的抵抗力較差；而iga分子量較小，可以抵御胃酸和消化酶的消化，并且與腸黏膜有親和作用，所以初乳中iga是在腸道中發(fā)揮對(duì)仔豬的保護(hù)作用的主要成分。通過檢測(cè)免疫母豬分泌的初乳中抗pedv特異性iga抗體，對(duì)妊娠母豬流行性腹瀉疫苗免疫效果評(píng)價(jià)、哺乳仔豬免疫程序制定、流行狀態(tài)監(jiān)測(cè)均具有重要意義。目前使用較多的方法是測(cè)定初乳中pedv的中和抗體，但是初乳中不但含有iga抗體，還含有大量的抗pedv特異性igg抗體，干擾了pedv特異性iga抗體檢測(cè)的準(zhǔn)確性。現(xiàn)有技術(shù)中，還沒有能夠準(zhǔn)確檢測(cè)豬初乳中pedv特異性iga抗體的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種分泌抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株10a4、采用該細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體制備的檢測(cè)豬初乳中抗pedv特異性iga抗體的夾心elisa試劑盒，對(duì)豬初乳樣品進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的特異性、靈敏度和重復(fù)性。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種分泌抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株10a4，保藏號(hào)為：cctccno:c201779。本發(fā)明還提供所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗pedv單克隆抗體10a4’。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)豬初乳中抗pedv特異性iga抗體的夾心elisa試劑盒，其包括檢測(cè)板，所述檢測(cè)板是采用所述抗pedv單克隆抗體10a4’包被的酶標(biāo)板。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述抗pedv單克隆抗體10a4’的包被濃度為1-3μg/ml。在本發(fā)明中，所述試劑盒還包括將106.0tcid50/ml的pedv病毒液滅活后得到的pedv夾心抗原。在本發(fā)明中，所述試劑盒的酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬iga抗體。在本發(fā)明中，所述試劑盒還包括陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、樣品稀釋液、洗滌液、tmb底物顯色液a、b液和終止液；所述陽性對(duì)照是從免疫兩次tgev和pedv二聯(lián)滅活苗的母豬初乳中分離的乳清；所述陰性對(duì)照是從未接種pedv疫苗的spf級(jí)豬初乳中分離的乳清；所述樣品稀釋液是含有1％bsa的pbst緩沖液；所述洗滌液為pbst緩沖液；所述終止液為2m的硫酸水溶液。最后，本發(fā)明提供采用所述試劑盒檢測(cè)豬初乳中抗pedv特異性iga抗體的方法，包括如下步驟：(1)夾心抗原孵育：在檢測(cè)板的每個(gè)孔中加入pedv夾心抗原，在37℃孵育1h，洗滌；(2)加入待檢樣品：將待檢樣品用樣品稀釋液稀釋40倍，以100μl/孔加入待檢樣品反應(yīng)孔，陰性對(duì)照孔內(nèi)加入陰性對(duì)照，陽性對(duì)照孔內(nèi)加入陽性對(duì)照，37℃反應(yīng)30min，洗滌；(3)加入酶標(biāo)二抗：每個(gè)孔中均加入100μl酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30min，洗滌；(4)顯色與終止：將tmb底物顯色液a、b液等體積混合，每個(gè)孔中均加入100μltmb底物顯色液a、b液的等體積混合液，37℃避光反應(yīng)10min，隨后每個(gè)孔中均加入100μl終止液，終止反應(yīng)；(5)判定：讀取終止反應(yīng)后的檢測(cè)板各孔的od450值，按照如下方法判定結(jié)果：如果陰性對(duì)照孔的od450值<0.2、且陽性對(duì)照孔的od450值>0.8，那么當(dāng)待樣品反應(yīng)孔o(hù)d450值≥0.250為陽性，當(dāng)待檢樣品反應(yīng)孔o(hù)d450值<0.250為陰性。有益效果：pedv疫苗免疫妊娠母豬，可以在初乳中產(chǎn)生抗pedv特異性iga抗體，并通過哺乳進(jìn)入哺乳仔豬腸道中發(fā)揮中和pedv病毒作用，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)免疫。因此檢測(cè)豬初乳中抗pedv特異性iga抗體，對(duì)于評(píng)價(jià)pedv疫苗免疫母豬效果、預(yù)測(cè)初乳對(duì)于哺乳期仔豬保護(hù)力有重要意義。富含抗pedv特異性iga抗體的初乳，可用于新生仔豬的pedv被動(dòng)免疫。本發(fā)明篩選到了具有較高特異性、較高親和力的抗pedv單克隆抗體，采用該單克隆抗體制備的試劑盒檢測(cè)豬初乳，具有較高的靈敏度、特異性和重復(fù)性，假陽性率低。附圖說明圖1.sds-page分析純化后的抗pedv單克隆抗體10a4’，其中m：蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣；1-4：純化后的單隆抗體10a4’。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)例一pedv病毒液的制備在t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將非洲綠猴腎細(xì)胞(vero細(xì)胞)用10ml含10％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)液(購自gibco)于5％co2、37℃條件下培養(yǎng)48h，使細(xì)胞融合度達(dá)到90％；棄掉上清，用無血清的dmem培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，與pedvcv777株共孵育1h；加入等體積含4％新生牛血清的dmem培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待80％以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，將細(xì)胞于-20℃與室溫條件下反復(fù)凍融三次，8000rpm高速離心30分鐘后取上清，得到pedvcv777株病毒液。該病毒液測(cè)定tcid50后，加入終濃度為0.02％(w/w)的β-丙內(nèi)酯于4℃滅活病毒24h，再于37℃孵育2h水解β-丙內(nèi)酯，得到滅活的pedvcv777株病毒液。實(shí)例二抗pedv單克隆抗體的制備及純化1.免疫原制備(1)病毒粗純化：將實(shí)例一制備的pedvcv777株病毒液，以4℃、100000g超速離心2h，將沉淀用少量重懸液(ph7.2、10mm的pbs緩沖液中添加有終濃度為0.15m的nacl和10mm的edta)重懸24h，即可獲得粗純化病毒。(2)蔗糖密度梯度離心純化病毒：用帶有長針頭的10ml注射器依次將5ml濃度為30％、45％、60％(w/v)的蔗糖溶液緩緩加入離心管底部，制成蔗糖梯度溶液。將3ml粗純化病毒緩緩加在頂部，采用100000g水平離心4h。用注射器將30％與45％蔗糖溶液之間的白色亮帶取出作為純化病毒，采用bca法測(cè)定蛋白濃度后，放于-20℃保存?zhèn)溆谩?.動(dòng)物免疫程序?qū)⒓兓《居?0mmpbs緩沖液(ph7.2)稀釋至500μg/ml，與弗氏完全佐劑等體積混勻乳化，對(duì)4周齡balb/c雌性小鼠腹腔注射200μl，接種抗原量為50μg/只；3周后進(jìn)行二免，即將純化病毒(500μg/ml)與弗氏不完全佐劑等體積混勻乳化，取200μl腹腔注射小鼠；二免兩周后，采用二免方法重復(fù)免疫一次；融合細(xì)胞前3天，以200μl純化病毒(125μg/ml)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。3.克隆檢測(cè)方法的建立(1)摘取脾臟前，采集小鼠血樣以及未免疫小鼠的血樣，依次置于37℃、4℃孵育1h，7000g離心10min后，分別獲得陽性血清和陰性血清。(2)用50mm的碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稀釋純化病毒至10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml5個(gè)濃度，100μl/孔加入酶標(biāo)板，4℃包被過夜。次日棄去elisa板中液體，每孔加入洗滌液(即pbst溶液，配制方法如下：取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉3.54g、磷酸二氫鉀0.27g溶于800ml去離子水，調(diào)節(jié)ph至7.4，然后去離子水定容至1l，最后加入500μl吐溫-20。)250μl，室溫靜置3min后棄去洗滌液，重復(fù)洗滌三次。每孔加入200μl含1％bsa的pbst溶液(縮寫為1％bsa-pbst)，37℃封閉1h。棄去elisa板中液體，按上述方法洗滌3次。陽性血清為一抗，分別作l:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000稀釋，每孔加入100μl，同時(shí)設(shè)相同稀釋度的陰性血清為對(duì)照，37℃孵育lh后按上述方法洗滌3次。每孔加入用1％bsa-pbst以1:5000稀釋的hrp-羊抗鼠igg抗體(購自jacksonimmunoresearch，貨號(hào)為115-065-146)100μl，37℃孵育1h，按上述方法洗滌3次。每孔加入tmb底物顯色液a、b液(購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司)的等體積混合液100μl，37℃作用15min，每孔加入100μl終止液(2m的硫酸溶液)，在酶標(biāo)儀上讀取od450值。陽性血清孔的od450值設(shè)為p，陰性血清孔的od450值設(shè)為n，取p值接近1.0、p/n>2.0時(shí)的抗原包被濃度為最適工作濃度?？乖粷舛葹?.5μg/ml。4.細(xì)胞融合免疫鼠摘取脾臟研磨成單細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0按細(xì)胞數(shù)量之比5:1混合于50ml無菌離心管內(nèi)，采用50％聚乙二醇(peg1450)溶液融合后，將融合細(xì)胞采用含20％胎牛血清和2％hat(購自sigma)的dmem培養(yǎng)液進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。5.單克隆化及擴(kuò)大培養(yǎng)(1)融合細(xì)胞培養(yǎng)15d后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3d。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液100μl，用本實(shí)施例標(biāo)題3中(2)的間接elisa方法篩選分泌抗pedv單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，用sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液作陰性對(duì)照，陽性血清為陽性對(duì)照。對(duì)于檢測(cè)陽性的雜交瘤細(xì)胞，取100μl上清，采用2.5μg/ml的vero細(xì)胞裂解液替代純化病毒包被elisa板，重復(fù)上述檢測(cè)，保留檢測(cè)結(jié)果為陰性的雜交瘤細(xì)胞孔。(2)將步驟(1)中保留的雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化。具體操作如下：將培養(yǎng)孔中雜交瘤細(xì)胞集落吹起混勻，取20μl細(xì)胞懸液用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。取100個(gè)細(xì)胞，加入到10ml含20％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中，將此細(xì)胞懸液以每孔100μl加入到預(yù)先加入了飼養(yǎng)細(xì)胞(采用dmem灌洗小鼠腹腔收集的細(xì)胞)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。10d后，重復(fù)本實(shí)施例標(biāo)題3中(2)的間接elisa方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過2-3次克隆化操作，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽性率為100％時(shí)，即可確定已獲得分泌抗pedv單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。(3)將確定的分泌抗pedv單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株分別命名為6f10、6f12、10b2、10a3、10a4和12c4，采用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，分裝凍存于液氮。6.腹水制備分別采用雜交瘤細(xì)胞株6f10、6f12、10b2、10a3、10a4和12c4制備腹水。具體方法如下：取8～10周齡雌性balb/c小鼠，腹腔注射不完全弗氏佐劑0.5ml/只，7天后將狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株以pbs緩沖液重懸，以5×105個(gè)細(xì)胞/只腹腔注射小鼠。約10天后采集腹水，離心去除不溶雜質(zhì)，取腹水上清凍存于-70℃?zhèn)溆谩?.單克隆抗體純化將本實(shí)例標(biāo)題6中采用各雜交瘤細(xì)胞株制備的腹水，采用gehitraprproteinafastflow親和純化柱(購自ge生命科學(xué))純化各單克隆抗體。純化后的單克隆抗體采用10％sds-page電泳分析純度，對(duì)于純度>95％的收集樣品，用截留分子量為50kd的超濾管進(jìn)行濃縮，并將緩沖液置換為pbs緩沖液。雜交瘤細(xì)胞株6f10、6f12、10b2、10a3、10a4和12c4產(chǎn)生的抗pedv單克隆抗體依次命名為6f10’、6f12’、10b2’、10a3’、10a4’和12c4’。其中圖1顯示了單克隆抗體10a4’的純化結(jié)果，從圖中可以看出純化后的單克隆抗體10a4’的純度大于95％。8.單抗的特異性驗(yàn)證抗原板制備：取豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)、豬瘟病毒(csfv)、豬乙型腦炎病毒(jev)、豬細(xì)小病毒(ppv)、豬偽狂犬病毒(prv)、豬繁殖與呼吸綜合征(prrsv)、豬o型口蹄疫病毒(fmed)elisa抗體檢測(cè)試劑盒(均購自武漢科前生物股份有限公司)中的檢測(cè)板作為抗原板；按照本實(shí)例標(biāo)題1密度梯度離心法制備純化pedv和豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)，按照本實(shí)例標(biāo)題3中(2)的方法以5μg/ml制備抗原板。陰陽性對(duì)照的制備：未免疫任何抗原的小鼠血清用1％bsa-pbst以1:100稀釋后作為陰性對(duì)照；髙免小鼠血清(免疫相應(yīng)抗原4次及以上)用1％bsa-pbst以1:100稀釋后作為陽性對(duì)照。加入待檢樣本：將本實(shí)例標(biāo)題7中純化的單克隆抗體6f10’、6f12’、10b2’、10a3’、10a4’和12c4’用1％bsa-pbst稀釋到1μg/ml，以100μl/孔加入上述9種抗原板的反應(yīng)孔中，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陰陽性對(duì)照孔(分別加入陰、陽性對(duì)照)，37℃孵育1h；pbst緩沖液洗滌5次。加入酶標(biāo)二抗、顯色和終止：每孔加入100μl用1％bsa-pbst以1:5000稀釋的hrp-羊抗鼠igg抗體，37℃孵育1h；pbst緩沖液洗滌5次；每孔加入tmb底物顯色液a、b液等體積混合溶液100μl，37℃作用15min，每孔加入100μl終止液(2m的硫酸水溶液)，在酶標(biāo)儀上讀取od450值。判斷：如果病毒樣品反應(yīng)孔o(hù)d450值s/陰性對(duì)照孔o(hù)d450值n>2.1表明單克隆抗體與其他病毒有交叉反應(yīng)，否則沒有交叉反應(yīng)。結(jié)果：6f10’、6f12’、10b2’、10a3’、10a4’和12c4’與除pedv外的其他豬病病毒反應(yīng)后的od450值/陰性對(duì)照孔o(hù)d450值均小于2.1，表明這幾株單抗特異性針對(duì)pedv，與其他豬病病毒無交叉反應(yīng)。實(shí)例三檢測(cè)豬初乳中抗pedv特異性iga抗體的雙抗夾心elisa試劑盒的構(gòu)建1.捕獲抗體的選擇為了構(gòu)建雙抗夾心elisa試劑盒，以hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體為檢測(cè)抗體，從實(shí)施例二中制備的6株抗pedv單克隆抗體中篩選與檢測(cè)抗體配對(duì)最合適的捕獲抗體。各待檢奶樣在反應(yīng)前需要以6000g離心10min，取中間的乳清層。將從各奶樣分離的乳清加入酶標(biāo)板中與夾心抗原進(jìn)行反應(yīng)。具體方法如下：抗體包被：將實(shí)施例二標(biāo)題7中純化的6株抗pedv單克隆抗體分別用ph9.6、50mm的碳酸鹽緩沖液稀釋至8μg/ml，每孔加入100μl，在4℃包被16-18h，每個(gè)稀釋度重復(fù)兩孔；封閉：pbst緩沖液(pbst緩沖液配制方法：取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉3.54g、磷酸二氫鉀0.27g溶于800ml水，調(diào)節(jié)ph至7.4，然后定容至1l，最后加入500μl吐溫-20。洗板3次，每孔加入200μl含1％(w/v)bsa的pbst緩沖液(縮寫為1％bsa-pbst)于37℃封閉1h；夾心抗原孵育：用1％bsa-pbst將滅活后的pedvcv777株病毒液(實(shí)例一制備)稀釋至病毒含量為105.7tcid50/ml，每孔加入100μl，37℃孵育1h；pbst緩沖液洗滌5次。檢測(cè)奶樣孵育：將已知pedv陽性奶樣(經(jīng)tgev(豬傳染性胃腸炎病毒)和pedv二聯(lián)滅活苗分娩前2個(gè)月跟胎免疫一次、分娩前1個(gè)月加強(qiáng)免疫一次的母豬初乳)、陰性奶樣(未免疫任何pedv疫苗的spf級(jí)豬初乳)分離的乳清用1％bsa-pbst按照稀釋度為1:100稀釋，每孔加入100μl，37℃孵育30min；pbst緩沖液洗滌5次。采用1％bsa-pbst將hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體(購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司)按照稀釋度為1:10000稀釋，每孔加入100μl，37℃孵育30min；pbst緩沖液洗滌5次。每孔加入tmb底物顯色液a、b液的等體積混合溶液100μl，37℃避光顯色10min。每孔加入100μl、2m的硫酸水溶液終止反應(yīng)，測(cè)定各孔o(hù)d450值(在450nm處的吸光值)。根據(jù)各樣品od450值及之間差異的大小確定最佳捕獲抗體。由表1可知，抗pedv單克隆抗體10a4’作為捕獲抗體獲得的陽性值最高，陰性值較低，為最佳捕獲抗體。表1捕獲抗體種類選擇抗pedv單克隆抗體10a4’是由雜交瘤細(xì)胞株10a4分泌的，將該雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行保藏，保藏信息如下：分類命名：雜交瘤細(xì)胞株10a4，保藏日期為2017年5月17日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱cctcc，保藏單位地址：武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為：cctccno：c201779。2.捕獲抗體包被濃度的確定將抗pedv單克隆抗體10a4’用50mm的碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稀釋為8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，分別包被酶標(biāo)板，其他步驟同本實(shí)施例標(biāo)題1中方法，對(duì)已知pedv陰、陽性奶樣進(jìn)行雙抗夾心elisa實(shí)驗(yàn)，根據(jù)p/n值最大來確定抗體包被濃度。p為陽性奶樣的od450值，n為陰性奶樣的od450值。由表2可知，捕獲抗體的最佳包被濃度為2μg/ml。表2捕獲抗體包被濃度的確定3.夾心抗原工作濃度與乳清稀釋濃度的確定用1％bsa-pbst將夾心抗原(實(shí)例一制備的滅活后的pedvcv777株病毒液)梯度稀釋為106.6tcid50/ml、106.3tcid50/ml、106.0tcid50/ml、105.7tcid50/ml、105.4tcid50/ml。將已知pedv陽性奶樣和陰性奶樣分離乳清。將pedv陽性奶樣分離的乳清按照如下稀釋度進(jìn)行梯度稀釋：1:10、1:20、1:40、1:80、1:160，按本實(shí)施例標(biāo)題1中elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定各孔o(hù)d450值，陰性對(duì)照孔孔中加入陰性奶樣分離的乳清，其中捕獲抗體為10a4’，包被濃度為2μg/ml。根據(jù)陽性奶樣反應(yīng)孔o(hù)d450值(p)值和陰性對(duì)照孔o(hù)d450值(n)之比(即p/n)的最大值，確定夾心抗原工作濃度與乳清稀釋濃度。由表3可知，夾心抗原的工作濃度為106.0tcid50/ml，乳清稀釋度為1:40。表3夾心抗原工作濃度和奶樣稀釋度的確立(表中數(shù)據(jù)為od450值)注：p表示pedv陽性奶樣反應(yīng)孔o(hù)d450值；n表示陰性對(duì)照孔o(hù)d450值。4.檢測(cè)抗體最佳稀釋度的確定用1％bsa-pbst將hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體按照稀釋度為1:5000、1:10000、1:20000和1:40000進(jìn)行稀釋，按本實(shí)施例標(biāo)題3中確定的檢測(cè)條件對(duì)已知pedv陽性奶樣和陰性奶樣進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)p/n值的最大值來確定hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體最佳稀釋度。由表4可知，hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體最佳稀釋度為1:10000。表4hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體最佳稀釋度的確定檢測(cè)抗體稀釋度1：50001：100001：200001：40000p2.3022.2211.8521.323n0.1090.070.0640.048p/n21.131.728.927.65.判定標(biāo)準(zhǔn)的確定選擇未接種過任何pedv疫苗的spf豬的初乳50份，用本實(shí)施例標(biāo)題4確定的夾心elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定od450值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出奶樣平均od450值和標(biāo)準(zhǔn)差sd。根據(jù)公式：樣品的平均od450值+3×sd，計(jì)算其判定標(biāo)準(zhǔn)的臨界值。對(duì)50份spf豬初乳elisa檢測(cè)結(jié)果(表5)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出奶樣平均od450值為0.127，標(biāo)準(zhǔn)差sd為0.041，從而計(jì)算出臨界值＝樣品平均od450值+3sd＝0.250。因此，判定標(biāo)準(zhǔn)為樣品od450值≥0.250時(shí)為陽性，樣品od450值＜0.250為陰性。表5判斷標(biāo)準(zhǔn)確定6.夾心elisa檢測(cè)方法的特異性(1)分別使用pedv病毒液(病毒含量為106.0tcid50/ml)、vero細(xì)胞裂解液上清和封閉液1％bsa-pbst作為夾心抗原，采用本實(shí)施例標(biāo)題4確定的夾心elisa方法對(duì)已知pedv陽性和陰性奶樣進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。表6顯示：9份樣品與vero細(xì)胞裂解液上清或1％bsa-pbst反應(yīng)的od450值均勻小于0.2，而陽性樣品與pedv病毒液反應(yīng)的od450值均較高，陰性樣品反應(yīng)值均較低，說明該檢測(cè)方法的抗體特異性針對(duì)pedv而非宿主細(xì)胞vero細(xì)胞或者1％bsa-pbst。表6夾心法特異性1(2)選擇分別免疫過prrsv、ppv、prv、jev、pcv2、fmev、csfv疫苗但未免疫過pedv疫苗的母豬，采集初乳共7份，設(shè)置陰陽性對(duì)照，用本實(shí)施例標(biāo)題4確定的夾心elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證本方法與抗其他豬病病毒iga抗體的交叉反應(yīng)，確定本方法的對(duì)抗pedviga抗體的檢測(cè)特異性。由表7可知，7份初乳的檢測(cè)od450值均小于0.250，即為陰性，說明本方法測(cè)得的iga為抗pedv特異性iga。表7夾心法特異性2樣品編號(hào)606602490520726od450值0.1340.2390.1040.1620.173樣品編號(hào)622623陰性對(duì)照陽性對(duì)照od450值0.2250.1260.0932.3057.重復(fù)性試驗(yàn)(1)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)用同一批試劑盒對(duì)已知pedv陽性奶樣和陰性奶樣進(jìn)行檢測(cè)，每份奶樣設(shè)置5個(gè)重復(fù)，測(cè)定od450值，結(jié)果見表8。計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)cv＝(sd/od450平均值)×100％。由表8可知，各個(gè)樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為0.34％～4.49％，小于5％。表8批內(nèi)變異系數(shù)(2)批間重復(fù)試驗(yàn)取5個(gè)不同批次的試劑盒對(duì)已知pedv陽性奶樣和陰性奶樣進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定od450值，計(jì)算批間變異系數(shù)cv＝(sd/od450平均值)×100％。由表9可知，不同樣品的批間變異系數(shù)為1.90％～8.71％，小于10.00％，說明該方法有良好的重復(fù)性。表9批間變異系數(shù)8.檢測(cè)豬初乳中抗pedv特異性iga抗體的雙抗夾心elisa試劑盒的組成及使用方法檢測(cè)豬初乳中抗pedv特異性iga抗體的雙抗夾心elisa試劑盒由以下組份組成：(1)檢測(cè)板1塊：采用0.05m、ph9.6的碳酸鹽緩沖液將抗pedv單克隆抗體10a4’(實(shí)施例二中標(biāo)題7中方法制備)稀釋至2μg/ml，每孔加入100μl，在4℃條件下包被16-18h，采用pbst緩沖液(pbst緩沖液配制方法：取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉3.54g、磷酸二氫鉀0.27g溶于800ml水，調(diào)節(jié)ph至7.4，然后定容至1l，最后加入500μl吐溫-20。)洗滌，拍干；用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液(pbst緩沖液配制方法同上)在37℃條件下封閉1h，洗滌、干燥、真空封裝，得到檢測(cè)板。(2)pedv夾心抗原：是按照實(shí)例一中方法制備的滅活的pedvcv777株病毒液，其毒價(jià)為106.0tcid50/ml，體積為12ml。(3)酶標(biāo)二抗：將hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體(購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司)采用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液(pbst緩沖液配制方法同上)按照稀釋度為1:10000稀釋而成，體積為12ml。(4)陽性對(duì)照：選取免疫過(分娩前2個(gè)月跟胎免疫一次，分娩前1個(gè)月加強(qiáng)免疫一次)tgev和pedv二聯(lián)滅活苗的母豬，采集其初乳，以6000g離心10min，取乳清層，采用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液(配制方法同上)按照稀釋度為1:40稀釋，得到陽性對(duì)照，1管(1ml)。(5)陰性對(duì)照：采集未接種過任何pedv疫苗的spf級(jí)豬初乳，以6000g離心10min，取乳清層，用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液按照稀釋度為1:40稀釋，得到陰性對(duì)照，1管(1ml)。(6)樣品稀釋液：1％bsa-pbst(1瓶，50ml)，配制方法為：取10gbsa、0.27g磷酸二氫鉀、3.54g磷酸氫二鈉、8.0g氯化鈉、0.2g氯化鉀和1mltween20溶于水，然后加水定容至1000ml。(7)10×濃縮洗滌液(30ml)：取磷酸二氫鉀2.7g、磷酸氫二鈉35.4g、氯化鈉80g、氯化鉀2g和tween205ml溶于水，然后加水定容至1000ml。使用時(shí)，將10×濃縮洗滌液采用水稀釋10倍，得到洗滌液。(8)tmb底物顯色液a、b液：tmb底物顯色a液為h2o2工作液，tmb底物顯色b液為tmb工作液，各6ml；均購自于湖州英創(chuàng)生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)el0009)。(9)終止液(15ml)：2m的硫酸水溶液。上述試劑盒的使用方法如下：(1)檢測(cè)樣品的獲得與處理：將采集獲得的待測(cè)豬初乳以6000g離心10min，取乳清層，保存于-20℃，以便檢測(cè)；(2)夾心抗原孵育：在檢測(cè)板的每個(gè)孔中分別加入100μl的pedv夾心抗原，在37℃孵育1h，采用洗滌液洗滌5次；(3)加入待檢樣品、陰性對(duì)照或陽性對(duì)照：將處理后的待檢樣品用樣品稀釋液按照稀釋度為1:40進(jìn)行稀釋，每個(gè)待檢樣品反應(yīng)孔中加入100μl，37℃反應(yīng)30min，采用洗滌液洗滌5次；分別向陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔內(nèi)加入陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，其他步驟同待檢樣品反應(yīng)孔。(4)加入酶標(biāo)二抗：將酶標(biāo)二抗加入到檢測(cè)板的各孔中，每個(gè)孔100μl，37℃反應(yīng)30min，以洗滌液洗滌5次；(5)顯色與終止：將tmb底物顯色液a、b液等體積混合，每個(gè)孔中加入100μl混合液，37℃避光反應(yīng)10min，隨后每個(gè)孔加入100μl終止液，終止反應(yīng)；(6)判定：將終止反應(yīng)后的檢測(cè)板放入酶標(biāo)儀中，讀取od450值，按照如下方法判定結(jié)果：如果陰性對(duì)照孔的od450值<0.2、且陽性對(duì)照孔的od450值>0.8，那么當(dāng)待檢樣品反應(yīng)孔的od450值≥0.250為陽性，當(dāng)待檢樣品反應(yīng)孔的od450值＜0.250為陰性。上述操作過程中，每個(gè)孔是指反應(yīng)孔、陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔中的每個(gè)孔。另外，本實(shí)施例中，檢測(cè)前已知是pedv陽性的奶樣，均是指經(jīng)tgev(豬傳染性胃腸炎病毒)和pedv二聯(lián)滅活苗分娩前2個(gè)月跟胎免疫一次、分娩前1個(gè)月加強(qiáng)免疫一次的母豬初乳；檢測(cè)前已知為pedv陰性的奶樣是指未免疫任何pedv疫苗的spf級(jí)母豬初乳。實(shí)例四本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果與間接elisa法的比較本發(fā)明試劑盒為實(shí)施例三中制備的檢測(cè)豬初乳中pedv特異性iga抗體的雙抗夾心elisa試劑盒。比較本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果與間接elisa法檢測(cè)結(jié)果的差異。1.構(gòu)建檢測(cè)抗pedv特異性iga抗體的間接elisa法使用純化后的pedvcv777株病毒液(實(shí)例二標(biāo)題1中方法制備)作為包被原，按照常規(guī)方法構(gòu)建間接elisa法。間接elisa方法具體步驟如下：采用2.5μg/ml的包被原包被酶標(biāo)板，每孔100μl，在4℃條件下包被16-18h，采用pbst緩沖液(pbst緩沖液配制方法：取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉3.54g、磷酸二氫鉀0.27g溶于800ml水，調(diào)節(jié)ph至7.4，然后定容至1l，最后加入500μl吐溫-20。)洗滌，拍干；每孔加入100μl含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液(pbst緩沖液配制方法同上)，在37℃條件下封閉1h，洗滌、拍干。分離待檢初乳的乳清，采用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液按照稀釋度為1:40稀釋，每個(gè)待檢樣品反應(yīng)孔加入100μl，在37℃條件下孵育30min，pbst緩沖液洗滌、拍干，陰性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照，陽性對(duì)照孔中加入陽性對(duì)照，其他步驟同反應(yīng)孔，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照同實(shí)施例三中標(biāo)題8；加入采用含1％(質(zhì)量百分濃度)bsa的pbst緩沖液以1:10000(稀釋度)稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗豬iga抗體，每孔100μl，37℃孵育30min。將tmb顯色液a液和b液等體積混合后，每孔加入100μl混合液，在37℃顯色10min，隨后每個(gè)孔加入100μl終止液(2m的硫酸水溶液)，終止反應(yīng)。按照實(shí)例三標(biāo)題5的方法確定間elisa法的判斷標(biāo)準(zhǔn)。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：如果陰性對(duì)照孔的od450值<0.2、且陽性對(duì)照孔的od450值>0.8，那么當(dāng)待檢樣品反應(yīng)孔的od450值≥0.308為陽性，當(dāng)待檢樣品反應(yīng)孔的od450值<0.308為陰性。2.本發(fā)明試劑盒檢測(cè)方法與本實(shí)施例標(biāo)題1中間接elisa法的靈敏度比較選擇一份已知pedv陽性奶樣(經(jīng)tgev(豬傳染性胃腸炎病毒)和pedv二聯(lián)滅活苗分娩前2個(gè)月免疫一次，分娩前1個(gè)月加強(qiáng)免疫一次的母豬初乳)，取乳清進(jìn)行梯度稀釋，分別用本發(fā)明試劑盒和間接elisa法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度。表10顯示：陽性奶樣分離乳清的稀釋倍數(shù)為40960時(shí)，采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的結(jié)果仍判斷為陽性，而間接法只有稀釋倍數(shù)小于5120才能判斷為陽性，說明本發(fā)明試劑盒靈敏度顯著高于間接elisa法。表10本發(fā)明試劑盒與間接elisa法靈敏度比較3.本發(fā)明試劑盒與間接elisa法對(duì)樣品檢測(cè)差異性比較用本發(fā)明試劑盒和本實(shí)施例標(biāo)題1中間接elisa法分別對(duì)同一批已知pedv陽性、陰性奶樣進(jìn)行檢測(cè)，比較二者對(duì)不同奶樣檢測(cè)值之間的差異。其中，pedv陽性奶樣是經(jīng)tgev(豬傳染性胃腸炎病毒)和pedv二聯(lián)滅活苗免疫兩次的母豬初乳，陰性奶樣是未免疫任何pedv疫苗的spf級(jí)母豬初乳。由表11可知：與間接elisa法相比，本發(fā)明試劑盒對(duì)同一份陰性奶樣的檢測(cè)值更低，對(duì)同一份陽性奶樣的檢測(cè)值更高，陽性和陰性組之間差異更加明顯；間接elisa法檢測(cè)出兩份假陽性奶樣(12號(hào)和14號(hào)奶樣)及一份假陰性奶樣(10號(hào)奶樣)，本發(fā)明試劑盒未出現(xiàn)上述情況，說明本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)特異性更好。表11兩種方法對(duì)同一批奶樣測(cè)試差異性比較當(dāng)前第1頁12